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平邑甜茶变异后代的辐射 RAPD鉴定
石琰 1 ,沙广利2 ,黄粤2 ,孙仲序3 ,束怀瑞3＊(1.青岛科技大学化工学院 , 山东 青岛 266042;2.青岛农业科学研究院 , 山东 青岛 266100;
3.山东农业大学园艺学院 ,山东 泰安 271018)
摘要:利用 RAPD 技术分析了经γ射线辐射并选育的 5个平邑甜茶种系:A1、B1、C1、C101、C2 及 C1 的芽变 C102 的遗传变异
情况。筛选了从S341 到S372 32 个引物 ,找到了各个种系的突变后的特殊谱带 ,有缺失带也有特异带 ,说明辐射可以在植物分子
水平上产生变异。而且在 C1 基础上二次辐射的种系 C101 和辐射后产生的芽变 C102 ,具有更广泛的变异 , 同时也部份产生回复
突变。
关键词:辐射;RAPD;平邑甜茶;芽变;回复突变
中图分类号:Q943.2　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2004)06-0026-03
RAPD Identification of Radiated “Malus.hupensis” Stocks
SHI Yan-jing1 ,SHA Guang-li2 ,HUANG Yue2 ,SUN Zhong-xu3 ,SHU Huai-Rui3
(1.Chemical Engineering College ,Qingdao University of Science &Technology ,Qingdao 266042;2.Qingdao Agricultural
Science Institute , Qingdao 266100;3.Horticulture College , Shandong Agriculture University , Tai an 271018 ,P.R.China)
Abstract:It used RAPD to detect the five Malus.hupensis stock varieties A1 , B1 , C1 , C101 , C2 which induced by radiation and C102 , the shoot
mutant of C1.It screened a total of 32 primers from S341 to S372.and found specific bands that related to these varieties , including missing and
specific bands.By this way , It proved that the five varieties mutanted at molecular levels.It also found that C101 which radiated twice , and the
shoot mutant C102 not only mutated at a larger scalebut also appeared revertions.
Key words:radiation;RAPD;“ Malus.hupensis” ;shoot mutant revertions
收稿日期:2004-02-17;修回日期:2004-06-06
基金项目:山东省自然科学基金项目(Y96D22075);青岛市自然科学基
金项目(03-2-jz-06)
作者简介:石琰 (1974-),女 ,博士 ,讲师 ,研究方向:植物分子生物
学 , E-mail:syj99@163.com;＊通讯作者:束怀瑞(1929-),男 , 博导 ,
工程学院院士 , E-mail:hrshu@sdau.edu.cn ,研究方向:果树学。
　　平邑甜茶(Malus.hupensis)是苹果生产中广泛应用的砧
木 ,具有无融合生殖的特性(90%以上)[ 1] , 实生后代高度一致
性 ,种子繁殖本身不带病毒 , 免除了组培脱毒的复杂程序。选
育具有无融合生殖特性的矮化砧 , 已成为苹果砧木育种的一
个重要方向。育种学家们希望以此为育种母本 , 在保留它无
融合特性的同时 ,选育出具有矮化特性的砧木 ,可以用种子快
速繁殖整齐一致的矮化苗木 , 克服现行苹果无性系矮化砧木
存在的立地性不好 ,苗木繁殖困难等缺点。果树育种周期长 ,
占地面积大 ,进行早期选择 , 十分必要。辐射诱变育种[ 2] 有提
高基因突变率 ,扩大变异谱 , 打破性状连锁和促进基因重组 ,
克服植物自交不亲和促进远缘杂交 , 实现基因转移等优点。
辐射产生的群体一般表现出广泛的变异 , 但有变异可能是来
自环境的饰变 ,并非是在 DNA水平上发生突变 , 因此 , 对辐射
育种所得材料进行 DNA 鉴定 ,尽早淘汰饰变类型 , 确定突变型
有利于缩小育种群体 ,缩短育种时间 , 提高育种效率。本研究
所鉴定的材料为辐射群体中表现型突变类型 , 但缺乏分子水
平的证据。目前分子标记技术中 , RAPD 技术具有操作简便 、
快捷 、灵敏 、成本低等优点 , 可以对辐射诱导出材料进行快速
检测。只需 0.1g材料 , 可以在苗期早期检测。 RAPD技术结合
辐射育种 , 进行分子标记辅助育种 , 可以尽早确定变异 , 提高
选择的准确性。此次鉴定的材料已经过长期的表型选择 , 若
经 RAPD 分析得到特异的差异带 , 不仅证明辐射产生了 DNA
变异 ,也获得了与表型相关的分子标记。
1　材料与方法
1.1　材料
A1、B1、C1 、C2 为平邑甜茶γ射线辐射群体中的表现型变
异类型 , 8年生;C102 是 C1 的芽变 , 2年生。这些植株定殖于
青岛农业科学研究院果树砧木资源圃。 A1、B1、C1 、C2 表现矮
化 , C1 表现大果 , C102 表现大花。其中 C101 为在C1 基础上再
