全 文 ：胡朴华第冬期 国外农学一麦类作物
生长调节剂和基因型对小麦和
小黑麦通过花药培养产生
多元单倍体的影响
D h i a 5
.
Ha s s a w i等
摘 要
普通小麦 (T r it i e u m a e s` i, u m L . ) 和小黑麦 ( T r未t i e o s e e a乙己 W i才艺m a e k ) 通过花药培养所产生
的纯合双单倍体幼苗是很有用的育种材料 。 但仍需要进一步改进雄核发育 。 本实验采用 的 培 养 基 (基
本成份与 85 D I : 相同 ) 一种是由 2、 4、 5 一 T ( 2 、 4、 5一三氯苯氧基 乙酸 ) 、 P C P A (对氯苯氧基乙酸 ) 、
d i e a m b a ( 3
、
6 一二氯 一 2一 甲氧基苯甲酸 ) 、 P i e l o r a nt “ 一氨基 一 3 、 5、 6 一 三氯毗吮 一 2 一 狡酸 ) 、
I B A (叫噪 一 3 一 丙酸 ) 、 IA A (叫垛 一 3 一 乙酸 ) 和 2 . 4 一 D (2 、 4 一 二氯苯氧基乙酸 ) 7种生长调节剂中
的任何 一 种与 6 一苯基腺凛吟 (激动素 ) 组成 。 另一种是由四种激动素 ( 6一苯基腺喋岭 、 异戊基腺嗓吟 、
N 。 一异戊烯腺嚓吟 (又名玉米素 ) 和 6 一 糠氨基嗓吟 (作对照 ) 之一与 2一 奈乙酸 ( N A A ) 组成 。 测定以
上 1 1个培养基所培 养的 5个小麦品种 ( A n g u , , C e n t u r k , C h r i s , K i t t和 P a v o n 7 6 ) 和 2 个八倍体小
黑麦品系 (T “ 1, T’8 2 ) 花药愈伤诱导率和多元单倍体产生的情况 , 测库时花药所含小抱子处在单核 中
期 。 品种和培养基之间的相互影响不 明显 。 如把所有生长调节剂平均起来看 , P a v o n 是最好的品种 , 其
出愈率为 1 4 . 4% , 绿苗分化率为23 % 。 当把所有 品种平均来看 , 含 2 . 4 一 D 的培养基愈伤组织诱导率最高
(1 3
.
9% )
。把一致的愈伤组织再置于含 I A A ( l m g 1/ ) 和 2一 奈乙酸 (2 m g l/ ) 的 87 T I 培养基上进行再
生 。
包括小麦在内的各种作物单倍体和多元单
倍体幼苗产生的研究 已取得 很 大进 展 (欧阳
1 9 8 6 , 胡 , 1 9 8 6 ) 。 首先使小麦品种产生多元
单倍体幼苗 , 接着进行染色体加倍 , 为测验和
} 选择提供纯合系 。 由小抱子产生的多元单倍体
; 愈伤组织和悬浮培养细胞 , 也可用于有效诱导
突变的研究 , 这种突变多呈隐性且潜伏于多倍
体幼苗之中 (胡 , 1 9 8 6 ) 。 单倍体花粉培养突
变和选择的应用为作物抗病和品质育种开辟了
新途径 。 纯合变异体的恢复所需时间和空间都
比常规育种小的多 。 因此 , 组织培养可能成为
当代育种方案的一个重要补充 , 或作为一个新
的遗传手段而被利用 。
培 养 初 期 , 基因型似乎对 出愈率和幼苗
分化率有重要作用。 P a 、 · 0 n7 6品种总的 愈伤组
织诱导率占培 养 花 药 的 13 帕 ( A r m s t r o n g等
1 9 8 7 )
。 在一步成苗花培系统中 , C h r i S品 种
诱导 率 为 7 . 3肠 (梁 等 19 5 7 ) 。 S o h a e f f e r等
( 1 9 7 9 ) 证实 , 花培技术可以用来培养农艺性
状优 良小麦的单倍体 。 梁等 ( 19 8 2 ) 用几个普
通小麦品种 , 采用确定的化学营养培养基 , 由
小抱子诱导愈伤组织 , 然后培育出多元单倍体
国外农学一交类作物 9 1马 1年第 3 期
幼苗 。 在高等植物离体培养中 , 生长调节剂特
别是生长素和细胞分裂素是必不可少的 。 在营
养培养基中不论添加一种生长素或细 胞 激 动
素 , 而能否使细胞增长扩大或者是促使细胞分
裂 , 完全取决于外植 体 的 类型及植物的种类
( P i e r k
, 1 9 8 7 )
。 就大 麦 ( H o dr e姗 ; V u 不g aer
L
.
