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新麦草幼胚愈伤组织诱导



全 文 :收稿日期:2007-09-21;修回日期:2007-12-20
基金项目:国家自然科学基金项目(30160056);内蒙古自治区自
然科学基金项目(200711020416);农业部草地生态系统学重点开放
实验室
作者简介:李俊琴(1982-),女 ,内蒙古巴彦淖尔市人, 硕士研究
生 ,主要从事牧草育种研究.
文章编号:1673-5021(2008)02-0039-04
新麦草幼胚愈伤组织诱导
李俊琴 , 云锦凤 , 云 岚 , 赵宏宇
(内蒙古农业大学生态环境学院 ,内蒙古 呼和浩特 010019)
  摘要:以山丹新麦草和新麦草新品系的幼胚为外植体 , MS 为基本培养基 , 研究不同胚龄 、不同激素配比及低温
预处理对愈伤组织诱导的影响。结果表明 ,两种材料最佳胚龄均为 14d 左右 , 幼胚大小约为 1mm;激素最适配比均
为 2 , 4-D 2 mg/ L + 6-BA 0.2 mg/ L;低温预处理最佳时间为 1d。
关键词:新麦草;幼胚;愈伤组织;胚龄;激素
中图分类号:Q943.1;S543   文献标识码:A
  新麦草原产于中亚和西伯利亚 ,在我国自然分
布于天山 、阿尔泰山和青藏高原等地 ,近年来在我国
北方地区引种生长良好。新麦草又名俄罗斯野黑
麦 ,为多年生密丛型下繁禾草 。新麦草分蘖多 、叶量
大 ,具稠密的须根系 ,根白色 ,有沙套 ,耐牧 、耐践踏 ,
其营养生长期长 ,再生性也较强 ,是良好的耐旱放牧
型禾草 ,也是一种值得研究的改良干旱草地和培育
抗旱牧草品种的材料 。组织培养技术不仅是研究胚
胎发育诸多生理问题的有力工具 ,技术本身对实际
生产具有很重要的指导作用 ,用于克服种子休眠 、提
高发芽率 、缩短育种周期以及用于诱导胚性细胞系
并建立遗传转化体系等 [ 1 , 2] 。禾本科一些重要植物
的幼胚培养己经取得成功 ,有关新麦草幼胚培养的
研究还比较少。孙震晓等人曾对新麦草幼胚组织培
养进行过初步探索[ 3] 。内蒙古农业大学在 1984 年
从美国农业部农业研究局牧草饲料作物研究所引入
原始材料 Bozoisky ,采用单株种植和混合选择选出
新品系 P8401 ,即为新麦草新品系[ 4] 。本研究以新
麦草新品系(P sathy rostachy s juncea)和山丹新麦
草 [ P sathy rostachy s juncea (Fisch.) Nevski
cv.Shandan]为研究对象 ,以幼胚为外植体 ,通过探
索胚龄 、调节激素配比 、低温预处理优化愈伤组织诱
导条件 ,为新麦草组织培养提供基础研究资料 。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本试验材料为新麦草属中山丹新麦草和新麦草
新品系。两种材料均来自于呼和浩特市内蒙古农业
大学牧草试验站 。
1.2 外植体的采集
将试验材料在开花前套袋以防传粉结实 ,在盛
花期打开硫酸纸袋 1d使之授粉结实 ,第 2d清晨再
套好硫酸纸袋并标记日期 ,即为授粉 1d的日期 。按
照试验所需的授粉天数 ,将花穗取下用保鲜膜包好
带回实验室。
1.3 试验方法
将供试种子在超净工作台上用 70%乙醇浸泡
30s ,用 0.1%氯化汞消毒 5m in ,再用无菌水冲洗 3
~ 5遍 ,拨去内外稃 ,用解剖针从盾片处挑出胚(尽
量少带胚乳)接种在培养基上 。试验采用 MS 培养
基 ,均附加蔗糖 3%,琼脂 8.0g/L , pH 值调至 5.8 ,
采用高压灭菌锅灭菌 ,121℃下灭菌 20min。25℃下
暗培养两周后转入光照培养 。
幼胚接种后 20d统计愈伤组织数 、幼胚萌发数 ,
计算愈伤组织诱导率 ,利用 SAS 9.0数理统计软件
进行数据处理 。
2 结果与分析
2.1 胚龄对愈伤组织诱导的影响
本研究以胚龄为 8 ~ 23d 的幼胚作为外植体。
幼胚长轴的长度定为幼胚大小 ,量取 10个幼胚的长
轴长度 ,取其平均值。将幼胚接种到 MS +2mg/L
2 ,4-D培养基上诱导愈伤 。
国内有学者认为幼胚的接种时期是幼胚诱导的
—39—
第 30 卷 第 2 期          中 国 草 地 学 报          2008 年 3 月
  Vo l.30 No.2          Chinese Journal o f Grassland           Mar.2008  
关键因素之一 ,其主要考虑胚龄和幼胚大小两个因
素 ,胚龄和幼胚大小具有一定的相关性[ 5] 。
经方差分析 ,山丹新麦草授粉后 11d和 14d幼胚
愈伤组织诱导率显著高于其它胚龄 ,分别为 93.66%、
87.00%;新麦草新品系授粉 14d和 17d幼胚愈伤组织
诱导率显著高于其它胚龄 ,分别为 90.00%、87.00%。
幼胚小于1mm不易剥离操作 ,而大于 1mm 又容易萌
发 ,当幼胚接近 1mm时 ,不仅具有较高的诱导率 ,而且
易于剥离操作。由表 1可知 ,两种材料均在 14d时幼
胚接近1mm ,且幼胚愈伤组织诱导率较高 ,早熟萌发也
较少。综上所述 ,山丹新麦草和新麦草新品系的最佳
