全 文 ：Vol. 30 No.1
Mar. 2012
第 30卷 第 1期
2012年 3月
经 济 林 研 究
Nonwood Forest Research
收稿日期：2011-12-01
基金项目：国家自然科学基金面上项目 (30971975)。
作者简介：张丽杰 (1972—)，女，辽宁三河阜新人。副教授，博士研究生，主要从事林木种质资源与生物技术方面的研究工作。
E-mail：zhanglijie_106@sina.com。
通讯作者：董文轩 (1963—)，男，河北三河人。教授，博士，主要从事果树种质资源与遗传育种方面的研究工作。E-mail：wxdong63@126.com。
平 邑 甜 茶 Malus hupehensis (Pamp.) Rehd.
var pingyiensis Jiang是苹果属 Malus，为湖北海棠
Malus hupehensis Rehd.的一个变种，是典型的无
平邑甜茶基因组 DNA提取方法的比较
张丽杰，王玉霞，郜亚婷，董文轩
(沈阳农业大学 园艺学院，辽宁 沈阳 1101 61)
摘 要：为获得高质量的基因组 DNA，以平邑甜茶及其与扎矮山定子杂交所得四倍性矮生后代 33#、45#新鲜叶
片为试材，分别采用常规 CTAB法、改良的 CTAB法和基因组试剂盒法提取平邑甜茶总 DNA，进行琼脂糖凝胶
电泳，使用核酸蛋白仪对 DNA质量和纯度进行检测。结果表明：利用基因组试剂盒法、常规 CTAB法和改良
CTAB法均可获得 DNA，但获得的 DNA质量和纯度存在一定的差异。试剂盒法和 CTAB法可以获得较高质量
的 DNA。但由于基因组试剂盒法成本相对较高，改良 CTAB法较耗时，建议采用 常规 CTAB法提取平邑甜茶及
其杂交后代 33#、45#品种基因组 DNA。
关键词：平邑甜茶；叶片；基因组 DNA
中图分类号： S661.1 文献标志码： A 文章编号： 1003—8981(2012)01—0114—04
Comparison of extraction methods of genomic DNA
in Malus hupehensis Rehd.
ZHANG Li-jie, WANG Yu-xia, GAO Ya-ting, DONG Wen-xuan
(College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, Liaoning, China)
Abstract: To obtain high-quality genomic DNA, taking fresh leaves in Malus hupehensis Rehd. and nanous tetraploidy
hybrid offsprings 33# and 45# of it and M. baccata as experimental materials, total DNA in M. hupehensis was extracted
by using conventional CTAB method, modified CTAB method and genomic kit method, agarose gel electrophoresis
was doned, and quality and purity of DNA were detected by nucleic acid protein analyzer. The results showed that
DNA could be obtained by genomic kit method, conventional CTAB method and modifi ed CTAB method, but quality
and purity of DNA obtained existed some differences. higher quality DNA could be obtained by Kit method and CTAB
method. However, due to higher cost of genomic kit method and more time-consuming of modifi ed CTAB method, it was
recommended that genomic DNA in M. hupehensis, 33#，45# should be extracted by conventional CTAB method.
Key words: Malus hupehensis Rehd.; leaf; genomic DNA
融合生殖型三倍体植物；具有非常高的无融合生
殖能力，是无融合生殖型矮化砧木育种的重要母
本材料。在其与扎矮山定子 M. baccata的杂交后
DOI:10.14067/j.cnki.1003-8981.2012.01.020
115第 30卷 经 济 林 研 究
代中，绝大部分植株属于母本基因型的无融合生
殖后代，有性杂种后代只占 8%左右 [1]。通过对杂
