全 文 ： 收稿日期：2009-11-04
基金项目：福建省自然科学基金（X0650022）资助
作者简介：陈移亮（1971-），男，福建德化人，助理研究员，从事植物蛋白质组学研究。

蝴蝶兰叶片蛋白质双向电泳方法初探
陈移亮
(福建省亚热带植物研究所，福建省亚热带植物生理生化公共实验室，福建 厦门 361006)

摘 要：针对蝴蝶兰叶片蛋白质含量少且含有大量色素和酚等干扰物质的特点，通过对总蛋白提取方法、银
染方法的改进，以及双向电泳实验条件的比较选择，初步建立一套适用于蝴蝶兰叶片蛋白质组分析的双向电
泳技术。
关键词：蛋白质组；双向电泳；蝴蝶兰
Doi: 10.3969/j.issn.1009-7791.2010.01.010
中图分类号：S682.31; Q503 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2010)01-0040-05

Preliminary Studies on Two-dimensional Electrophoresis for Proteome of
Phalaenopsis Leaves
CHEN Yi-liang
(Fujian Key Laboratory of Physiology and Biochemistry for Subtropical Plant, Fujian Institute of Subtropical Botany, Xiamen
361006, Fujian China)

Abstract: Phalaenopsis leaves keep less protein and more non-protein substances like pigment,
phenol and so on. To minimize the interference by non-protein substances, a 2-DE (two-dimensional
electrophoresis) method which suited for the separation of protein from Phalaenopsis leaves was
established in this experiment, on the basis of the total-protein extraction method and the silver
dyeing method were modified and improved and the influential factors of 2-DE were compared and
selected.
Key words: proteome; two-dimensional electrophoresis; Phalaenopsis

蝴蝶兰(Phalaenopsis)为兰科盆栽观花植物，其花形别致如蝶，花色艳丽丰富，花期较长，现已成
为兰科植物中栽培最广泛、最普及的种类之一，具有较大的经济价值和社会价值。目前，对蝴蝶兰的
生理生化研究已有诸多报道[1-3]，但尚未在蛋白质组方面开展研究。双向电泳的基本原理是根据蛋白质
的等电点(pI)和分子量(Mw)大小不同，进行两次方向不同的电泳将其分离。双向电泳目前已成为蛋白
质组学研究中广泛应用的蛋白质分离技术。蝴蝶兰叶片肥厚多汁，蛋白含量相对较少，而且一些次生
代谢产物，如色素、酚、醌等含量较多，干扰 IEF、SDS-PAGE 及凝胶染色，因此，建立蝴蝶兰叶片蛋
白质双向电泳的方法有一定难度。本文采用 IPG 等电聚焦为第一向，垂直 SDS-PAGE 为第二向，建立
了适用于蝴蝶兰叶片蛋白质组分离的双向电泳技术，为开展蝴蝶兰蛋白质组学研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 设备
Sartorius 低温高速离心机，购自 Sigma 公司；超低温冰箱，购自 Thermo 公司；Protean 等电聚焦
仪、灌胶模具、Mini-Protean 垂直电泳仪、Power-Pac 电源、GS-800 光密度计，购自 Bio-Rad 公司。