胚龄均为14d ,最佳幼胚大小约为 1mm 。
表 1 新麦草幼胚胚龄对愈伤组织的影响
Table 1 Effect of embryo age on the callus
天数
Days(d)
山丹新麦草 Shandan 新麦草新品系 New line
幼胚大小
S ize of immatu re
emb ry os(mm)
诱导率
Callu s induct ion
rate(%)
幼胚大小
S ize of imm atu re
embryo(mm)
诱导率
C allus induction
rate(%)
8 0.46 23.33C 0.46 6.67D
11 0.89 93.66A 0.64 72.67C
14 1.02 87.00A 0.98 90.00A
17 1.19 66.67B 1.04 87.00A
20 1.21 69.00B 1.21 80.00B
23 1.36 70.00B 1.22 79.33B
注:同列相同字母为差异不显著(P>0.05),不同字母为差异显著(P<0.05),以下同。
Note:S am e let ter in line rep resent no signi ficance(P>0.05), di fferent letter represen t signif icance (P<0.05), respectively.
表 2 不同激素配比对新麦草幼胚愈伤诱导率的影响
Table 2 Effect of different concentration of exogenous hormones on the callus
6-BA 浓度
Concent ration
of 6-BA(mg/ L)
2 , 4-D 浓度
Concent ration of
2 , 4-D(mg/ L)
山丹新麦草 Sh andan 新麦草新品系 New line
诱导率(%)
Callu s
in duct ion rate
幼胚萌发率(%)
Germination rate of
immatu re emb ryo
诱导率(%)
Callus indu ction rate
幼胚萌发率(%)
Germination rate of
immature embryo
0 0 6.67 93.33 0.00 100.00
0 2 66.67 0.00 87.33 6.45
0 4 75.30 0.00 86.67 0.00
0 6 55.22 0.00 59.67 0.00
0.2 0 29.17 50.00 0.00 100.00
0.2 2 80.00 0.00 90.00 0.00
0.2 4 76.67 0.00 86.33 0.00
0.2 6 53.33 0.00 88.33 0.00
0.4 0 10.00 80.00 10.00 60.00
0.4 2 73.33 0.00 82.67 0.00
0.4 4 64.55 0.00 75.00 0.00
0.4 6 73.94 0.00 83.00 0.00
0.6 0 0.00 76.67 3.33 66.67
0.6 2 66.67 0.00 80.00 0.00
0.6 4 67.68 0.00 65.33 0.00
0.6 6 63.44 0.00 60.00 0.00
—40—
中国草地学报 2008年 第 30 卷 第 2 期
2.2 不同激素配比对愈伤组织诱导的影响
将山丹新麦草和新麦草新品系的幼胚作为外植体
接入附加 2 ,4-D和 6-BA不同浓度配比的MS培养
基上。当将幼胚接入不含 2 ,4-D、只含 6-BA或无激
素的培养基中时 ,幼胚大多数都直接萌发 ,同时也有少
量愈伤组织形成。2 ,4-D浓度为 2 mg/ L时 ,两种基
因型的诱导愈伤率均最高 ,随着浓度的升高 ,诱导愈伤
率逐渐降低。当 6-BA 浓度为 0.2 mg/L 时 ,两种基
因型的诱导率达到最高 ,且愈伤组织质地较好;当
6-BA浓度为 0.4mg/ L、0.6mg/L 时 ,诱导率有所下
降 ,而且在愈伤组织的生长过程中不断出现严重的褐
化现象(表 2 ~表 4)。因此 ,山丹新麦草和新麦草新品
系激素最佳配比均为 2 , 4-D 2 mg/L + 6 -BA
0.2 mg/ L。6-BA 、2 ,4-D相互作用对山丹新麦草和
新麦草新品系诱导率的影响进行的方差分析结果(表
5)表明 ,6-BA 、2 ,4-D及 6-BA×2 ,4-D的 F 值均
达到极显著水平 ,且对两种基因型的影响程度均为
2 ,4-D>6-BA>6-BA×2 ,4-D。
表 3 2 , 4-D各浓度间差异显著性检验
Table 3 Different of the concentration of 2 , 4-D on the
tissue culture of immature embryo by Duncans test
2 , 4-D浓度
C on cen t rat ion of
2 , 4-D(mg/ L)
诱导率
Callus indu ction rate(%)
山丹新麦草
Shandan
新麦草新品系
New line
0 11.46C 3.33D
2 71.67A 85.00A
4 71.05A 78.33B
