全 文 ：花色和花形是观赏花卉最重要的观赏性状， 直
接影响到观赏花卉的观赏价值和经济价值。 蝴蝶兰
是原产于亚洲热带地区的一类兰科植物， 花型奇
特， 花色丰富（例如白色、 黄色、 橙色、 红色、 紫
红色、 紫色等）， 具有极高的观赏价值和经济价值，
是我国乃至世界产业化程度最高的兰科植物。 蝴蝶
兰的规模化生产主要通过种子无菌播种生产实生苗
和花梗腋芽组织培养生产分生苗两条途径繁殖种
苗。 由于组培过程中的诸多诱变因素， 蝴蝶兰在组
培过程中会产生一定量的突变体。 突变体对于后续
的分子机理研究及育种具有重要意义， 也为蝴蝶兰
的生物学研究提供了优良的实验材料。 但是， 只有
通过检测和筛选的突变体， 去除非可遗传突变后才
能作为分子育种材料 。 RAPD （random amplified
polymorphic DNA）是一种以 PCR 技术为基础的核
苷酸序列多态性检测方法， 该方法无需了解 DNA
序列信息， 快速易操作， 是突变体检测和筛选的常
用方法 [1]。 目前， 国内外对于多种植物的组培突变
体检测都有报道 [2-4]， 几种常见兰科植物的品种变
异检测也大都采用 RAPD 检测[5-7]， RAPD 检测已经
成为快速检测突变体的常规方法。 目前， 对蝴蝶兰
突变体的研究还是比较少， 研究内容主要集中在 3
个方面： 一是辅助诱变育种， 目前国内的研究主要
集中在这一方面 [8-9]； 二是通过 RAPD 检测优化组
培过程， 减少突变， 保证克隆系的一致性 [10-11]； 三
是通过野生型和突变体的对比检测寻找变异基因及
蛋白[12-13]。 但是总体来说对蝴蝶兰突变体的研究还
非常少， 刚刚起步， 没有能挖掘出蝴蝶兰突变体在
分子生物学研究上的潜在价值， 需要继续深入。
本研究以几种常见的蝴蝶兰组培突变体为实验
热带作物学报 2013， 34（6）： 1110-1114
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2013-02-26 修回日期 2013-04-18
基金项目 广东省现代农业产业技术体系建设专项； 广州市农业科技项目（No. GZCQC1002FG08015-01）； 广东省教育部产学研结合项目
（No. 2011B090400239）。
作者简介 肖文芳（1985 年—）， 女， 硕士， 研究实习员。 *通讯作者： 吕复兵， E-mail: 13660373325@163.com。
几种常见蝴蝶兰组培突变体的 RAPD检测
肖文芳， 李 佐， 尤 毅， 陈和明， 吕复兵 *
1 广东省农业科学院环境园艺研究所， 广东广州 510640
2 广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室， 广东广州 510640
摘 要 从蝴蝶兰组培群体中筛选得到 3 种蝴蝶兰组培突变体： 缺刻型花， 花瓣唇瓣化的非正常整齐花以及花
色嵌合型突变体。 利用 50 条随机引物对 3 种突变体及其正常株进行 RAPD 检测， 结果发现 RAPD 检测对缺刻型
花和花色嵌合型突变体有效， 但是对花瓣唇瓣化的非正常整齐花无效。 另发现缺刻型花存在个体差异， 每个突
变体的条带并不相同。
关键词 蝴蝶兰； 突变体； RAPD
中图分类号 S682.31； Q78 文献标识码 A
Detection of Several Common Phalaenopsis
Somaclonal Mutants by RAPD
XIAO Wenfang， LI Zuo， YOU Yi， CHEN Heming， Lu·· Fubing
1 Environmental horticulture Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou, Guangdong 510640, China
2 Guangdong Key Lab of Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization, Guangzhou, Guangdong 510640, China
Abstract Three somaclonal mutants, namely unsymmetrical flower with incised petal and/or sepal, peloric flower
with all three petals as the labellum, and chimeric mutation in Phalaenopsis flower color, were screened. All the
mutants were compared and analyzed with the control (wild-type Phalaenopsis)by RAPD using 50 UBC arbitrary
primers. The results showed that RAPD analysis was useful for the mutants with unsymmetrical flower and the
mutants with chimeric flowers, but not the other kind of mutant. Further, different incised mutant had different
polymorphic fragments with wide individual variability.