种后代的倍性和无融合生殖特性等的研究，确定
了这些植株是四倍体植株，而且四倍性的来源是由
平邑甜茶的三倍性加上父本花粉的单倍性构成，此
外大 部分株系的无融合生殖能力在 70%以下，只
有 1/9左右的株系无融合生殖率在 80%以上 [2-3]。
为了深入研究无融合生殖发生的机理，笔者欲对无
融合生殖相关基因进行研究，提取平邑甜茶基因组
DNA，获得高质量的 DNA具有重要的意义。平邑
甜茶叶片组织内通常含有较多的蛋白质、多糖类、
多酚类及其它次生代谢物质，严重干扰 DNA的提
取。笔者选用常规 CTAB法、改良的 CTAB法和试
剂盒法这 3种方法提取平邑甜茶叶片的总 DNA，
以确定较理想的平邑甜茶叶片 DNA的提取方法，
为进一步开展平邑甜茶分子生物学研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
试验材料为沈阳农业大学果树种质资源圃中
平邑甜茶及其与扎矮山定子杂交所得四倍性矮生
后代 33#、45#的新鲜叶片。2010年 5月 7日，采
摘新鲜幼嫩的叶片，液氮速冻，并于 -70 ℃冰箱
中冷冻保存备用。
1.2 仪器与试剂
1.2.1 主要仪器
天平、离心机、冰箱、高速低温离心机、稳
压电泳仪、恒温水浴锅、凝胶成像系统、紫外分
光光度计等。
1.2.2 试 剂
(1)常规 CTAB法所用试剂 液氮、2%CTAB
提取缓冲液 (1 mol/L Tris-HC1，pH8.0；5 mol/L
NaCl；0.5 mol/L EDTA，pH8.0；2%的巯基乙醇 )，
3 mol/L NaAc(pH5.2)，氯仿 /异戊醇 (24 ︰ 1)、
无水乙醇、TE缓冲液、RNA酶。
(2) 改良 CTAB法所用试剂 液氮、2%CTAB
提取缓冲液、Tris平衡酚、氯仿 /异戊醇(24︰ 1)、
异丙醇、5 mol/L NaCl、70%乙醇、3 mol/L乙酸钠、
无水乙醇、RNA酶、TE缓冲液。
1.3 方 法
1.3.1 常规 CTAB法提取 DNA
取新鲜植物叶片 (0.05～ 0.10 g)在液氮中研
碎，然后迅速移入 1.5 mL离心管中。加入 500 μL
预热的 2%CTAB提取缓冲液，于 65 ℃保温 30～
60 min，期间颠倒几次。加入 500 μL的氯仿 /异
戊醇 (24︰ 1)，轻轻颠倒若干次。10 000 r/min离心
10 min。取上清 (约400 μL)移入新的1.5 mL离心管，
再加入等体积的氯仿 / 异戊醇 (24 ︰ 1)，轻轻
颠倒若干次，10 000 r/min 离心 5 min。取上
清(约 240 μL)，加入 2 倍体积冰冷的无水乙醇
(-20 ℃ )颠倒混匀，静置 30 min；然后 10 000 r/min离
心 10 min；弃上清，加入 350 μL TE，当大部分沉
淀溶解后，10 000 r/min 离心 10 min。将上清
( 约 300 μL)转移到新的 1.5 mL离心管中，加入
1 μL RNase (10 g/L)，轻轻混匀后瞬时离心，在 37 ℃
水浴 1 h。冷却至室温，加入 1/10体积 3 mo1/L的
NaAc (pH5.2)，混匀后再加入 2倍体积冰冷的无
水乙醇 (-20 ℃ )，颠倒混匀 ,静置 30 min。然后
10 000 r/min离心 10 min。弃上清，用 70%乙醇洗
涤 DNA沉淀 2次，每次洗涤后都要离心。在超净
工作台上风干 DNA。加入 30 μL TE溶解 DNA，
然后于冰箱中保存。
1.3.2 改良 CTAB法提取 DNA
取平邑甜茶新鲜叶片约 0.1 g，加入液氮迅速
研磨成粉末状，分装到 1.5 mL的离心管中；加入
600 μL预热的 2%CTAB提取液和 2 μL的巯基乙
醇混匀，65 ℃水浴 30～ 60 min，期间颠倒若干次；
5 000 r/min离心 10 min，取上清液 (约 400 μL)，
加入 600 μL的 Tris平衡酚充分混匀，10 000 r/min
离心 10 min，取上清液 ( 约 200 μL)；加 600 μL
氯仿 /异戊醇 (24︰ 1) 混匀，10 000 r/min离心
10 min，重复抽提 1次；加入 1/5体积 5 mol/L的
NaCl混匀后再加 2/3体积的异丙醇(-20 ℃)混匀，
静置 30 min沉淀 DNA；10 000 r/min离心 5 min弃
上清，用 70%乙醇洗涤 2次 DNA，加适量 TE(约
300 μL)溶解后，加 1 μLRNA酶(10 g/L)，37 ℃水浴
1h；加入等体积的 Tris平衡酚混匀，10 000 r/min
离心 10 min。取上清，加入 600 μL氯仿 /异戊醇
(24︰ 1) 混匀，10 000 r/min离心 10 min，重复抽
提 1次。加入 1/10浓度 3 mol/L的 NaAc混匀后加
2倍体积的无水乙醇 (-20 ℃ )，静置 30 min沉淀
DNA，10 000 r/min离心 5 min，弃上清，用 70%
乙醇洗涤 2次 ( 每次都要离心 )；加 30 μL TE溶
116 第 1期张丽杰，等：平邑甜茶基因组 DNA提取方法的比较