6 61.48B 72.75C
表 4 6-BA 各浓度间差异显著性检验
Table 4 Dif ferent of the concentration of 6-BA on the
tissue culture of immature embryo by Duncans test
6-BA 浓度
Concent ration of
6-BA (mg/ L)
诱导率
Callus indu ction rate(%)
山丹新麦草
Shandan
新麦草新品系
New line
0 50.79C 58.42C
0.2 59.79A 66.17A
0.4 55.46B 62.67B
0.6 49.45C 52.17D
表 5 6-BA和 2 , 4-D两因素试验方差分析
Table 5 Analysis of variance between concentration of 6-BA and 2 , 4-D
因素
Ingredien t
山丹新麦草 Shandan 新麦草新品系 New line
F值
F Value
Pr>F
Pr>F 显著性Signif icance F 值F Value Pr>FPr>F 显著性Signif icance
6-BA 9.03 <0.0001 * * 24.84 <0.0001 * *
2 , 4-D 339.99 <0.0001 * * 988.44 <0.0001 * *
6-BA×2 , 4-D 8.01 <0.0001 * * 13.06 <0.0001 * *
注:*和* *分别代表在 0.05和 0.01水平下显著。
Note:*and** represent th e signif icance at 0.05 and 0.01 level.
2.3 低温预处理对愈伤组织诱导的影响
将取回的材料放在 4℃的冰箱柜中保存 , 保
存时间共设 6 个时间段 , 分别为 0.5d 、1d 、5d 、
10d 、15d 、20d 。如表 6 所示 , 两种基因型幼胚均
在处理 1d时愈伤组织诱导率最高 ,山丹新麦草为
90.00%,新麦草新品系为 86.33%,且显著高于
未进行低温处理(对照)。诱导率随着处理天数的
增加显著降低 ,新麦草新品系的降低幅度比山丹
新麦草缓慢 ,处理天数为 20d时 ,山丹新麦草和新
麦草新品系愈伤组织诱导率分别降至 13.33%和
36.67%。因此 ,低温处理最佳时间约为 1d。可
见 ,对材料进行短时间的低温贮藏有助于提高愈
伤组织诱导率 。
表 6 新麦草幼胚不同处理天数的差异显著性检验
Table 6 Dif ference of handling time
on the tissue culture by Duncans test
处理天数
H andling time(d)
诱导率
Cal lus induction rate(%)
山丹新麦草
Shandan
新麦草新品系
New line
0 73.20B 79.32B
0.5 86.72A 83.65AB
1 90.00A 86.33A
5 66.67B 85.00AB
10 55.67C 76.00BC
15 52.00C 66.67C
20 13.33D 36.67D
—41—
李俊琴 云锦凤 云 岚 赵宏宇  新麦草幼胚愈伤组织诱导
3 小结与讨论
3.1 胚的发育程度对愈伤组织形成有明显影响 ,不
同胚龄的胚对培养条件反应不同 ,不同品种 、不同地
区最佳胚龄也不同[ 6] 。本研究表明 ,新麦草最佳胚
龄为 14d 左右;两种基因型的最佳幼胚大小均为
1mm 左右 ,胚太小不易操作 ,胚状体和芽出现较慢 ,
但分化率和成苗率较高。胚龄越大越易直接萌发 ,
这与在小麦中的研究结果相一致[ 6] 。
3.2 山丹新麦草和新麦草新品系激素最佳配比均
为 2 ,4-D2mg/L +6-BA 0.2 mg/L 。2 ,4-D是
禾木科植物组织培养中一种有效的生长素类激
素[ 7] ,在诱导培养基中通常添加 2 ,4-D ,以诱导禾
本科植物各种外植体细胞的脱分化形成愈伤组织;
在 2 ,4-D中配合使用少量 6-BA ,愈伤组织诱导
率要高于单独使用 2 ,4-D处理 ,且出现淡黄色 、颗
粒状愈伤组织的比率也高。这与丁路明等人[ 8] 的试
验结果基本一致。但对于其他大多数禾本科植物 ,
添加 6-BA 反而会抑制愈伤组织的形成 。
3.3 在 4℃下低温预处理最佳时间为 1d。试验表
明 ,对材料进行短时间的低温贮藏有助于提高愈伤
组织诱导率。赵成章[ 9] 用低温处理水稻花药明显提
高了愈伤组织的诱导率和绿苗分化率;沈清景[ 10] 用
低温处理籼稻也明显促进了花胚愈伤组织诱导率和
绿苗分化率;廖祥儒[ 11] 等对小麦成熟胚进行处理的
结果表明 ,低温对愈伤组织的形成有一定影响。已
有研究报道预处理温度越低且处理时间越长 ,植物
对培养反应的抑制作用越大[ 12] ,本研究与该结果一
致。
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(下转第 67页)
—42—
中国草地学报 2008年 第 30 卷 第 2 期
Effects of Fertilizer on Yield and Quality of