Key Words Phalaenopsis； Mutant； RAPD
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2013.06.020
第 6 期 肖文芳等： 几种常见蝴蝶兰组培突变体的 RAPD检测
引物名称 引物序列 引物名称 引物序列
S29 GGGTAACGCC S425 ACTGAACGCC
S30 GTGATCGCAG S439 GTCCGTACTG
S31 CAATCGCCGT S1290 ACCCCTGGCA
S256 CTGCGCTGGA
表 1 A 族蝴蝶兰选用引物名称及序列
材料， 探索 RAPD 检测技术在蝴蝶兰组培突变体
检测上的可行性， 旨在建立一套比较完善， 适用于
大多数蝴蝶兰突变体检测的检测技术， 并通过检测
获得各类单一性状的蝴蝶兰突变体， 为蝴蝶兰各项
分子研究提供优良材料， 为蝴蝶兰的育种提供具有
稳定可遗传的特殊优良种质资源。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 蝴蝶兰植株 采用三族变异蝴蝶兰： A 族：
‘红彤’ 蝴蝶兰花瓣及（或）萼片产生缺刻变异； B
族： ‘红彤’ 蝴蝶兰产生花瓣不展开形似唇瓣的花
形变异； C 族： ‘满天红’ 蝴蝶兰的花瓣、 萼片及
唇瓣边缘产生白色流彩的花色变异。 突变体材料均
来自广东省农业现代化科技示范区广东省农业科学
院花卉研究所温室大棚。
1.1.2 化学试剂及试剂盒 化学试剂均购自广州
化学试剂厂， 基因组 DNA 提取试剂盒为天根生物
科技（北京）有限公司的新型植物基因组 DNA 提取
试剂盒。
1.1.3 RAPD 引物 50 条 10 碱基随机引物筛选
自国内外发表文献 [14-20]， 由生工生物工程（上海）
股份有限公司合成。
1.1.4 PCR反应试剂 TaqDNA 聚合酶使用Takara
公司的 TaqTM。
1.2 方法
1.2.1 总 DNA 提取 蝴蝶兰基因组 DNA 提取材
料采用根尖 0.2 g， 按照天根生物科技（北京）有限
公司的新型植物基因组 DNA 提取试剂盒操作步骤
进行， 提取的 DNA 溶解在 80 μL 1×TE溶液中。
1.2.2 总 DNA 检测 取上述提取的 DNA溶液 2 μL
于 Thermo 的 Nanodrop2000C 核酸蛋白检测系统上
检测 DNA 的纯度及浓度， 根据检测结果将样品
DNA浓度调节到 20 ng/μL。
1.2.3 RAPD 反应体系 RAPD 反应采用 25 μL
体系： Taq酶1 U（5 U/μL）， Primer（10 μmol/L）1 μL，
模板DNA（20 ng/μL）2 μL。 Mg2+浓度及dNTPs浓度进
行两因素多水平实验筛选， Mg2+浓度（25 mmol/L）设
0.4、 0.8、 1.2、 1.6、 2.0、 2.4和2.8 μL共7个水平，
dNTPs浓度（2.5 mmol/L）设0.8、 1.2、 1.6、 2.0和2.4 μL
共5个水平。RAPD反应程序： 94℃ 3min； 94℃ 45 s，
38 ℃ 1 min， 72 ℃ 1 min 30 s， 45个循环 ； 72 ℃
10 min， 4℃保存。 所有反应重复3次检验重复性。
1.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测 25 μL 反应溶液中
加入 8 μL 6×loading buffer， 混匀后， 取 10 μL上样
到 1.5％琼脂糖凝胶上， 于 1×TAE缓冲液中 80 V恒
