全 文 ：中粒种咖啡幼胚胚状体的分化和增殖
华南热带作物科学研 完院生物技术国家重点实脸室 张锡炎 郑学勤 曾宪松
摘 砚
中粒种加术幼胚在含K t2 . 。毫克 / 升 十 2 . ` 一 DO . 5毫克/ 升 十N A A o . 2毫克 / 升的培养基 上
能产生琉松 、 、共透呢的愈劣组织 ; 愈防组织在 Kt l. 。毫克/升 +GA O . 5毫克 / 升的培养基上分化
出大皇小子叶型胚状体 ; 刚形成的胚状体团在含K t2 . 。毫克/ 升 +活性炭。 . 5 % 的培养基上迅速增
殖 , 形 成难 以计数的大量胚状休 。
自从 2 9 7 0年 s t a r i t s k y首次发表 有 关 咖
今啡组织培养的文章以来 〔 1 】, 世界上很 多 国
家都开展 了咖啡的组织培养 工 作 。 至 1 9 81
年 , 先后发表的文章在 20 篇以上 〔 2 互。 这些文
章对中粒种咖啡的直生枝和成熟叶再生植株
作了报道 , 并报道了嫩茎形成愈伤组织和分
化胚状体过程的组织学研究情 况 [ 2 1 。 从 发
表的文章可知 , 小粒种咖啡组织培养工作也
开展得相当深入 , 1 9 7 5年以前便移栽成活了
叶片的再生植株 , 同时还获得了叶柄 、 嫩果
的愈伤组织 , 花药的胚状体和直生芽的萌发
材料 , 分离出叶片愈伤组织的原生质体 , 并
获得 3。%的再生愈伤组织 , 还试图通过直生
枝愈伤组织的悬浮培荞 , 探索体外生产咖啡 .
芳香物质的可行途径 i 之 ’ 3 〕。 此外 , 还 获 得
了由 A r a b u s at 杂交种休眠芽的萌发材料 , 以
及大粒种直生枝 、 花药等的愈伤 组 织 [ ’ j 。
我国的咖啡组织培养工作开展 得 比 较
迟 。 1 9 8 7年何芙裳首次报道 了咖啡离体胚培
养的情况 汇 4 J 。 与此同时 , 曾宪松也开 始 从
事咖啡幼胚 、 叶片和子叶的培养工作 ,获得从
愈伤组织经胚状体分化再生植株和中粒种咖
啡试管苗 ,并且试管苗移栽成活 , 生长成株 ,
目前已正常开花结果 ( 未发表 ) 。 本试验在
诱导 中粒种咖啡幼胚产生愈伤组织和分化胚
状体的基础上 , 对胚状体的增殖作了探索 ,
目的在于增大再生材料数量 , 为快速繁殖打
下基础 。
材料与方法
供试材料为中粒种咖啡的幼胚 。 从植株
上摘取成熟果和未成熟果 , 分别用 自来水冲
洗干净 , 再用 70 %的酒精消毒 3一 5分钟 , 剥
去外果皮 、 . 果肉和内果皮 (坚韧的种壳 ) , 取
出种仁 ( 咖啡豆 ) , 然后在超净工作台上用
7 0 %的酒精消毒 1~ 3分钟 , 取出后置于无菌
培养皿中 , 待酒精挥发后剥取种胚 , 即成熟
胚和未成熟胚 , 然后接种 。 选用 M s 培 养 基
为基本培养基 , 并加入。。 6一 。 . 7%的琼脂为
固化剂 , p H值调节在 5 . 8左右 , 并 在 0 . 8一
1
.
0公斤 / c m Z压力下蒸气灭菌 20 分 钟 。 培
养室温度为26 ~ 29 ℃ , 相对湿度为 60 一 8 。%。
在去分化阶段采用自然散射光 , 胚状体分化
和增殖两个阶段采用 自然光和补充 日光灯照
射 。
试验结果
一 、 成熟胚与未成熟产生愈伤组织的比
较
用 M S 十 K tZ . o毫克 /升 + 2 . 4 一 D o . 5毫克
/ 升 + N A A o . 2毫克 /升的培养基来诱导成熟
胚和未成熟胚产生愈伤组织 , 接种 9一 10 周
后进行观察 , 结果接种的60 个成熟胚全部产
生愈伤组织 , 其中有49 个形成疏松的愈伤组
织团块 ( 阵1 ) , 古接 种数 的 8 1 . 7% , 只
有 n 个局部产生愈伤 组 织 , 占 接 种 数 时
1 8
.
