全 文 ：江西农业学报　2007, 19(11):52 ～ 54ActaAgriculturaeJiangxi
蝴蝶兰分子标记技术应用研究进展
谢启鑫 ,缪南生＊ ,李宝光 ,黄冬华 ,倪国平 ,方 荣
　 　收稿日期:2007-08-22
作者简介:谢启鑫(1981-),江西南康人 ,硕士 ,从事植物分子遗传学研究。 ＊通讯作者:缪南生。
(江西省农业科学院蔬菜花卉研究所 ,江西南昌 330200)
摘　要:综述了分子标记技术的主要类型和特点 ,以及分子标记在蝴蝶兰遗传多样性 、分类与亲缘关系、种质资源鉴定等
方面的应用概况。
关键词:蝴蝶兰;分子标记;研究进展
中图分类号:S682.31　文献标识码:A　文章编号:1001-8581(2007)11-0052-03
AdvancesinMolecularMarkersofMothorchid(Phalaenopsis)
XIEQi-xin, MIAONan-sheng＊ , LIBao-guang, HUANGDong-hua, NIGuo-ping, FANGRong
(InstituteofVegetableandFlower, JiangxiAcademyofAgriculturalSciences, Nanchang330200, China)
Abstract:Themaintypesandcharacteristicofmolecularmarkerswereintroduced.Theapplicationofmolecularmarkersingenet-
icdiversity, classification, relationandgermplasmresourcesidentificationofMothorchidwasreviewedinthispaper.
Keywords:Mothorchid(Phalaenopsis);Molecularmarker;Researchadvance
　　蝴蝶兰(Phalaenopsis)又称蝶兰 ,属兰科(Orchidace-
ae)蝴蝶兰属 ,因其花瓣似翩翩起舞的蝴蝶而得名 。蝴蝶
兰属热带气生兰 ,花型奇特优美、花色艳丽、色泽丰富、花
序整齐 、花期长 ,素有 “洋兰皇后 ”的美称 [ 1, 2] 。因其有着
很高的观赏价值和经济价值 ,又是盆栽、切花两用花卉 ,
深受消费者青睐。近年来 ,随着蝴蝶兰在国际市场的日
益走俏 ,其大规模专业化生产呈现蓬勃发展之势 [ 3] 。与
此同时 ,国内外也应用现代生物技术开展了蝴蝶兰的系
列研究 ,集中体现在组培快繁 、栽培生理和基因工程育种
等方面 [ 4, 5] 。
DNA分子标记技术的开发与应用是近年来植物分
子生物学领域的一个研究热点 ,它是继形态学标记 、细胞
学标记和生化标记之后发展起来的一类新型遗传标
记 [ 6] 。与传统的标记相比 ,分子标记具有以下优点:直接
以 DNA的形式表现 ,在植物的各个组织、器官及发育时
期均可检测到 ,不受季节、环境条件限制;数量极多 ,遍及
整个生物基因组;多态性高 ,存在着许多自然的等位变
异 ,不需专门创造特殊的遗传材料;表现为 “中性 ”,即不
影响目标性状的表达 ,与不良性状无必然的连锁。 DNA
标记以其诸多优越性 ,近年来已广泛应用于园艺植物分
子育种研究 [ 7, 8] 。现就 DNA分子标记技术在蝴蝶兰研究
中的应用作简要综述。
1　DNA分子标记的主要类型及其技术特点
1.1　RFLP标记　限制性片段长度多态性(Restriction
fragmentlengthpolymorphism, RFLP)是应用较早的一项
分子标记技术 。它是用限制性内切酶消化生物体的
DNA后 ,用特异探针进行 Southern杂交 ,通过放射自显
影来揭示 DNA的多态性。 RFLP为共显性标记 ,目前主
要应用于遗传连锁图的绘制和目的基因的标记。
1.2　RAPD标记　随机扩增多态性 DNA(Randomam-
plifiedpolymorphicDNA, RAPD)标记是 1990年由 Wil-
liams[ 9]和 Welsh[ 10]分别领导的两个研究小组几乎同时
创建的 ,其基本原理是以基因组为模板 ,以一个随机的寡