) 而 言 , 增加 2 . 4 一 D能提高愈伤组织的形
成频率 (叶等 , 一9 5 5 ) ,生长素 2 . 4 一 D 、 添 加毒
美定和玉米素可诱导水稻 ( o yr az s at iv 。 L . )
愈伤组织 ( R e d d了等 1 95 5 ) 。 通 过M N 6培 养
基可以改进小麦花粉胚的诱导率 , 并能促 进其
发育 。 该培养基中含有 2 . 4 一 D 、 N A A 以及氨基
酸 ( C h u和 H i l l 一9 8 5 ) 。 采用内含 2 、 4 、 5一 T
和 2 . 4 一 D , 其 浓 度范围为 l郎 M到 60 林M的培养
基能有效地诱导牛皮菜的颖果和胚 的愈 伤 组
织 ( C o n g e r等 , 10 7 5 ) 。 3个 禾本 科 种 对 浓
度为 5 0卜M到 6 0件M的 I A A 、 N A A 、 p e p a ,
2
.
4 一 D
、 2
、
4
、
5一 T
, d i e a m b a
、 p i e l o r a m
和 s i l v e x 的反应各不相同 ( C o n g e r等 19 5 2 ) 。
D i 。 a m b a在从小麦未成熟胚诱导体细胞胚形成
过程中极 为有 用 ( H u n s i n g e r 和 S c h a u z e
2 9 5 7 )
。 在液体培养基中 , 添加 F s e o l l能改 善
多元单倍体的产生 (周等 1 98 9 ) 。 作者测定了
各种生长素 、 细胞激动素以及基因型对小麦和
小黑麦多元单倍体产生的效应 。
材扦和方法
实验采用 7 种生长素 : 2 . 4一 D (作 为 对
照 ) , 2 、 4 、 5一 T 、 P C P A , d i e a m b a 、 p i e -
l o r a m
、
I B A 和 I A A 分别 以 ( 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、
6
、
7
、
) 代表 7种培养基 , 浓度 为 Zm g 1/ 并附
加 l m g 1/ 激动素 。 另外 4 种培养基分 别含 4 种
细胞激动素 : 6 一 B A 、 2 一 iP 、 玉 米 素 和 动力
精 (对照 ) , 每一种细胞 激 动 素 的 浓 度 为
z
.
s o m g / 1
, 加上 o . 7 5 m g / 1的 N A A , 分别 以 s 、
9
、
1 0
、 和 1 代表 (所用浓度是从本实验 室 以 往
试验中选择确定的 ) 。
基本培养基 8 5 D比所用无机和有机成分前
已报道 (梁等 19 8 7 ) 。供试材料为小麦品种 A n -
g u s
、
C e n t u r k
、
C h r至S , K i t t和 P a v o n 7 6以及小
黑麦 T 8 1 、 T 8 2( 为八倍体种来源于中国 , 亲本
不详 ) 。 材料种植于昼温 2 ℃ , 夜温 18 ℃的生
长室内 , 2 4小时光照期 ( 7 2 5件m o l /m Z / S 。 e ) 。
当花药处在单核中期时采集麦穗 , 同时用 70 肠
的酒精冲洗 1分钟。 采集的方法是从 每 l 个 品
种中选 3 株 , l 株选 l 穗 , 每穗无菌摘取 20 个
花药 , 然后置于 50 m l的三角瓶内 , 每 瓶 盛 有
20 一25 m l固体培养基 , 每个品种的每一个重复
接种 60 个花药 , 三角瓶置于黑暗处直到愈伤组