2010,39(1):40-44.
Subtropical Plant Science
第 1 期 陈移亮：蝴蝶兰叶片蛋白质双向电泳方法初探 ﹒41﹒
1.2 试剂和材料
7 cm IPG 预制胶条 pH 4～7 线性、pH 3～10 线性二种，封胶液购自 Bio-Rad 公司；Pharmalyte 3-10
载体两性电解质购自 GE 公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、二硫苏糖醇(DTT)、尿素、SDS 购自 Amresco
公司；碘乙酰胺、AgNO3 购自 Sigma 公司；Triton X-100、Tris、甘油、四甲基乙二胺(TEMED)、溴酚
蓝购自 Pharmacia 公司；CHAPS 购自 Solarbio 公司。过硫酸铵、蔗糖为国产分析纯试剂。牛血清白蛋
白(BSA)为国产生物技术纯试剂。
1.3 蛋白提取
以蝴蝶兰组培苗叶片为材料。称取 2.0 g 叶片，与研杵、研钵及样品沉淀液[10% 三氯乙酸，0.07%
(V/V) β-巯基乙醇，丙酮溶液]一起在－70 ℃低温预冷；冰浴下将叶片捣碎，期间不时往研钵内加入液
氮，直到叶片完全研磨成粉末；加入约 5 ml 样品沉淀液，研磨至匀浆；加入样品沉淀液混合均匀，最
终体积为 15 ml，将悬浊液转移至离心管，－20 ℃放置 1 h 以上。4 ℃、20 000 g 离心 20 min，弃上清；
加入样品清洗液[0.07% (V/V) β-巯基乙醇，丙酮溶液，－20 ℃预冷]，将沉淀搅散，－20 ℃放置 1 h 后
转 4 ℃、20 000 g 离心 20 min，弃上清，重复此清洗—离心步骤直至液相呈无色。最后得到的沉淀在
－20 ℃下风干为干粉，－20 ℃保存备用。
准确称取蛋白质干粉，以 1 mg 干粉/25 μl 裂解液的比例加入蛋白裂解液 III[7 mol/L 尿素，2 mol/L
硫脲，6% (V/V) Triton X-100，2% (V/V) 载体两性电解质，65 mmol/L DTT，临时新鲜配制]，涡旋，
26 ℃放置 3 h，26 ℃、25 000 g 离心 20 min，所得上清液测定浓度[4]后用溶胀液[8 mol/L 尿素，2% Triton
X-100，0.4%(V/V)载体两性电解质，65 mmol/L DTT，临时新鲜配制]稀释到加样所需浓度即成蛋白样
品溶液。
1.4 双向电泳
等电聚焦的方法参照 Bio-Rad 指南并略作修改。等电聚焦的参数见表 1，其中步骤 5 为维持步骤，
可随时停止。
聚焦后，将胶条先后在平衡液 I（0.375 mol/L
Tris-HC1 pH 8.8、尿素 6 mol/L、20%甘油、2%SDS，
65 mmol/L DTT，临时新鲜配制）和平衡液 II（0.375
mol/L Tris-HC1 pH 8.8、尿素 6 mol/L、20%甘油、
2% SDS，0.1 mol/L 碘乙酰胺，临时新鲜配制）中
平衡 10 min，然后把胶条放入预先准备好的电极缓
冲液中荡一下，洗去胶条上多余的平衡液。