3% ; 接种的 60 个未成熟胚 , 4 8 . 3%只能
局部产生愈伤组织 , 能产生疏松愈伤组织团
块的仅有 35 % , 还有 1 6 . 7 %完全不产生愈伤
组织 。 即成熟胚产生愈 伤 组织 的 频 率 为
10 %
, 而未成熟胚产生愈 伤 组织的频率只
有 8 3 . 3% 。 由此可见 , 成熟胚产生愈伤组织
`的总频率和质量 , 均优于未成熟胚 。
二 、 胚状体的分化
分别把成熟胚和未成熟胚所产生的愈伤
组织团块转移到表 1所列的一组分化培 养 基
图 ! 成熟胚产生的愈伤组织 中 , 培养 12 ~ 13 周后观察结 果 ( 见 表 1 ) 。
表 1 成熟胚和未成熟胚愈伤组织分化胚状体的情况
愈伤组织来源 培养基 ( 毫屯 / 井 ) 转移愈拐组织 }分化胚状体数
少
K t !
`
O 未 G A O
。
5
B A S
.
0 + I A A O
K t 0
.
5 + N 入 A O
牟交 ( 团 )
2 1
3 2
2 4
频上 ( % ) 评
8 5
。
7
5 0
.
0
4 1
。
6
小子叶型 、 数量多
少
K t l
。
O + G A O
。
5
B A S
.
0 + IA A D
。
2
K t 0
.
5 + N A A O
`
2
2 5
3 6
2 5
8 0
。
0
4 1
。
7
6 0
。
O
球型 、 鱼雷型 、
球型 、 鱼雷型 、
小子叶型 , 多
球型 、 鱼雷型 、
球型 、 鱼雷型 、
吓一未成熟胚
由表1可知 ,来自成熟胚和未成熟胚的愈
伤组织 , 都是在K t , . 0毫克 / 升 + 。 A O . 5毫
竟 / 卉的培养基上分化胚状体的频率最高 ,
并且衡者都产生大量的小子叶型胚状体 , 这
些小子叶型胚状体在数量和形状上和叶片愈
伤组织所产生的胚状体相当接近 。 而 在 B A
民 O毫克 /升 + I A A o . 2毫克 /升和 K t o . 5毫克
/ 升 + N A A O . 2毫克 / 升培养基上 , 两种愈
伤组织分化胜状体的效果就远不如前者 , 不
仅分化的频率低 , 并且分化出来的胚状体数
量很少 , 多数呈球型和鱼雷型 。 由此可知 ,
成熟胚和未成熟胚两种团块状愈伤组织 , 在
分化胚状沐的性能上没有明显的差别 。
三 、 胚状体的增殖
胚状体分化出来以后 , 为了增大可以再
生的胚状体数量 , 把刚形成的胚状体转移到
含不同橄浓度的一组培养基中 , 培养结果如
表 2 含不同 K t浓度的培养基对胚状体
增殖的作用
培 养 基
( 毫克 / 升 )
K t o
.
5 + 活性炭。 。 5%
K t i
.
o + 活性炭 0 . 5%
K t Z` 0 + i舌性炭 0 . 5%
K t刁. 0 + 活性炭0 . 5%
K st
.
0 + 活性炭0 . 5%
转移 新婚成 的 大于 。 . sc m 宝胚状 {卫邀体~ {_ 的子叶翌{瞥鲜竺脚25 } 5 一2 0 。 。一 g } 名6 。 .
2
。
9
2 0
。
8
1 3
。
2
叼15
QU一a一西介匕
.…找己,目n甘1上脚r八`,d325613 43 42 4
3 8
1 5 } 4 4
表2 。
由表 2可见 , 含有 K t 2 . 。毫克 / 升 + 活性
炭 0 . 5 %的培养基最有利于胚状体的增殖 , 即
产生新胚状体的频率高 , 且新形成的胚状体 .
形状多样 ,子叶徒长率低 。 而 K t浓度为0 . .5
1
.