织形成 , 开始分化幼苗 。 5一 7天后 , 将带再生
小植株的培养瓶移至培养室 , 每 日 1 2小时光照
以促进生长 , 让幼苗在蛙石中生长两周 , 然后
移栽到土壤与泥炭按 3 : l混合的盆内生长 。
取以上已培养出的幼苗根尖 , 用冰冻水进
行预处理 24 小时 , 然后固定到 3份酒精 ( 95 肠 )
1份醋酸 ( v / v ) 的溶液中。 接着在含有 1肠 醋
酸洋红的瓶中进行根尖染色 , 同时徐徐加热直
至染液沸腾 , 然后移到载玻片上加 45 肠的醋酸
l滴 加压进行染色体记数 。 多元单倍体成熟时
不实 。 在不同培养基上形成的愈伤组织约接种
5 0天 , 未分化出幼苗将其转 移 到 1 0 x ls m Z的
培养皿 中 , 该培养皿含 20 一 25 ml 固 体 87 T I培
养基 (如上所述的有机和无机物质再加上 I A A
l m g 1/
, 激动素 Zm g 1/ 和 3肠的蔗 糖 ) , 进 行 2
步分化 。
愈伤组织诱导率的计算是花药所产生 的 1
个或者多个愈伤组织的数目除以培 养 花 药总
数 ; 多元单倍体产生率是每个品种多元单倍体
的苗数除 以成株总数 , 作为 2步成苗系统 , 幼
苗再生频率的计算是愈伤组织产生的幼苗数除
以愈伤组织转移的总数 。 对所有数据利用反正
弦进行转换 , 再作统计分析 。
数据采用两个重复的析因实验进行分析 。
记录以下数据 : 花药产生 1个和多个愈伤组织
的频率 , 花药产生绿苗和白化株的频率 、 多元
单倍体成株率 , 幼苗形成的方式 以及 8 7 T :培养
基上愈伤组织的分化 (植株的再生 ) 情况 。
结 果
所有研究的各个性状 , 由于品种受培 养基
功 , 1年第 3 姐 国 外农学一麦类作物 2 3
互作的影响均不显著 (原表 l略 ) ,因此 ,所有品
种和所有培养基均取平均值 。
不同品种的花药在不同培养基上对产生的
愈伤组织的反应各不一样 。 小麦花药 出 愈 率
的范围从品种 C e n t u r k 的 1 . 5肠 到 P a v o n 7 6的
14
.
4肠 (表 l) 。 小黑麦的花 药 培 养 结果 是
T 81 和 T 8 2的出愈率分别 为 8 . 2肠 和 9 . 5 肠 。 至
于培养基 , 愈伤组织的诱导率从 8号培 养基 的
3
.
2肠到 l号培养基的 13 . 9肠 (表 2 、 原表 3) 。
各品种之间和培养基之间都存在着显著差异 。
结果表明 : 在 6 一 B A 、 2一 iP 玉米素或 6糠氨基嘿
岭与 N A A结合使用的培养基上 , 花药 产 生的
愈伤组织最少 。 通常 , 不同品种和不同培养基
的花药培养 , 均大约在 19 和 20 天之后才开始出
现愈伤组织 , 诱导愈伤组织所需时间的长短 ,
似乎与基因型和培养基的种类密切相关。
部分敏感性花药发育成多个愈伤组织。 小
麦花药产生 2 个或多个愈伤组织的范围 从 C e -
n t u r k的 0 . 3肠到 P a v o 二 7 6的 9 . 2呱 (表 2 , 原 表
3)
, 小黑麦 T 81 和 T 82 的多愈组率分别为 5 . 4%
和 6 . 9肠。 l号培养基上的花药产 生 9 . 1肠 的多
愈组织 , 而 8号产生 1 . 2肠 , 其它培养基的居中
(表 2 , 原表 3) 。 品种和培养基的差异是显著
的 。
愈伤组织产生绿苗的能力 与 品种 有 关。
P a v o 7n 6是最敏感的 品 种 , 绿 苗 分 化 率 为
4
.