Wuxi Red Clover on Three Types of Soil
ZHANG Jian , H UANG Yong-fu
(Chongqing Academy o f Animal S ciences , Chongqing 402460 , China)
Abstract:The ef fects of N ,P , K fer tilizer t reatment and dif ferent pH value condi tions for Wuxi red clov er
on the f resh fo rag e yield and quali ty of Wuxi red clover we re studied.The resul ts show ed that fertilizat ion
significant ly improved the y ield and quality o f fo rag e.The y ield o f f resh fo rage w as highest and higher
than that of contro l g roups by 185.0%when using N 60 P120K135 in the heavy acid soil.The y ield of f resh
fo rag e w as highe r than that o f cont rol g roups by 115.0% and 95.5% respectively w hen using N 90P120K 90 in
acid and neutral soil.Fert ili zation can also g reat ly increase the pro tein content of Wuxi red clover.The
pro tein content is higher than that of cont rol g roups by 113.1%(heavy acid soi l)and 46.0%(neutral soil)
respectively w hen using N 60P60K90 during the ea rly flowe r period.However , in acid soi l the pro tein content
is highest and highe r than that of cont ro l g roups by 43.6%.
Key words:Soil types ;N ,P , K fe rtilizer t reatment;Wuxi red clover;Fresh yield;Quali ty
(上接第 42页)
Callus Induction of Immature Embryo of
Psathyrostachys juncea
LI Jun-qin , YUN Jin-feng , YUN Lan , ZHAO Hong-yu
(College of Ecology and Env ironmental Science , Inner Mongolia
Agricul tural Universi ty , Hohhot 010019 , China)
Abstract:Immature embryos of Psathyrostachys Juncea (Fisch.)Nevski cv.Shandan and a new line w as
used as tissue culture material.Immature embryos w ere cultured on M S cul ture medium .The effects of
embryo age , exogenous ho rmones and the t reatment wi th low temperature on callus induction of Psathy-
rostachy s juncea were studied.The results showed that the optimum immature embryo age of Psathy-
rostachy s juncea (Fisch)Nevski cv.Shandan and the new line w ere about 14d , the opt imum size of imma-
ture embryo w as 1mm ;The optimum concentration of exogenous ho rmones w ere 2 , 4-D 2 mg/L +6-BA
0.2 mg/L ;T he opt imum treatment time at low temperature w as 1d.
Key words:Psathy rostachy s juncea;Immature embryos ;Callus culture ;Embryo age;Exogenous ho r-
mones
—67—
张 健 黄勇富   不同类型土壤施肥对巫溪红三叶牧草产量和品质的影响