全 文 ：蝴蝶兰转绿色荧光基因研究
伦 君1，张元国2* ，徐香梅1，王林武2，杨晓东2
(1．山东省潍坊市园林管理处，山东潍坊 261041;2．山东省潍坊市农业科学院，山东潍坊 261061)
摘要 ［目的］研究蝴蝶兰转绿色荧光基因 GFP导入技术。［方法］利用农杆菌菌株 GV3101(质粒 pBI121)，对绿色荧光蛋白基因 GFP
导入技术进行了研究。［结果］在 20． 0 mg /L卡那霉素(Kan)选择培养基上获得了蝴蝶兰原球茎分化和生根的健壮植株 129株。经 PCR
检测，其中 59株是转基因植株。［结论］该研究为蝴蝶兰分子育种提供了参考。
关键词 蝴蝶兰;花梗腋芽;组织培养;转基因
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)11 －06343 －02
Studies on Transformation of GFP Gene in Butterfly Orchids
LUN Jun et al (Weifang Gardens Management Office of Shandong Province，Weifang，Shandong 261041)
Abstract ［Objective］The aim was to study the transformation technique of GFP gene in butterfly orchids． ［Method］ The transformation
technique of GFP gene was studied by Agribacterium tumefaciens GV3101 with the plasmid PBI121． ［Result］129 vigorous plants with origi-
nal corm differentiation and rooting were regenerated on the selection medium containing 20． 0 mg /L kanamycin，among them 59 plants be-
longed to transgenic plants． ［Conclusion］The research provides reference for the molecular breeding of butterfly orchids．
Key words Butterfly orchids;Pedicle axillary bud;Tissue culture;Transgenic plants
基金项目 山东省潍坊市科技攻关项目(2001ns36)。
作者简介 伦君(1969 －) ，女，山东寿光人，农艺师，从事花卉组织培养
研究。* 通讯作者，研究员，硕士，从事组织培养与育种研
究，E-mail:zyg66205@ 163． com。
收稿日期 2011-01-10
基因工程［1］在蝴蝶兰育种上的应用在国内还是空白。
可用于导入蝴蝶兰的基因很多，如绿色荧光基因、花色基因、
抗病基因等。对蝴蝶兰组培快繁技术的优化［2 －3］可为基因
导入［4］蝴蝶兰提供可靠的技术支撑。利用分子生物技术可
将外来基因导入植物体中以期达到改良性状、提高品质及产
量的目的［5］。基于此，笔者利用农杆菌菌株 GV3101(质粒
pBI121) ，对绿色荧光蛋白基因 GFP导入技术进行了研究，以
建立一种高效、稳定的基因导入方式，为蝴蝶兰分子育种提
供参考。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 供试植物。蝴蝶兰(Phalaenopsis hybrid)优良抽箭植
株，由山东省潍坊市林业局花卉中心提供，在山东省潍坊市
农业科学院示范园全天候玻璃温室栽培。
1． 1． 2 菌株与质粒。供试菌株为农杆菌 GV3101，表达载体
质粒为 pBI121，大小为 13． 6 kb，用 BamH I和 Sac I双酶切，
切下约 1． 9 kb的 GUS 报告基因片段。GFP(绿色荧光蛋白
基因)［6］约 780 bp，用 BamH I和 Sac I双酶切，然后连接到酶
切好的表达载体上。质粒携带目的基因 GFP 和选择基因
NPTⅡ，其中 GFP基因插入到 BamH I和 Sac I 之间(图 1)。
1． 2 方法
1． 2． 1 农杆菌培养。培养条件:50 ml YEP培养基 + 250 μl
Rif(10 mg /ml)+ 50 μl Kan(50 mg /ml)+ 50 μl Gen(25
mg /ml) ，pH7． 0。挑取 GV3101 单菌落，接入 YEP培养基，28
℃过夜避光，200 r /min振荡培养 22 h，达到对数生长期后期
OD600≈0． 5。
1． 2． 2 农杆菌预培养。农杆菌培养后期加入 4 mg /L乙酰丁
香酮(AS)20 μl，pH调整为 5． 4，28 ℃培养 4 h。
图 1 质粒结构
Fig． 1 Plasmid structure
1． 2． 3 农杆菌侵染外植体。将菌液倒入无菌离心管中，在