0肠 , 其次是 k i t t , 1 . 9肠 。 小黑麦 T 8 1和 T s Z
的绿苗分化率为 0 . 2呱和 。 . 3肠 (表 1 、 原表 2 )。
以上结果表明花培诱导绿苗率在很大程度上决
定于基 因型 , 培养基间的差异不显著 。
表 1 (原表 2) 5个小麦和 2个小黑麦品种 (1 1个培养基为平均值) 6个性状出现的频率
品种 培养的花药数
产生 愈伤组织
的花药数 %
产生复合愈伤组织的花药效% 直接成苗数
2 3
。
0
2 3
。
8
18
。
0
2
。 3
0
。 0
4
。
5
4
。 5
17
。
8
2 0
一
6
O
。
0
0
。
0
0
。
0
0
。
0
丹`ù吕Cj叨l
.….上n甘0UOnU臼`上óó.…4,l叹U八n`o内舀O口.…O口.jJn
n`,二O份甘
.…ó”叼人nù砚U
小麦P a v o n 7 6 6 6 0
K i t t 6 6 0
C h r i s 6 6 0
A n g u s 6 6 0
C e n t u r k 6 6 0
小黑麦 T s i 6 6 0
T 8 2 6 6 0
L S D o
.
5
14
。
4
9
。
5
7
。
6
2
。 8
1
。 8
8
。 2
9
。
5
2
。
9
0
。
3
5
。
4
6
。
9
2
。
4
0
。 0
0
。
2
O
。
3
1 。 9
4
一
5
10
。
9
1 1
。
8
表2 (原表 3 )
培养 的花药数
以个培养基 (5 个小麦品种和 2个小黑麦品种为平均值 ) 的 6个性状出现频率
直接成苗数培养基
产生愈伤组织
的花 药数写
产生 复合愈伤组织花药数% 花药产生白苗数%
800162.2o’.07.14礼:..3.19.83.20.2
,且了4ó甘。.八。5.`乳气3553324 2 0
4 2 0
4 20
4 2 0
4 2 0
4 2 0
42 0
4 2 0
4 2 0
42 0
42 0
1 3
。 9
6
。
7
6
。 1
10
.
1
1 1
。 5
7
。 2
3
。
2
5 。 9
1O
2
。 6
3
。
7
2
。
9
3
。
1
1
。
4 5
。
6
0 。 7 1 0
。
O
0
。
7 16
。
4
0
。
9 1 1
。
9
0
。
3 7
。
1
1
。
2 2 1
.
4
l
。
1 1 4
。
3
0 。 4 7
。
1
0
。
9 7
。
1
0
.
2 4
。
8
0
.
9 14
.
3
N S N S
1 0
。
7
5
。
2 9
。
5
.04.12.ONS
1 1
L S D ( 0
.
5 )
6
。
4
3
。
7 N S
国外农学 .` ` 麦类作份 19, 1年第 舀期
l|
|、J刁. .JJ…,.J..百月.
所有品种的白苗分化率都很低 , .白苗分化
率 的 范围由品种人 n g u s的 0 . 1肠到 P va on 76 的
1
.
7肠 (表 l) , 差异显著 。 小黑麦 T sl 和 T 82
的白苗分化率分别为 1 . 1肠和 0 . 9呱 。
、 总的来说 , 所有再生苗的 76 肠为多元单倍
体 , 23 肠为二倍体 , 没有发现非 整 倍 体 。 在
多元单倍体中 , 23 . 8肠来源于K i t 品种 , 23 肠
来源于 P a v o n 7 e 。 C h r i s 、 T s l 、 T s Z 、 A n g u s
和 C e n t u r k分 别产 生 15 。 o 、 4 . 5 、 4 . 5 、 2 . 3
和 。 . 0肠多元单倍体 (表 1) , 差卜 异 显 著 。 然
而 , 1 1个培养基的差异不显著。 多元单倍体的
植株生长健壮 , 分孽多 , 穗小 , 但未结籽 。
? ay on 7 6
、
T sl 和 8T 2的小抱子可 通 过两
种途径产生植株 : 通过愈伤组织形成和不经愈
伤组织直接成株 。 P va nQ 76 通过直接形成方式
产生的幼苗比小黑麦产生的 多 (表 2) 。 通 过
该方式一步成苗的植株比由愈组产生的植株生
长的快 , 但表现纤弱 、 且夯粟 少 (图 1略 ) 。
采用两步培养系统 , 那 些 在 起始培养基上产
生的愈伤组织于 30 天后仍未见分化时 , 转移到
87 T
;培养基上以获得再生植株·。 一些品种转移
之后需 1一 6天形成绿色组织 , ’因此 , 培养基需
要 1一 1 天方可获得愈伤组织的再生植株 。 K i -
t t , p a y o n
,
A n g u s
,
T 8 1和 T 8 2的愈伤组织在
87 T
:培养基上分别形成 1 1 . 1 、 7 . 5 、 4 . 5 、 4 . 4 和
2
.