次辐射得到的株系;C102 是 C1 大花 、重瓣芽变。对照是 1 株 6
年生 、未经辐射的平邑甜茶。
32 个随机引物 S341-S372 , Taq 酶 、dNTPs ,上海生物工程
公司。
图 1　S370的扩增结果
A1缺失 S370-1200
Fig.1　Amplification results of primer S370
A1 appears one missing band S370-1200
图 2　S371的扩增结果
C101缺失 S371-650
Fig.2　The S371 amplification results
C101 appear one bank missing S371-650
1.2　方法
1.2.1　DNA提取方法
植株的基因组 DNA提取的方法按参考文献[ 3] 略做修改
提取。取 0.1叶片材料于 Eppendorf管中 , 加液氮后 , 用特制的
第 14卷第 6 期:26
2004 年 12 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.14 , No.6:26
Dec.2004
DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2004.06.013
与管嵌合的磨棒研磨成细粉。 加 500μl CTAB 提取缓冲液 ,
65℃水浴 15min ,下面完全按文献[ 3]操作。
图 3　S341的扩增结果
C1、C101 、C102共同的特征带 S341-1050 、
S341-800,共同缺失 S341-750;C1 、C101的缺失带
S341-900、S341-1200;C102回复突变缺失带
S341-900、S341-1200;C2缺失 S341-1200的带
Fig.3　The amplif ication of S341
C1, C101 ,C102 all appeared S341-1050 ,S341-800 , and
missing S341-750;C1 , C101 missing S341-900, S341-1200
and revented C102 , C2 missing S341-1200
图 4　S344的扩增结果
B1增加了特异带 S344-300;A1 、B1 、C2都缺失了 S344-450
Fig.4　The amplification results of S344
B1 missing S344-1800 and appear S344-300;A1 , B1, C2
all missing S344-450
图 5　S36的扩增结果
C1 、C101、C102有共同的特征带 S368-800;
A1、C2有特异带 S368-3000
Fig.5　The amplification results of S368
C1 , C101, C102 all appeared S368-800;A1 , C2 appeared S363-3000
at the same time and S363-300 appeared in A1 , B1 , C2
1.2.2　RAPD反应体系及条件
采用 20μl 体系:Taq 1U , Mg2+ 2mmol/ L, dNTP 100μmol/ L ,
10mmol/ L Tris-Cl pH8.3 , 50 mmol/ L KCl ,随机引物 10 pmol , 模
板 DNA 20-100ng。
反应条件为:94℃预变性 2min , 94℃变性 30s , 36℃退火
40s , 72℃延伸 1min ,共 45 个循环 , 最后 72℃延伸 5min。每个扩
增反应重复 3 次。
图 6　S347的扩增结果
C101缺失了 S347-1200 ,增加了 S347-850的特征带;
A1 、B1 、C2产生了 S347-950的特征带
Fig.6　The amplification of S347
S347-1200 is missing and S347-850 appears
in C101;S347-950 appears in A1 , B1 , C2
图 7　S348的扩增结果
B1缺失 S348-950和 S348-700;C2缺失
S348-950;C2出现特异带 S48-850
Fig.7　The amplification results with S348
S348-950 and S347-700 are missing B1;S348-950 is
missing in C2;S348-850 appears in C102
图 8　S361的扩增结果
C101的变异很大 ,缺失了 S361-1000、S361-850 ,
增加了特异带 S361-1150
Fig.8　The S361 amplifi cation result s
S361-1000 ,S361-850 are missing and S361-1150 appears in C101
　　PCR及 RAPD扩增产物在 1ⅸTAE 电泳缓冲液用 1.2%琼
脂糖上电泳分离。电泳结果在美国 UVP凝胶成像系统中观察
拍照。
2　结果分析
272004 年 12月　　　　　　　　　　　　　　　　 RAPD 鉴定辐射平邑甜茶　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　
通过 RAPD标记分析发现经辐射和表现型筛选得到的 5
株平邑甜茶辐射种系和 1株辐射后芽变的株系均在 DNA 水平
上发生了较大的突变 ,这几个株系与对照平邑甜茶相比均在
RAPD谱带上出现了缺失带或是特异带。 A1:缺失 S370 -
1200、S344-450 , 出现了特异带 S347-950 、S368-3000;B1 缺失
S363-1370、S344-450、S348-950 、S348-700、S363-1800。出
现了特异带:S344-300 、S347-950 两条特异带。C2 缺失 S341