4 000 r /min、18 ℃条件下平衡离心 10 min。弃去上清液，倒
入渗透缓冲液，充分混匀后，将蝴蝶兰原球茎状体放入菌液
30 min。外植体采用 2种处理方法:一种是不处理，即不损伤
原球茎接种的原球茎状体(PLB)数为 612 个;另一种是针刺
损伤，接种的 PLB 数为 631 个。2 种处理的 AS 预培养时间
均为 4 h，共培养时间均为 5 d。
1． 2． 4 共培养。原球茎状体经农杆菌侵染后，用滤纸吸干以
除去过量菌体，然后转移到原球茎状体增殖培养基:MS +
20． 0 g /L蔗糖 + 3． 5 g /L 琼脂粉 + 1． 5 g /L 活性炭 + 5． 0
mg /L 6-BA +0． 5 mg /L NAA，pH5． 4，共培养 5 d。
1． 2． 5 选择培养。经过初步筛选，选定 20 mg /L 卡那霉素
(Kan)为选择压。选择培养基:MS + 3． 0 mg /L 6-BA + 0． 2
mg /L NAA +20． 0 g /L蔗糖 +3． 5 g /L琼脂粉 +1． 5 g /L活性
炭 +20． 0 mg /L Kan +500． 0 mg /L Carb，pH5． 4。
1． 2． 6 CTAB法微量提取叶片 DNA。取转化蝴蝶兰植株的
幼嫩叶片 10 ～20 mg，置于 1． 5 ml Eppendorf管中，加入液氮，
研成细粉;加入 400 μl 65 ℃预热的 CTAB溶液，剧烈振荡 10
s，混匀，65 ℃温育 1 h;加 400 μl氯仿(氯仿∶异戊醇 = 24∶1) ，
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(11):6343 － 6344 责任编辑 乔利利 责任校对 卢瑶
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.11.213
振荡，10 000 r /min离心 5 min;取 200 μl上清，加入 200 μl异
丙醇，－20 ℃放置 15 min;10 000 r /min离心 10 min，弃上清，
用 70%乙醇和 100%乙醇各洗涤 1 次。待乙醇挥发干净后，
加入 45 μl无菌水溶解，用作 PCR模板。
1． 2． 7 转化植株的 PCR检测。PCR扩增的引物序列:NptI-
IF，5-AACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGG-3;NptI-
IR，5-GAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGAT-3。PCR
反应体系(25． 00 μl体系)为:10 × PCR反应缓冲液 2． 50 μl，
MgCl2(25． 0 mmol /L)1． 00 μl，上、下游引物(12． 5 mmol /L)各
1． 00 μl，dNTP(2． 5 mmol /L)2． 05 μl，Taq DNA 聚合酶(5
U /μl)0． 50 μl，DNA 模板 0． 20 μl，无菌双蒸水 16． 80 μl。
hptII基因片段的扩增循环参数:94 ℃变性 5． 0 min;94 ℃变
性 1． 0 min，55 ℃退火 1． 0 min，72 ℃延伸 1． 5 min，72 ℃延伸
5． 0 min，共 30个循环;4 ℃保存。
PCR产物采用 0． 8%琼脂糖凝胶电泳进行分析。按 5
V /cm稳压电泳，染色并检测。
2 结果与分析
2． 1 农杆菌接种外植体 从表 1 可知，外植体针刺损伤处
理对农杆菌侵染外植体的遗传转化率有较大影响，其中针刺
损伤处理遗传转化率达到 1． 7%，而不进行针刺处理只
有 0． 7%。
表 1 外植体针刺处理对遗传转化的影响
Table 1 Effect of the acupuncture treatment of explants on genetic
transformation
处理方法
Treatment
method
接种的 PLB数∥个
Number of
inoculated PLB
转化植株数∥株
Number of
transformed plants
转化率∥%
Transformation
rate
不处理 612 4 0． 7
Non-treatment
针刺损伤 631 11 1． 7
Acupuncture
2． 2 拟转化植株的再生 在 20 mg /L Kan选择培养基上培
养 60 d 后，获得蝴蝶兰原球茎分化和生根的健壮植株
129株。
2． 3 转化植株的 PCR检测 对获得的 129 株蝴蝶兰原球
茎分化和生根的健康植株进行 PCR 检测。结果表明，其中
59株为转化植株(图 2)。
注:M．分子量标记;1．质粒 DNA;2．对照植株;5、7、9．转基因植株;
3、4、6、8、10、11．非转基因植株。
Note:M． Molecular weight marker;1． Plasmid DNA;2． Control plant;
5，7 and 9． Transgenic plant;3，4，6，8，10 and 11． Non-trans-