2肠的绿苗 ; 然而 , C h r i s和C e n t u r k 品种却
无分化。 在 1 、 3 、 4 、 2 和 5 号培养基上诱导
的愈伤组织转移到 8 7 T ;培养基上最易产生再生
苗 , 其再生苗分别为 20 . 。 , 1 1 . 3 , 7 . 1 , 6 . 。和
2
.
3肠 。 而 由6 、 7 、 8拍、 10 和 H号培养基诱导出
的愈伤组织转到 8 7 T ,培养基上并不分化 。 小黑
麦 T 82 和小麦 K it t的愈伤组织在87 T `培 养基上
分别诱导 6 . 0和 4 . 5%的白化苗 ,但差异不显著 。
同样 , l号 、 2号培养基产生大约 6 . 。肠 白化苗 ,
而 7号只产生 3务的白化苗 , 其差异也不显著 。
但 P a v 。 二 76 例外 , 其出愈率最高。 A r m s t r o n g
等 ( 1 9 8 7 ) 也发现 P a v o n 7 6对花 药培养最为敏
感 。 小黑麦与小麦相比 , 前者产生较多的 白化
苗而较少的多元单倍体 。 通常 , 小黑麦愈伤组
织的诱导天数要比小麦的长 。
分别含N A A 、 2一 iP 和玉米素的 8 、 g和 10 号
培养基比其它生长素和激动素的培养基形成愈
伤组织和分化所需的时回少 。 然而 , 多元单倍
体的产生 , 该类生长激素在所用浓度情况下影
响不显著 。 -
关于两步成苗 , 把从 6 、 7 、 s 、 9 、 r o和 1 1号培
养基所产生的愈伤组织转移到 87 T I培养基上未
能成苗 。 由此可见 , 去分化培养基可能影响再
生能力· 。 同样情况在首楷上也有报道 (万等 ,
1洲 8) 。 1号培养基比其它培养基产生的 愈 伤
组织多 , 但需要再生培养基 87 T ; , 以形成再生
苗` 结果表明, 实验所用 的 2 . 4 一 D浓 度 可能
抑制绿苗的直接形成 。 叶等 19 8 5年对 2 . 4 一 D在
大麦上的作用有过同样发现 。 因此 ,通过将拟直
接获得幼苗的培养基上的愈伤组织转移到 87 T `
培养基上 , 则可增加绿苗 。
本实验是于单核期采集花药 , 并将所有品
种的花药置于相同的培养基上 。 因此 , 基因型
对白化苗产生的效果是显著的 。 P ay o 7n 6是实
验所用小麦品种中白化苗最多的一个品种 。 关
于基因型对白化苗的影响在其它品种上也有过
报道 (胡 1 9 8 6 ) , 除了基因型和物种特性 (自
花和杂交授粉 ) 的影响之外 , 小抱子的发育阶
段可能影响白化苗的发生 。
由于单倍体育种已成为一个十分有价值的
工具 , 需要对再生多元单倍体染色体加倍进行
研究 , 利用秋水仙碱进行染色体加 倍 费 用昂
贵 , 因为它必须有大量的多元单倍体供加倍所
选用。 本实验大约有 24 肠的再生苗是自然加倍
的多元单倍体。
讨 论 吕 颖 译自 P l
a n t B r e e d i n g 19 9 0
,
1 0 4 , 4 0一 4 5 (英文 ) ,
小黑麦通过花药培养的出愈率高于小麦 , 朱庆麟校 〕