核苷酸序列为引物(通常为 10 bp),通过 PCR扩增产生
不连续的 DNA片段 ,来检测 DNA的多态性。该技术操
作简单、费用低 、标记数量多、引物不受限制 ,缺点是重复
性和稳定性差 ,易产生非特异性条带 。
1.3　AFLP标记 　扩增片段长度多态性 (Amplified
fragmentslengthpolymorphism, AFLP)是由 Zabeau等 [ 11]
发明的一项 DNA指纹技术 。其基本原理是利用一个对
基因组 DNA酶切位点少的酶和另一个酶切位点多的酶
组合 ,对基因组 DNA进行酶切 ,再用人工接头与酶切片
段的粘性末端连接作为模板 ,先进行预扩增 ,之后再进行
选择性 PCR扩增 ,最后通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检
测多态性。 AFLP标记的优点是稳定性强 、重复性好 、多
态性高 ,具有显性或共显性;其缺点是步骤繁琐 ,对模板
反应迟钝 ,成本高。
1.4　SSR标记　在真核生物基因组 DNA中广泛存在 1
～ 6个核苷酸组成的短的 、串联的简单重复序列(Simple
SequenceRepeat, SSR), 又称为微卫星 (Microsatel-
lite)[ 12] 。SSR的基本重复单元是由几个核苷酸组成的 ,
重复次数一般为 10 ～ 50次。同一类微卫星 DNA可分布
在基因组的不同位置上 。由于基本单元重复次数的不
同 ,而形成 SSR座位的多态性 。每个 SSR座位两侧一般
是相对保守的单拷贝序列 ,因此可根据两侧序列设计一
对特异性引物来扩增 SSR序列。经聚丙烯酰胺凝胶电
泳 ,比较扩增带的迁移距离 ,就可知不同个体在某个 SSR
座位上的多态性。 SSR标记的最大优点是具有大量的等
位差异 ,多态性十分丰富 ,缺点是必须依赖测序设计引
物 ,而且开发成本高。
1.5　ISSR标记　简单序列重复间区(Inter-simpleSe-
quenceRepeat, ISSR)DNA标记技术是由 Zietkiewicz
等 [ 13]于 1994年提出的 ,该技术检测的是两个 SSR之间
的一段短 DNA序列上的多态性 。利用真核生物基因组
中广泛存在的 SSR序列 ,设计出各种能与 SSR序列结合
的 PCR引物 ,对两个相距较近、方向相反的 SSR序列之
间的 DNA区段进行扩增 。ISSR技术所用的 PCR引物长
度在 20个核苷酸左右 ,因此可以采用与常规 PCR相同
的反应条件 ,稳定性好 。 ISSR标记呈孟德尔式遗传 ,具
显性或共显性特点 ,近年来已被应用于品种鉴定、遗传多
样性分析、基因定位、植物基因组作图等。
2　分子标记在蝴蝶兰研究中的应用
2.1　遗传多样性研究　植物的遗传多样性是物种长期
进化的结果 ,也是人类培育各类优良品种的物质基础 。
蝴蝶兰种质资源丰富 ,分子标记不受环境 、材料来源的限
制 ,利用分子标记技术对种或品种间 DNA水平上的多态
性信息进行统计分析 ,可以了解其在遗传上的同源程度 。
较为全面地掌握现有种质资源的遗传多样性 ,可以减少
育种工作中亲本选配的盲目性 ,从而提高育种效率 。
Been, C.G[ 14]利用 RAPD标记分析了蝴蝶兰 33个种之
间的遗传距离 。试验的 20个引物中有 5个表现出多态
性 ,每个引物扩增到的多态性条带为 11 ～ 20条 ,一共得
到 70条多态性 DNA。 M.W.K.Goh等 [ 15]利用 RAPD
研究了蝴蝶兰 46个种的 149个登入品种的遗传距离和
亲缘关系。结果共筛选到 20个随机引物 ,其中的 6个引
物扩增到 123条多态性 DNA条带 ,平均每个引物为 20.5
条 ,而没有出现非多态性条带 ,多态性比例达到 100%。
2.2　分类及亲缘关系研究　研究蝴蝶兰的分类及亲缘
关系对育种有着重要的指导意义。但由于易受生长环境
及发育阶段的影响 ,仅凭形态学特征来判断其亲缘关系
易受主观因素的影响 ,结果可靠性较低。分子标记所代
表的是基因组 DNA水平上的差异 ,不受外界环境及作物
生长发育阶段的影响 ,因而利用分子标记研究蝴蝶兰的
分类及亲缘关系具有结果客观 、稳定的优点。 Been, C.