将封胶液融化并注入分离胶上的空间，将胶条推入封胶液中并使其沉至凝胶顶部(注意胶条与凝胶
间不能有气泡)。恒压 200 V 下进行电泳 45 min。均匀胶、梯度胶的配制和第二向 SDS-PAGE 步骤均参
照 Simpson[5]的方法。
1.5 染色与图谱分析
银染参照 Yan 等[6]的方法，稍作改动：第二向电泳结束后，将夹心玻璃板放入去离子水中取胶，
取出的凝胶放在固定液（40%乙醇，10%乙酸）中固定 16 h。余下步骤按照原方法。考马斯亮蓝染色参
照 Simpson[5]的方法。
光密度计扫描凝胶，用 PDQuest 软件对图像进行分析。
2 结果与讨论
2.1 样品制备
样品的预处理是 2-DE 成功与否的关键。植物叶片含有大量的色素、酚类、醌类等次生代谢物质，
如果样品处理不当，这些物质将会干扰第一向 IEF。因此，在植物蛋白质组分析中，首选的方法还是用
TCA 丙酮溶液沉淀蛋白，然后再用裂解液溶解蛋白。该法优点是可除去色素等物质，简单易行。本文
表 1 IEF 参数
步骤[h1] 电压 梯度 时间
重泡胀 16 h
步骤 1 250 V 线性 30 min
步骤 2 500 V 快速 30 min
步骤 3 4000 V 线性 3 h
步骤 4 4000 V 快速 10 000 V-h
步骤 5 500 V 快速 任意时间
注：20 ℃，每根胶条最高电流 50 μA， IPG 胶条长 7 cm。
第 39 卷 ﹒42﹒
对此方法进行改进，主要对预处理时的低温进行调节：将叶片、研杵、研钵、样品沉淀液在－70 ℃低
温预冷 8 h 以上。其中，研钵置于盛水的开口容器中，水位在研钵高度的 2/3 处，使预冷后的研钵外壁
冻结在冰中，－70 ℃形成的冰浴更有利于研磨时所需的低温。研磨时，不时加液氮以冷却研杵与材料，
同时，实验者应戴上皮手套，可有效防止手温传导至研杵。如此处理能有效提高蛋白质的提取效率。
蝴蝶兰叶片中蛋白质含量较少，2 g 叶片通过 TCA 丙酮溶液沉淀法制得的干粉只有 30～40 mg ，其蛋
白浓度大约为 3 mg/ml，溶解蛋白质和离心温度都设定为 26 ℃，因为含有尿素的溶液在温度高于 30 ℃
以上可产生异氰酸盐，使蛋白质的氨基甲酰化并使它发生等电点的改变，从而产生假点[7]。
2.2 等电聚焦 IPG 胶条 pH 范围的选择
使用 2 种 7 cm 的 IPG（分别是 pH 4～7 线性、pH 3～10 线性）胶条，使用裂解液 III（7 mol/L 尿
素，2 mol/L 硫脲，6% Triton X-100，65 mmol/L DTT，2%Pharmalyte）溶解蛋白，上样量为 45 μl 蛋白
提取液，大部分蛋白点集中于 pH 4～7 范围，而在碱性端检测到的蛋白较少(图 1)。pH 4～7 的胶条提
高了酸性蛋白在凝胶上的分辨率，蛋白点的分布较为均匀，且多数蛋白点呈圆形，边界清晰；而 pH 3～
10 胶条走出的蛋白点由于过于拥挤而呈雨点状。因此，在 7 cm 胶条的情况下，分离蝴蝶兰叶片蛋白质
时应采用 pH 4～7 的胶条。