0
、
4
.
0和 8 . 0毫克 / 升的培养基 , 形成新胚
状体群的频率都较低 , 并且在这几个培养墓 :
上子叶的徒长情况都比较严重 。 ( 如 Kt 2. 。 + 毫克 / 升 + 活性炭 0. 5 %) 便进
从表 2还可看出 , 当子叶徒长频率达到 、 ,叮步发育成胚状体 。 相反 , 如果不及时把这
最高 ( 4 4 . 1% ) 时 , 胚状体的增殖率载降黔言 些胚性细胞转移到新的培养基中 。 便会由于
最低 ( 。 . 。% ) ; 而当子叶徒长 率 降至最低 次生物质的积累或培养基干涸等原因 , 使之
(2
. 。% ) 时 , 胚状体的增喧率就升到 最寮劣 : 夭折` 当然 , 二如新的培养基成分不适宜 , 也
/ :
、
:
。 即 。 ) 。 由此可见 , 子叶的徒长 与胚状 沐能使胚性细胞进一步发育 。 我们知道 , 尽
体 一 , j 之祠存在 一; 勺` 月于· 国此 , 在增殖曝
状体时 , 必须 没法防止 刃 勺 的徒长 。
把所书成的新胚状体 ; , 转到新的培 i养摹 ;、 ·
上继代培养 , 便可获之; 无法计数的大量杯状 :
体 ( 图 2 ) 。 、一 ,
图 2 在增殖培养若上继代培养所产生
的胚状体
讨 论
胚状体的丸; 殖 , 可能是由于愈伤组织在
分化川胚状体的同时 , 也形成了大量具有成
肠趋向的 沙比绘胞 , 这些胚性细胞处于不同
的分化水牛 , 、 } 、仗被转移到适宜的培养基上
,铸已分化形成的胚状体数量很大 , 但这远远
比不上胚性细胞的数量 。 国此 , 提高胚性细
胞发育成胚状体的效卑 , 将大大地增加胚状
体的数星 , 有效地保证了再生材利的来诈 ,
为快速肇殖打下基砂 。
胚状体的增殖 , 还可能由于胚状体在培
养基中受到激素等的刺激 , 使某些细胞恢复
到胚性细胞阶段 , 这些胚性细胞又可进一步
发育咸新的胚状体 。 新的肛状体形成以后 ,
可能脱离原来的胚状体 , 也可能保留在原来
的胚状体上形成分枝状的胚状体 。 这种胚状
体上长庄新胚状体的现象经常出现 。 分枝状
的胚状体可以从胚轴 , 胚根和子叶等不 同部
位长冲 。
参考文献
〔1〕 S t a r i ts ky , G 。 : A e t a B o t 。 N e e r l 。
1 9 7 0 5 1 9 : 5 0 9
〔幻 M 。 R 。 S o n匕. h l : P la n t t i . s u e e u l t u ~
t e , 19 8 1
, P
。
3 25一3 4 7
〔 3〕 E 。 P 。 H e r m a n : H o r t s e s e n e e , 1 0 (右)
1 97 5 : 5 8 8
〔们 何芙裳 : 咖啡离体胚 培养 , 《 热带 作
物研究 》 , ] 9 5 7 ( 3 ) : 1 9e 2 3
( 上接 第3 6 页 ) 由于空间有限 , “ 沙拉机 ”
里的植物多数会比地球上同类植物 矮 小 得
多 , 如蕃茄树的高度不会超 过 30 厘 米 。 另
外 , 由于太空中没有引力 , 植物不是向侧生
就是例生 。
太空 “ 沙拉机 ” 还有另外一种 重 要 功
能 , 就是它在培育植物的同时 , 又能把植物
散发的水分 , 送回营养输送系统 , 为太空人
制造饮耳水 。
宇航局工程经理克利斯
存在和人能够在太空砂一崛 植物
的尹众既
可提高太空人彬卿键舞势哟缈妙 , 又可增添他们太窖焦活懊催稗气一 .售鸭牟在空闲时间从事有创遣性的淆攫石` 丫 ’ , · ` ’
一 ’ - 一 , 人声一 “ `(越典爵叽笋鑫材黔 ( 2 2 ),户 12’ )