G[ 14]对蝴蝶兰开展了组群相关分析 ,结果发现 P.schile-
riana和 P.lineni之间的相似系数最大 ,为 0.75;P.
corningiana和 P.gigantea的相似系数最小 ,为 0.28, 33
个种的平均遗传距离为 0.47。根据通过 UPGMA法则聚
类分析得到的系统树状图 ,可把它们分为 8组。 M.W.
K.Goh等 [ 15]的研究结果表明 ,通过 UPGMA法则对
RAPD多态性数据进行聚类分析 ,可以把供试的蝴蝶兰
分为 7组 ,大部分跟前人建立在形态特征基础上的分类
结果相符。带型结果表明 , P.Doweryensis是 P.gigantea
与 P.kunstleri或 P.cochlearis的杂交种的猜测是错误
的。该研究获得的蝴蝶兰种间亲缘距离可帮助育种学者
更好地获知育种试验的潜在成功率。明凤等 [ 16]利用筛
选到的 25个特异引物对蝴蝶兰不同花色品种作 RAPD
分析 ,确定了 12个品种间的遗传距离;并根据 Neighbor
-joining遗传距离矩阵构建系统聚类文件 ,将该 12个品
种分为 2个家族:第 1家族中包含基色为白色的花色品
种 ,花蕊颜色略有不同;第 2家族为具有条纹的花色品
种。品种间遗传距离最大为 0.7832,最小为 0.1034。
Song-BinChang等 [ 17]采用 RFLP技术研究了蝴蝶兰属
内杂交种以及蝴蝶兰与朵丽兰属间杂交种的叶绿体遗传
模式 。经 DraI酶切后的叶绿体 DNA与 rbcL探针杂交 ,
结果显示 ,分类上同属蝴蝶兰的 P.amabilis、P.aphrodite
以及 P.stuartiana都能获得大小为 2.0kb的限制性核酸
片段 , P.manni和 P.amboinensis都能获得 1条 2.3 kb
的核酸片段 ,而 D.pulcherrima则可得到 1条 3.5 kb的
片段 。属内或属间杂交种均显示叶绿体 DNA为母系遗
传。由此推断 ,叶绿体 DNA可以作为鉴别杂交种母系亲
代和研究分类上系统发生的标记 。ShenTsaiMu等[ 18]利
用 RAPD和 ISSR分析了 11个台湾当地登入的蝴蝶兰和
17个菲律宾蝴蝶兰的遗传差异和内部关系。结果分别
从 200个 RAPD引物和 100个 ISSR引物中分别筛选到
12和 3个引物 ,一共获得了 95个 RAPD标记和 50个 IS-
SR标记 ,根据所得的 RAPD和 ISSR数据进行聚类分析 ,
可把它们分为 6组。据报道 [ 19] ,我国台湾学者曾利用
RAPD分子标记对 16个蝴蝶兰原生种进行分类及其演
化亲缘关系的识别 ,经过对 20个引物所产生的 381条多
态性条带进行分析 ,发现它们之间的相似性系数及亲缘
顺序表现稳定。在形态分类上属于比较远缘的 P.ama-
bilis和 P.equestris、P.mannli和 P.lueddemanniana都显
示出相似性 。由 RAPD分析取得的亲缘树状图 ,再以核
型分析资料进行对比 ,可以推断这些蝴蝶兰的染色体有
由大向小演变的趋势 ,而且彼此间的亲缘关系是多源
性的 。
2.3　种质资源鉴定　最近 10年以来 ,由于蝴蝶兰大规
模商业化生产的开展 ,以及不同地域的相互引种栽培和
杂交育种 ,出现了许多同物异名和同名异物的现象 ,品种
