全 文 ：昆 明 医 学 院 学 报 2008，（6）：41~ 44
Journal of Kunming Medical University
CN 53 -1049/ R
论 著
1株滇重楼内生真菌的研究——抑真菌活性及分离鉴定
宣 群 １），张才军 １），张玲琪 ２），张 愉 １），施 明 １）
（1） 昆明医学院微生物学暨免疫学教研室，云南昆明 650031；２） 云南大学生命科学学院，云南昆
明 650091）
［摘要］目的 分离滇重楼内生真菌， 研究其抑制病原性真菌的作用并进行分类鉴定．方法 从滇重楼植
株中分离培养内生真菌. 在体外，用指示菌株金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、普通变形杆菌、痢疾杆菌、大肠
埃希菌及白色念株菌进行抑菌活性筛选. 对具有抑制白色念珠菌的内生真菌菌株进行培养， 观察显微形态特
征， 确定其分类地位．结果 从滇重楼的根中分离到一株内生真菌菌株，对白色念株菌有较强抑制作用，鉴
定为无孢菌群．结论 滇重楼内生真菌无孢菌群菌株LRF4具有抑制白色念珠菌的作用.
［关键词］滇重楼；内生真菌；抑真菌活性；无孢菌群
［中图分类号］R379.9［文献标识码］A［文章编号］1003－4706（2008） 06－0041－04
A St udy on an Endophyt ic Fungus in Par is Polyphylla Smit h
var .yunnanensis( Franch) Hand.Mazz:Ant ifungal Act ivit y，
Isola t ion and Ident ifica t ion
XUANQun１），ZHANGCai－jun１），ZHANGLing－qi２），ZHANGYu１），SHIMing１）
（1）Dept. of Medical Microbiology and Immunology，Kunming Medical University，Kunming Yunnan
650031；２）School of Life Sciences，Yunnan University，Kunming Yunnan 650091，China）
［Abstract］ObjectiveToisolateendophyticfungiinthemedicinalplantParispolyphyllaSmithvar．yun-
nanensis（Franch） Hand．Mazz，investigate antimicrobial activities of these isolates and identify those strains
which had antimicrobial activities．MethodsEndophyt c fungi were isolated from Paris polyphylla Smith var．
yunnanensis and Staphylococcus aureus，Salmonella typhi，Proteus vulgaris，Shigella dysenteriae，E.coli and
Candidaalbicanswereusedtotesttheirantimicrobialactivitiesinvitro.Theantifungalactiveisolatewasidentified
byobservingitscolonycharacteristicsandmorphologicalfeatures．ResultsOneoftheisolateswassuccessfulin
inhibitingthegrowthofthetestedmicroorganisms，CandidaalbicansandwasidentifiedtoMyceliasterilia．Con-
clusionA strain LRF4 of Mycelia sterilia isolated from Paris polyphylla Smith var．yunnanensis has significant
effectoninhibitingthegrowthofcandidaalbicans.
［Keywords］ParispolyphyllaSmithvar.yunnanensis(Franch.)Hand.Mazz；Endophyticfungi；Antifungal
activity；Myceliasterilia
［基金项目］云南省教育厅自然科学基金资助项目（06Y043C）
［作者简介］宣群（1968～），女，云南昆明市人，硕士，讲师，主要从事医学微生物学暨免疫教学科研工作.