压电泳 1 h。
2 结果与分析
2.1 RAPD反应体系筛选结果
通过对 3个变异组的正常株型及个别变异株型
的 3 次重复检测 ， 确定采用 Mg2 +浓度 1.6 μL，
dNTPs 浓度 1.2 μL 的反应体系进行后续的 RAPD
检测。
2.2 A族蝴蝶兰的引物筛选及检测结果
通过重复筛选， 得到 7条引物能够扩增出多态
性片段（表 1）， 区分野生型与 5 个突变株型， 说明
这一组的蝴蝶兰突变体的基因组都发生了变化， 并
且 RAPD 检测技术能够检出这种变化。 从图 1 可
以发现， 并不是每一个突变体的多态性条带都是一
样的， 有的引物只在个别突变体中扩增出多态性条
带， 而其他突变体及野生型未表现出多态性（例如
引物 S29）。 虽然 5 个突变体的变异表型都为花瓣
及（或）萼片缺刻， 但是缺刻程度及类型并不相同，
通过 RAPD 检测也发现引起突变的基因组变化并
不相同， 说明这一性状可能和多个基因组位点有
关； 或者， 5 个突变体除缺刻外还存在其他一些突
变， 但是未在表型上表现出来。
2.3 B族蝴蝶兰的引物筛选及检测结果
B 族野生型与突变株型未能用本实验挑选的
50条引物检测出多态性（图 2）。 出现上述情况可能
存在以下原因： 一是所挑选的 50 条引物覆盖面不
够， 未能覆盖到 B 族变异区域； 二是 B 族突变可
能是由单核苷酸突变、 基因修饰等 RAPD 检测范
围外的突变引起的， 需要通过其他检测手段进行
检测。
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第 34 卷热 带 作 物 学 报
WT： B 族野生型蝴蝶兰 ‘红彤’； 6： B 族变异蝴蝶兰。
图 2 B族蝴蝶兰花器官对比图及 50 条引物筛选胶图
引物名称 引物序列 引物名称 引物序列
S10 CTGCTGGGAC S39 CAAACGTCGG
S31 CAATCGCCGT S66 GAACGGACTC
S38 AGGTGACCGT S256 CTGCGCTGGA
表 2 C 族蝴蝶兰选用引物名称及序列
M： Marker 2 000 bp； WT： A 族野生型蝴蝶兰 ‘红彤’； 1～5： A 族变异蝴蝶兰。
图 1 A 族蝴蝶兰的花器官对比图及 RAPD 检测胶图
2.4 C族蝴蝶兰的引物筛选及检测结果
通过筛选， 得到 6 条引物能够扩增出多态性，
区分野生型和突变体（表 2、 图 3）， 说明 C 族蝴蝶
兰突变体的基因组发生了变化， 并且 RAPD 检测
适用于检测这种突变类型。 通过胶图发现多条多
态性条带， 说明此类变异可能涉及到多个基因的
联合效应。 另外， 扩增结果不仅存在条带的有无，
还存在条带的强弱。 前人研究推测条带的强弱可
能与基因的表达量有关， 但是没有确实的实验证
据。 C 族蝴蝶兰只有一个突变类型， 突变群体为
克隆系。 为排除克隆系在组培过程中产生二次突
变， 所以采取了随机采样， 随机选取了 6 株突变
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第 6 期 肖文芳等： 几种常见蝴蝶兰组培突变体的 RAPD检测
M： Marker 2 000 bp； WT： C 族野生型蝴蝶兰 ‘满天红’； 7： C 族变异蝴蝶兰。
图 3 C 族蝴蝶兰花器官对比图及 RAPD 检测胶图
体分别进行了扩增， 发现 6 株突变体之间没有差
异， 表明克隆系存在二次突变的几率较小， 可用于
后续的转录组比较分析。 通过转录组比较分析能够