2.3 第二向电泳的凝胶浓度和梯度
图 2 表明，当第二向电泳使用 10%～15%梯度胶时，蛋白点的分布较为均匀；使用 12%的分离胶，
图像上的蛋白点大部分集中于下方，且有部分走在最前沿的低分子量蛋白挤成一条线而被丢失；而使
用 10%～20%梯度胶，蛋白点又大部分集中于图谱上部。因此，10%～15%梯度胶是第二向电泳的较佳
选择。








图 2 不同浓度、梯度的第二向凝胶对蛋白质 2-DE 图谱的影响
注：(a)12%T 分离胶; (b)10%～20%梯度胶; (c)10%～15%梯度胶。
2.4 裂解液成分变化对蛋白质双向电泳的影响
采用 pH 4～7 的 IPG 线性胶条探讨裂解液成分变化对蝴蝶兰叶片蛋白质双向电泳结果的影响，分
图 1 不同 pH 梯度 IPG 胶条对蛋白质 2-DE 图谱的影响
(a) pH 4～7 线性；(b) pH 3～10 线性
第 1 期 陈移亮：蝴蝶兰叶片蛋白质双向电泳方法初探 ﹒43﹒
别用裂解液 I（8 mol/L 尿素，6% Triton X-100，65 mmol/L DTT ，2%Pharmalyte），裂解液 II（8 mol/L
尿素，4% CHAPS，65 mmol/L DTT ，2%Pharmalyte），裂解液 III（7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，6%Triton
X-100，65 mmol/L DTT，2%Pharmalyte），裂解液 IV（7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，4% CHAPS，65 mmol/L
DTT，2%Pharmalyte）来提取同一批干粉中的蛋白质，保持加样量相同，同时进行等电聚焦，对各个
蛋白提取液进行双向电泳并比较其图谱(图 3)。从图中可以看出，裂解液成分的不同使双向电泳图谱效
果存在较大差别。当裂解液中不含硫脲时，得到的蛋白点虽然较为清晰，但点数较少，其中使用裂解
液 I 所得双向电泳图谱的蛋白点仅约 406 个(图 3a)，使用裂解液 II 所得图谱的蛋白点约有 483 个(图 3b)，
可见在没有硫脲的情况下，使用去
垢剂 CHAPS 比用 Triton X-100 有更
好的效果。当裂解中加入硫脲时，
蛋白质的分离效果得到明显改善，
得到的蛋白点明显增多。这可能是
硫脲能促使更多的膜蛋白溶解，从
而导致可检出的蛋白点增多。其中
使用裂解液 III 所得图谱的蛋白点约
有 648 个，一些弱的蛋白点的信号
也明显增强，低丰度蛋白清晰地分
离、显现出来，凝胶图上的多数蛋
白点呈圆形，边界清晰，比较少扩
散及拖尾现象，且分布较均匀(图
3c)。使用裂解液 IV 所得图谱也可得
到较多的蛋白点（图 3d），约有 700
个，不过从图谱的质量上来看，其
横纹和纵纹都比图 3c 多。可见在使
用硫脲的情况下，使用去垢剂 Triton
X-100 比用 CHAPS 有更好的图谱效
果，虽然蛋白点较后者略少。
2.5 染色方法对结果的影响
对蝴蝶兰叶片双向电泳后的凝胶进行考染，不能显示大多数蛋白质点（图 4）。原因可能是蝴蝶兰
叶片肥厚多汁，蛋白含量相对较少。
传统的银染方法灵敏度高，但与质谱不兼容。Yan 等的方法相对简单易行，且与质谱检测兼容[6]，
但其灵敏度较其他银染方法低。本文将固定时间由原方法的 2 × 15 min 延长至 16 h ，在 4 mm 宽的泳
道上有 3 ng 的检出度，灵敏度提高了 6 倍以上（图 5）。
图 3 不同成分裂解液制备样品形成的双向电泳图谱
(a) 裂解液 I；(b) 裂解液 II；(c)裂解液 III；(d)裂解液 IV
图 4 考染方法得到的蝴蝶兰叶片
蛋白质 2-DE 图谱
图 5 银染方法灵敏度比较
注：用不同浓度 BSA 进行 SDS-PAGE 电泳，然后对凝胶进行银染。各泳道上 BSA 含量
分别为（a）10ng, 20ng, 30ng, 40ng, 50ng；（b）2ng, 3ng, 4ng, 5ng, 6ng, 8ng .
第 39 卷 ﹒44﹒
3 结 论
通过对双向电泳各个环节条件的比较选择，蝴蝶兰叶片蛋白
质双向电泳选用 pH 4～7 的 IPG 胶条可以得到较好的分离效果。
裂解液中含 7 mmol/L 尿素、2 mmol/L 硫脲、6% Triton X-100、
2%两性电解质载体、65 mmol／L DTT，提取总蛋白时每 1 mg
干粉加入 25 μl 裂解液，蛋白提取液上样体积为 45 μl；第二向电
泳使用 10%～15%梯度胶，使用改进的去除戊二醛的银染方法。
此为蝴蝶兰叶片蛋白质双向电泳的较佳方案，其电泳图谱见图 6。
图谱上蛋白点数量约 648 个，图像清晰，蛋白点的拖尾现象明显
减少。
另外，同一批次处理的蝴蝶兰叶片蛋白质样品，其 2-DE 图谱具有较好的重复性，而不同批次的样
品重现性就比较差。比如图 1a 和图 3c 就是在相同实验条件下不同批次样品所得到的效果。若要对双
向电泳进行深入应用研究，这是个必须解决的问题。目前所能做到的是，保证要分析的若干样品同时
进行样品处理，使用相同的试剂，同时做等电聚焦，在条件允许下同时做第二向电泳，这样就可提高
差异蛋白的可比性。
致 谢： 福建省亚热带植物研究所张文惠博士为本试验提供蝴蝶兰材料，谨致谢忱!
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图 6 在各适宜条件下所得蝴蝶兰
叶片蛋白质的 2-DE 图谱