名和品种分类十分混乱。加之育种上仅通过形态观察来
鉴定突变株缺乏分子水平上的依据 ,因此 ,对它们进行分
子水平上的准确鉴定和分析十分必要 ,而分子标记技术
为品种鉴定提供了新手段 。早在 1994年 ,傅仰明等 [ 20]
就进行过蝴蝶兰 DNA增幅指纹技术的研究 ,通过提取和
纯化蝴蝶兰原生种和杂交种的 DNA,设置最佳的 PCR条
件 ,分别进行琼脂糖电泳分析 -溴化乙锭染色 ,或聚丙烯
53　11期　　　　　　　　　　　　　谢启鑫等:蝴蝶兰分子标记技术应用研究进展
酰胺凝胶电泳分析 -银染色 ,建立的 DNA扩增指纹技术
(DNAamplificationfingerprinting, DAF)可作为品种鉴定
的依据 ,用于区分蝴蝶兰原生种或栽培种 ,或者用作品种
鉴定依据以及筛选园艺性状分子标记 。由于台湾蝴蝶兰
在形态上介于 P.amabilis与 P.aphrodite之间 ,难于准
确区分 ,在分类上颇有争议。庄书婷等[ 21]以 RAPD和
ISSR分子标记技术鉴定台湾蝴蝶兰 ,结果发现有 1个引
物在台湾蝴蝶兰基因组 DNA中能扩增到 1条 450 bp大
小的标记片段 ,而作为对照的菲律宾蝴蝶兰没有此片段 ,
说明台湾蝴蝶兰有别于原产菲律宾的 P.amabilis与 P.
aphrodite。 W.H.Chen等[ 22]研究了组织培养获得的蝴
蝶兰品种“TrueLady”的体细胞克隆在形态和遗传上的
变异。所得 1360株开花株的叶形没有明显的不同 ,但部
分花的形状有所变化。他们挑选 38个随机引物用于基
因组 DNA的扩增 。RAPD数据表明 ,正常蝴蝶兰跟变异
株具有遗传差异 ,这为区分蝴蝶兰变异株提供了分子水
平上的依据。
3　存在问题与展望
分子标记是随着遗传学的发展而诞生的 ,它应用于
作物遗传育种已有十几年 ,在水稻 、玉米等作物育种方面
已取得了令人瞩目的进展 。当前 ,分子标记应用于蝴蝶
兰种质资源研究的报道尚不很多 ,且存在着一些值得注
意的问题:一是采用的分子标记方法比较单一 , RAPD标
记由于技术难度和成本都较低 ,使用最多 ,而难度和成本
稍高的 RFLP、ISSR应用较少 , SSR的应用则未见报道 。
然而 , RAPD易受实验条件的影响 ,具有稳定性和重复性
差的缺点 ,因此其试验结果的可靠性也相对较低。如
Been, C.G[ 14]等利用 RAPD标记将供试的蝴蝶兰 33个
种分为 8组 ,但其中只有 2组与 Sweet[ 23]基于形态学的
分类结果相符 。二是蝴蝶兰分子标记研究主要集中于种
质资源遗传多样性 、分类与亲缘关系以及种质资源鉴定
等基础领域 ,目前尚无遗传作图、基因定位与克隆以及分
子标记辅助育种等应用领域的研究。因此 ,今后应瞄准
改良株形、花型、花色 、花香和提高抗逆性等育种目标 ,将
分子标记技术应用到蝴蝶兰的育种实践中来。
蝴蝶兰作为国际花卉市场的新宠 ,其分子标记育种
研究才刚起步 ,但已显示出独特的优越性。分子标记技
术在蝴蝶兰上的应用将有助于鉴定遗传多样性 ,揭示物
种亲缘关系;有助于育种过程中杂交亲本的选配 ,加快对
特定基因型的选择 ,缩短育种周期 ,提高育种效率 ,从而
为蝴蝶兰各方面的研究带来一场革命 。
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