寻找与此类变异相关的基因， 并且可通过对比分析
RAPD 检测中出现的条带强弱是否与基因的表达量
有关。
3 讨论与结论
蝴蝶兰是我国重要的经济花卉， 并且作为兰科
植物中的 “模式植物”， 其商业价值和科研价值都
非常高。 对于观赏花卉来说， 花形及花色突变在品
种改良方面具有重要的应用价值， 能够创造出优异
的种质资源， 增加遗传多样性， 为新品种的选育提
供基础。 而突变体也是分子生物学研究的优良材
料。 目前， 国内外对于多种植物的组培突变体检测
都有报道， 例如花叶万年青 [2]、 甘蔗 [3]、 红掌 [4]等，
几种常见兰科植物的品种变异检测也大都采用
RAPD检测方法检测[5-7]， 但是 RAPD 检测在蝴蝶兰
上的应用主要集中在遗传多样性 [14-15, 20]的检测及组
培突变率或者是诱变率的检测上 [8-11]， 特别是国内
的研究基本停留在检测水平上， 并未见深入研究报
道， 也没有其在育种方面应用的报道。
本研究就蝴蝶兰较为常见的几种组培突变体进
行了 RAPD 检测， 证明 RAPD 检测对于蝴蝶兰的
大部分突变体是较为有效的。 同时， 我们发现， 仅
仅通过表型性状的变异来区分蝴蝶兰突变体的策略
行不通。 因为， 蝴蝶兰的某一性状的突变存在变异
程度的差异， 这种差异是单一基因引起的还是多基
因联合效应， 目前并不清楚， 也可能两种情况都存
在。 而且， 也可能存在认为划分为同一族的突变体
中个别突变体有其他性状相关基因的突变， 但是并
未在表型上有所表现。 本研究中的 A 族突变群体
就存在这种情况， 表型变异相似但是程度不同，
RAPD 检测胶图也说明每一个突变体的基因变异并
不相同。 所以， 这种突变体并不适合进行针对单一
性状的分子生物学研究。 发现这种突变体后， 首先
要进行 RAPD 检测 ， 发现突变体间存在差异时，
后续研究就要慎重选择材料了。
前人研究表明， B 族蝴蝶兰变异株的变异与
MADS-box 基因的表达量有关 [21]， 所以这类突变的
检测可以直接采用 MADS-box 基因的半定量或者
定量检测。 对于 C 族突变体来说， RAPD 检测发现
不同的个体间并不存在差异， 表明 C 族的花色突
变已经稳定下来， 是可遗传的， 那么 C 族的突变
株就可用于后续的分子生物学研究或者是育种研
究了。
通过 RAPD 检测发现的多态性条带经过切胶
回收后进行了克隆及测序， BLAST 比对全部未能
找到同源基因。 由于蝴蝶兰基因组序列图谱还未发
布， 回收的条带可能是蝴蝶兰特有的基因序列， 因
此没有同源比对结果， 这部分的实验数据将留待后
续研究分析。 另外， RAPD 检测结果表明， C 族变
异群体为单一性状稳定变异， 将进行转录组差异比
较分析， 寻找与突变表型相关的基因， 通过基因功
能研究为蝴蝶兰花色育种提供分子理论基础。 而 A
族变异群体则需要进行进一步筛选， 寻找单个性状
稳定变异的突变体进行下一步的深入研究。
本实验表明， RAPD 检测适用于部分蝴蝶兰突
变体的前期筛选， 且筛选周期较短， 操作简易， 能
为后续的深入研究提供一定的实验依据， 是一种较
为良好的突变体筛选方法。
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第 34 卷热 带 作 物 学 报
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责任编辑： 凌青根
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