重楼 （Paris polyphylla Smith） 是我国传统名
贵中药，滇重楼 （Paris polyphylla Smith var．
yunnanensis(Franch.)Hand.Mazz.） 是主要药用种[1]．
滇重楼能清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊，是著
名中成药“云南白药”、“宫血宁”、“热毒清”
等的重要原料药．近年来，随着药理学研究的深
入，其药用价值日益凸显，具有止血、祛痰、抑
菌、抗早孕杀灭精子、抗细胞毒等作用[2]，临床上
广泛应用于治疗内、外、妇、儿科疾病．由于这
种药用植物生长缓慢，野生资源已不能满足药材
市场需求，引种驯化成为解决供需矛盾的首选方
案．然而，人工栽培存在种子休眠、繁殖率低、
培育周期长等诸多问题尚待解决，化学合成和组
织培养也未获得成功．目前，内生菌发酵生产活
性物质被认为是最有前途的一种方法[3-5]，有学者
曾发现滇重楼内生真菌可抑制白色念珠菌，但抑
菌效果不明显[6]．本研究对采自云南武定的滇重楼
内生真菌进行分离和抑菌试验，其中一株内生真
菌对白色念珠菌具有强抑制作用，而对指示细菌
均无抑制作用．经培养和形态学分析，鉴定为无
孢菌群菌株．
1 材料与方法
1.1 植物材料
滇重楼采自云南武定，由云南白药集团优质
种源繁育有限责任公司惠赠．
1.2 培养基
分离培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（po-
tato dextrose agar，PDA） 1 000 mL 灭菌后，加入
链霉素4mL．液体发酵培养基：马铃薯葡萄糖液
体培养基（potatodextroseliquidmedium）．抑细菌
培养基：MH培养基．抑真菌培养基：沙保弱培
养基．内生真菌鉴定培养基：查氏培养基、促孢
培养基（KH2PO41.0g，KNO31.0g，MgSO4.7H2O
0.5g，KCl0.5g，淀粉0.2g，葡萄糖0.2g，蔗糖
0.2g，琼脂20.0g，水1000mL，pH自然）[7]
1.3 内生真菌的分离
取新鲜健康滇重楼植株的根状茎、根、茎、
叶、花等样品用自来水冲洗干净，消毒纸巾擦
干．将各部位切成小块，于75％酒精中漂洗3～
5 min 后，无菌水冲洗，随即用 0.1％升汞浸泡
0.5～1min，无菌水冲洗数分钟．实验组样品边缘
剪开，置PDA平板上，于 27℃培养箱中培养 7
d；对照组样品直接置PDA平板，于相同条件下
培养．实验组有菌丝长出并进行纯化、斜面保
藏．在培养期间，对照组无菌丝长出．
1.4 内生真菌液体培养及其萃取物
取孢子或菌丝块接种于装有 250 mL PDA 液
体培养基的三角瓶中，27℃、120r/min摇瓶7d．
过滤分离培养物和发酵液，培养物冷冻30min后
研磨，与发酵液混合，加入等体积乙酸乙酯萃取
40h．最后70℃常压蒸馏浓缩至2mL保存．
1.5 抑菌试验
采用滤纸片（φ＝5mm） 法，进行对6种人
体病原菌的抑菌检验．无菌操作法制备指示菌悬
液并涂布于MH/沙保弱平板上．取内生真菌液体
培养的乙酸乙酯提取物浸透滤纸片，待溶剂挥发
后贴在平板上．置37℃培养箱中培养17h，测量
抑菌圈直径．
1.6 菌株鉴定
对具有明显抑菌作用的内生真菌菌株，根据
其培养和形态结构特征进行鉴定[8]．
2 结果
2.1 内生真菌分布
从冬季样品中，仅分离到4株内生真菌；而
夏季样品分离到15株．植株不同部位分离到的菌
株种类和数量也存在差异，见表1．
2.2 抑菌试验结果及菌株鉴定
18株内生真菌中，LRF4的代谢产物对指示
细菌无抑制作用，但对指示真菌白色念珠菌有强
抑制作用，抑菌圈直径达20mm．经2次重复试
验，抑菌情况基本相同．该菌株在查氏培养基中
培养7d，观察到中央淡黄，边缘乳白的绒毛状菌
落，菌丝淡黄分隔，未见孢子．促孢培养后，仍
未见孢子产生．经鉴定，属无孢菌群，见图 1、
图2．
3 讨论
内生真菌普遍存在于健康植物体内，其种类
及数量随寄居植物的内部生态条件变化而变化，
故在不同季节、不同采样地分离到的内生真菌不
同．冬季气温低，内生真菌生长繁殖慢，分离到
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的菌株较少；夏季则相反．当中药植株受到病原
菌协迫时，产生应激反应，少量内生菌株能耐受
这种不良环境，并通过产生抗菌物质抑制病原菌
生长，提高寄居植物的存活率，故从内生菌中寻
注：“-”表示由于采样时缺少该组织而未分离其内生真菌．
表 1 滇重楼内生真菌分布情况（株）
Tab. 1 Dist r ibut ion of endophyt ic fungi in P.polyphylla Smit h var .yunnanensis（strain）
采样季节 根状茎 根 茎 叶 花 总数
冬季 0 4 - - - 4
夏季 1 5 0 3 5 14
图 1 LRS4对白念菌的抑制作用
Fig. 1 Inhibit ion of LRF4 on C.albicans
图 2 LRF4察氏培养基培养7d菌落形态特征
Fig. 2 Colony’s phot ograph of t he LRF4 on czapek’s
medium for 7 days
图 3 LRF4的显微照片
Fig. 3 The micrograph of LRF4
找新抗菌物质是可行的[9-11]．本研究分离到的无孢