解后，-20 ℃冰箱中保存备用。
1.3.3 基因组试剂盒法 (DNAsecure Plant Kit)提
取 DNA
按照试剂盒说明书进行。
1.4 DNA质量和纯度检测
1.4.1 DNA浓度和纯度检测
取适量 DNA溶液在紫外分光光度计下测定波
长260和280 nm时的吸光值，以A260估算样品得率，
计算 OD260/280比值，根据比值判断 DNA样品的大
致纯度。
1.4.2 提取 DNA质量检测
取 3 μL DNA 溶液，加溴酚蓝点样液，在
0.8%的琼脂糖凝胶电泳缓冲液下电泳，然后在紫
外凝胶成像系统下成像观察。检测所得 DNA的大
致相对分子质量。
2 结果与分析
2.1 3种方法提取基因组 DNA的电泳检测
分别将采用 3种不同方法提取所得的平邑甜
茶新鲜叶片基因组 DNA在 0.8%的琼脂糖凝胶上
进行检测，将得到的图像进行比较，对于相同条
件下的试验材料，常规 CTAB法提取的 DNA没有
明显的弥散带，而改良 CTAB法提取的 DNA主
带有的清晰，有的模糊。基因组试剂盒法提取的
DNA质量好，没有拖带，点样孔干净，说明试剂
盒法和常规 CTAB法均能够更好地去除平邑甜茶
叶片中的多糖、酚类物质、蛋白质以及RNA等杂质，
获得纯度较高的 DNA样品 (见图 1A、B、C)。
泳道 1：平邑甜茶；泳道 2：33#；泳道 3：45#。A：常规 CTAB法；B：改良 CTAB法；C：基因组试剂盒法。
1：Malus hupehensis；2：33#；3：45#. A：Conventional CTAB method；B：Improved CTAB method；C：Genomic kit method.
图 1 3种方法提取基因组 DNA的效果
Fig. 1 Effect of three kinds of methods for extracting genomic DNA
1 2 3 1 2 3 1 2 3
从各种提取方法所需的费用看，试剂盒法所
需的费用是 3种方法中最高的。改良CTAB法次之，
常规 CTAB法既可获得较高质量的 DNA，同时成
本较低。但这 3种提取方法所获得的 DNA均可用
于分子生物学方面的研究。
2.2 紫外分光光度计测定的吸光值分析
分别将不同方法提取的平邑甜茶 DNA样品在
紫外分光光度计下测量波长为 260和 280 nm时的
吸光值然后进行分析比较，结果见表 1。由表 1可
以看出，试剂盒法提取平邑甜茶叶片基因组 DNA
提取率最高，常规 CTAB法次之，改良的 CTAB
法得率最低。从 A260/A280的比值看，试剂盒法和
常规 CTAB法比值都在 1.8 ～ 2.0之间，而改良
CTAB法获得的 DNA的纯度较低。
表 1 3种方法提取样品吸光值的比较
Table 1 Comparison of absorption values of samples
extracted by the three methods
测定方法
Determination method
不同波长下的吸光值
Absorption values under
different wavelengths
OD260 OD260/280
常规 CTAB法
Conventional CTAB method
0.229 3 1.816 3
0.077 8 1.879 1
0.022 3 1.848 6
改良 CTAB法
Modifi ed CTAB method
0.096 2 1.761 9
0.087 5 1.778 2
0.076 3 1.780 5
试剂盒法
Kit method
0.148 4 1.843 0
0.108 1 1.924 0
0.168 7 1.894 4
A B C
117第 30卷 经 济 林 研 究
3 结论与讨论
基因组 DNA的质量好坏决定着分子生物学试
验下一步工作的成败。近年来有关基因组 DNA的
提取方法已有许多文献报道 [4-5]。但是由于不同植
物及同一植物不同组织的结构及生理生化成分各
不相同，如有些植物含有多糖、多酚类物质等，
导致不同提取方法在 DNA的得率和质量上也会存
在一定的差异 [6]。因此，在试验过程中，应该根
据不同的材料及材料组织结构和生化成分，选取
适合的 DNA提取方法。在本次试验中，平邑甜茶
是一种富含多酚、多糖类物质的植物，由于多糖
和多酚物质的干扰，平邑甜茶 DNA提取较其它植
物 DNA的提取难度大。从本试验结果看，采用常
规 CTAB、改良 CTAB法和试剂盒法提取平邑甜
茶新鲜叶片的基因组 DNA，虽然都能提取出 DNA
样品，但是在质量上有一定差别。常规 CTAB法
提取平邑甜茶新鲜叶片 DNA更适合。但从所需费
用和提取方法所需的时间来看，改良 CTAB法耗
时最长，试剂盒法最为简便且需时少，但是成本高，
而常规 CTAB法在二者之间。因此，为适当减少
提取时间及降低成本，建议采用常规 CTAB法提
取基因组 DNA。
参考文献：
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[本文编校：闻 丽 ]