genic plant．
图 2 PCR扩增结果
Fig． 2 PCR amplification result
3 结论
蝴蝶兰外植体原球茎的损伤处理对遗传转化影响很大。
原球茎状体起源于表层的内层细胞和亚表皮细胞。针刺损
伤或表层切割提高了农杆菌感染内层细胞的机会，而损伤程
度较小，所以转化效果较好。该研究表明，针刺损伤处理遗
传转化率达到 1． 7%，不进行针刺处理遗传转化率只
有 0． 7%。
利用农杆菌菌株 GV3101(质粒 pBI121)，对绿色荧光蛋白
基因 GFP导入技术进行了初步研究。在选择培养基(MS +3． 0
mg /L 6-BA +0． 2 mg /L NAA + 20． 0 g /L蔗糖 + 3． 5 g /L琼脂
粉 +1． 5 g /L活性炭 + 20． 0 mg /L Kan + 500． 0 mg /L Carb，pH
5． 4)上培养 60 d后，获得了蝴蝶兰原球茎分化和生根的健壮
植株 129株，经 PCR检测其中有 59株为转化植株。
参考文献
［1］谢永样，许聪耀，黄鹏林．应用基因枪法于蝴蝶兰基因转殖之研究［J］．
中国园艺，1995，41(3):174 －185．
［2］王怀宇．蝴蝶兰的快速无性繁殖［J］．园艺学报，1989，16(1):73 －77．
［3］刘荣维，梅庆超．丛生芽———蝴蝶兰无性快速繁殖的新途径［J］．热带
作物学报，1993，14(2):105 －107．
［4］金万枚，巩振辉，李贵荣，等．植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定
［J］．陕西农业科学，2000(1):24 －26．
［5］章炼红．转基因技术在农业上的应用与研究进展［J］．河南农业科学，
2000(2):18 －19．
［6］陆国权．植物基因工程技术的应用与问题［J］．世界农业，2000(7):
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
36．
(上接第 6315 页)
3 结论
以 2-羟基-1-萘甲醛和丙二酸二乙酯为起始原料，合成了
苯并香豆素-3-甲酸酯 1、3、4、5、6，其中苯并香豆素-3-甲酸正
戊酯(6)为新化合物。在所合成的酯中，苯并香豆素-3-甲酸
正丙酯的 QF 最高，荧光性最强。DMSO 是该类物质的荧光
猝灭试剂，溶剂极性对 λem影响不大。
参考文献
［1］ ERK C． Cation recognition with fluorophore crown ethers［J］． Ind Eng
Chem Res，2000，39:3582 －3588．
［2］BRUNET E，GARCIA-LOSADA P，RODRIGUEZ-UBIS J C，et al． Synthesis
of new fluorophores derived from monoazacrown ethers and coumarin nu-
cleus［J］． Can J Chem，2002，80:169 －174．
［3］BADAOUI F Z，BOURSON J． Chromoionophores derived from a coumarin
linked to monoaza-and diaza-crown ethers:Formation of divalent 3d metal
complexes［J］． Anal Chim Acta，1995，302:341 －354．
［4］PENG M S，CAI J． Synthesis and fluorescence of crown ethers containing
coumarin［J］． Dyes Pigments，2008，79:270 －272．
［5］赵玉玲，俞天智．苯并香豆素酯类衍生物的合成及荧光性质研究［J］．
分子科学学报，2007，23 (1):46 －48．
［6］ZHANG H，YU T，ZHAO Y，et al． Syntheses，characterization and fluores-
cent properties of two triethylene-glycol dicoumarin-3-carboxylates［J］．
Spectrochim Acta A，2007，68:725 －727．
［7］VALIZADEH H，SHOCKRAVI A，GHOLIPUR H． Microwave assisted syn-
thesis of coumarins via potassium carbonate catalyzed Knoevenagel con-
densation in 1-n-butyl-3-methylimidazolium bromide ionic liquid［J］． J
Heterocyclic Chem，2007，44(4):867 －870．
［8］慈云祥，贾欣．荧光量子效率的简化测量方法［J］．分析化学，1986，14
(8):616 －618．
4436 安徽农业科学 2011 年