菌群菌株抑制指示真菌白色念珠菌的能力强，但
不能抑制所有的指示细菌，可能由于真菌和细菌
分别属于真核生物和原核生物，细胞结构差异大，
故抑菌物质的作用机制也不同．将进一步提纯其
中的抑真菌物质并研究其作用机理，为发现深部
感染性真菌白色念珠菌的治疗新药提供菌种资源，
使发酵工程成为中药现代化的一种新方法．
致谢：感谢云南白药集团优质种源繁育有限
责任公司韦建荣高级工程师给予的无私帮助．
［参考文献］
［1］ 国家药典委员会编．中华人民共和国药典（2005年版
1部）［M］．北京：化学工业出版社，2005：183
［2］ 武珊珊，高文远，段宏泉，等．重楼化学成分和药理作
用研究进展［J］．中草药，2005，35（3）：344－347
［3］ 孟繁蕴，汪丽娅，冯成强，等．滇重楼引种驯化研究进
展［J］．中草药，2005，36（7）：1102－1104
［4］ DANIELAWEBER，OLOVSTERNER，TIMMANKE，et
al．Phomol，a new antiinflammatory metabolite from an
endophyte of the medicinal plant erythrina crista-galli
［J］．TheJournalOfAntibiotics，2004，57（9）：559－563
［5］ 曹晓冬，周立刚，徐得剑，等．滇重楼内生真菌的生物
学性状及其甾体化合物含量［J］．西北农林科技大学
学报（自然科学版），2005，33（8）：125－128
［6］ 孙桂丽，陈有为，夏国兴，等．云南重楼植物内生真菌
的分离及抗菌活性筛选［J］．微生物学杂志，2005，25
（6）：59－62
［7］ 詹寿发，樊有赋，甘金莲，等．凤尾蕨内生真菌的研究
I－菌种分离及其分类鉴定［J］． 菌物研究，2007，5
（4）：195－197
［8］ 魏景超．真菌鉴定手册［M］．上海：上海科学技术出
版社，1979：405－649
［9］ THONGCHAI TAECHOWISAN，CHUNHUA L U，YUE-
MAO SHEN，et al．Secondary metabolites from endo-
phytic streptomyces aureofaciens CMUAc130 and their
antifungalactivity［J］．Microbiology，2005，151：1691－
1695
43第 6期 宣 群，等．1株滇重楼内生真菌的研究——抑真菌活性及分离鉴定
［10］ZHOULI-GANG，CAOXIAO-DONG，YANGCHENG-
ZONG，et al. Endophytic fungi of Paris folyphylla var.
Yunnanensisandsteroidanalysisinthefungi［J］．Natural
ProductResearchandDevelopment，2004，16（3）：198－
200
［11］周盈，陈琳，柴鑫莉，等．魔芋内生拮抗细菌的分离及
其抗菌物质特性研究［J］．微生物学报，2007，47（6）：
1076－1079
（2008－10－07收稿）
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（上接第40页）
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钉在骨内要保证一定的抓持力．也有文献表明[6,7]，
最外侧的螺钉应仅穿透一侧骨皮质，以缓解钢板
两端的应力集中，并且可以减少两端骨强度下降
的程度．
由此可见，优化的内固定方案不但有利于骨
折的健康愈合，更能在一定程度上减少后期并发
症．当然，临床医师也要合理指导病人术后的功
能锻炼，根据患者年龄、身体状况、骨折类型、
内固定材料及方法并结合X线照片综合进行．
［参考文献］
［1］ 王锦绣，金玉星．股骨干骨折钢板内固定后再骨折的
探讨及对策［J］．中原医刊，2000，27（7）：25－26
［2］ 王建军. 股骨干骨折钢板内固定术后不愈合43例原因
分析［J］．中华现代临床医学杂志，2007，5（7）：615－
616
［3］ 胡军．股骨干骨折内固定治疗体会［J］．中国保健，
2007，15（6）：75
［4］ 刘师良，李哲．内固定治疗肱骨干骨折失效的生物力
学分析［J］．实用骨科杂志，2003，9（4）：338－339
［5］ 邹培，李主一，杨爱梅.股骨干骨折钢板内固定后钢板
断裂并原位再折的生物力学分析［J］.伤残医学杂志，
2003，11（3）：15－16
［6］ BEAUPREGS，GIORINJ，CALERWE，etal．Acom-
parison of unicortical and bicortical end screw attachment
of fracture fixation plates［J］．J Orthop Trauma，1992，6
（3）：294－300
［7］ DAVENPORT S R，LINDSEY R W，LEGGON R，et al．
Dynamic compression plate fixation: a biomechanical
comparisonofunicorticalvsbicorticaldistalscrewfixation
［J］．JOrthopTrauma，1988，2（2）：146－150
（2008－06－15收稿）