-1200 、S348-950、S344-450 , 出现了特异带 S347-950、S363-3000。A1 、B1、C2在表现型上共同表现矮化。在带型上也有
很多共同的特异带和缺失带 , 如共同特异带 S347-950;共同
缺失S344-450。
图 9　S362的扩增结果
C101缺失 S362-830 、S362-3000 、S362-1800
Fig.9　The amplification results with S362
C101 missing S362-830 , S362-3000 , S362-1800
图 10　引物 S363的扩增结果
C1 、C101 、C102共同的特异带 S363-3000;
B1缺失 S363-1800
Fig.10　The amplification results with S363
C1 , C101 ,C102 appeared the same specific bands S363-3000;
B1 missing S363-1800
C1的特异带比较多 , 有 S341 -1050、S341-800 、S363 -
3000、S368-800 , 缺失S341-900 、S341-700。这些特异带和
缺失带有的仍然表现在 C1 的二次辐射种系 C101 和其芽变
C102 中 ,如特异带 S341-1050、S341-700 、S363-3000 、S368-
800和缺失带 S341-950 、S341-750 , 说明这些位点的突变在
C1 中已经稳定下来了。有的特异带和缺失带就发生了回复突
变 ,如在 C102 种回复了缺失带 S341-900 、S341-1200。说明
这些位点的突变是不稳定的。射线会引起 DNA损害 , 植物体
进行修复。因此有些辐射产生的变异就是不稳定的 , 易发生
回复突变 , C102 发生了较多的回复突变。 C101 是在 C1 的基
础上进行二次辐射得到的 , 在 RAPD分析中很明显地发现它的
变异更加广泛 , 这也说明辐射产生的突变有剂量效应。它的
特异带有:在 S361 引物中缺失 S361-1000、S361-850 , 又多一
条S361-1150 的带;在 S347 中缺失 S347-1200 增加 S347 -
850;在 S362 中缺失 S362-830 、S362-1800、S362-3000。 C102
是取自 C1 成年树上的表现大花的变异枝接穗嫁接而出的植
株 , C102的谱带相对于 C1 更加接近于对照(未经辐射的平邑
甜茶), C1 发生的突变在 C102 中发生了回复突变 , 但仍然有一
些没有回复的位点 , 因此它的表现型是与 C1的大果型不同 ,
表现出大花型。
在检测的 32 个随机引物中 , 对照平邑甜茶共扩增出 156
条谱带 ,以此作为总数统计突变率结果如下。 A1:3.21%, B1:
5.12%, C2:3.85%, C1:4.48%, C101 7.69%, C102 3.21%。
3　讨论
辐射将产生广泛无向的变异 , 为了获得具有优良性状的
辐射种系 , 应广泛地选择。传统方法是在田间进行长期的表
现型观察。但由于表现型的差异有可能是环境原因造成的 ,
特别是一些质量性状 , 比如本试验检测的几个矮化的株系 , 为
了排除环境因素对筛选造成的影响 ,有必要进行分子标记的
检测。
通过 RAPD分析证明经过长期表现型选择的这几个株系
均发生 DNA 水平上的变异 , 并且证明在适宜的剂量范围内二
次辐射将产生更加广泛的变异 , 辐射后的植株易发生回复突
变。
理论上讲辐射产生的变异是随机无向的 , 但在本次实验
中发现表现矮化的种系 A1、B1、C2 也具有一些相同的特异
带。分析其原因:, 一 、尽管无融合生殖的平邑甜茶具有极高
的遗传稳定性但仍然存在一些不同种类的差异。有可能用
于辐射产生 A1、B1 、C2 种系的种子原本就与本试验使用的
对照不同。也与 C1 系统不同;二 、尽管辐射本身产生的变
异是无向的 , 但由于经过长期的人为表现型选择 , 使得作者
选择出来的这些具有矮花性状的 3 个品系在 DNA 谱带上具
有了一些同源性。并且这些在矮化变异种系中相同的特异
带有可能是与矮化性状相关的分子标记。
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具有抑菌活性的海洋细菌的分离与鉴定
姜健 ,杨宝灵 ,元起 ,刘松梅 ,吕洁
(大连民族学院生物工程系 , 辽宁 大连 116600)
摘要:分离并筛选具有抑菌活性的海洋细菌对于开发和利用海洋微生物具有重要意义。该研究从 6 份海泥样品中共分离到
78 株海洋细菌 , 以6 种细菌作为敏感指示菌 , 采用覆盖技术对分离菌株进行拮抗试验 , 17 株海洋细菌具有抑菌活性。对其中 2 株
具有较强抑菌活性的海洋细菌进行革兰氏染色 、耐盐试验 、运动性观察 、过氧化氢酶测定 、明胶液化试验 、硫化氢产生试验 、石蕊
牛奶试验 、糖类发酵 、硝酸盐还原等特性分析 , 依据《伯杰氏细菌鉴定手册》进行分类鉴定 , 它们分别应归属为气单孢菌属
(Aeromonas sp.)和假单孢菌属(Pseudomonas sp.)。
关键词:海洋细菌;抑菌活性分离;鉴定
中图分类号:Q939.92　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2004)06-0028-03
Isolation and Identification of Marine Bacteria with Antimicrobial Activity
JIANG Jian ,YANG Bao-ling ,YUAN Qi ,LIU Song-mei ,LV Jie
第 14卷第 6 期:28
2004 年 12 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.14 , No.6:28
Dec.2004