全 文 ：中国药理 学与毒理学杂志
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200 7年 8月 ;2 1 (4 ) :2 7 8一 2 2 8
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ug ;2 1 (4 )
:
2 7 8一 2 2 8
3 P8M A P激酶在山冈囊吾碱肝细胞毒性中的作用
季莉莉` · , , 王峥涛 ’ · , `
( 1
. 上海中医药大学中药研究所中药标准化教育部重点实验室 , 上海 2 0 12 03 ;
2
. 上海中药标准化研究中心 , 上海 2 01 203 )
摘要 : 目 的 探 讨 丝 裂原 活 化 蛋 白激 酶 p 38
( p 38 M A P 激酶 )在山 冈豪吾碱肝 细胞毒性中的作
用 。 方法 采用 W es et m 杂交方法观察山 冈素吾碱
( 10 0 林m o l
·
L
一 ’ , 分另,J作用 1 , 5 , 15 , 3 0 及 6 0 m i n )
对 p 3 8 M A p 激酶激活的影响 : 10 林m o l · L 一 ` p 3 8M A P
激酶抑制剂 S K8F 60 02 预 处理 巧 m in 后 , 分别观察
其对 山冈素吾碱 ( 10 0 林m o l · L 一 ’ )诱导 p 3 8 M Ap 激酶
磷酸化 ( 30 m in , W es et m 杂交法 )及细胞毒性 ( M件
法 , 3 6 及 48 ;h 台盼蓝染 色法 , 36 h) 的影响 。 结果
W e s t e nr b l o t结果显示 , 10 0 林m o l · L 一 ` 山 冈竟吾碱明
显诱导 p38 M A P 激酶的磷酸化激活 , 5 一 30 m in 时
处于较高水平 ; SK8F 60 02 预处理可 以明显抑制 山
冈豪吾碱诱导的 p 38 M A P 激酶磷酸化 ; M竹 染色法
和台盼蓝染色实验均发现 SK 8F 60 02 预处理 能部分
降低 山 冈索吾碱诱导的肝 细胞毒性 〔M rT , 36 h :
( 0
.
2 10 土 0
.
0 8 ) 。 ( 0
.
17 0 士 0
.
X() 3 )
,
4 8 h : ( 0
.
3 3 士
0
.
0 3 ) vs ( 0
.
2 0 0 士 0
.
0 0 3 ) : 台盼蓝染 色 ( 8 0 士 2 ) %
vs ( 7 2
士 7 ) % ; n = 8
,
p < 0
.
0 5 〕。 结论 p 3 8 M A p
激酶可能参与 了山 冈囊吾碱诱导的肝 细胞毒性作
用 。
关键词 : 山 冈素吾碱 ; 肝细胞 ; p 38 M A P 激酶
中图分类号 : Rg% . 2
文献标识码 : A
文 章 编 号 : 10 0 0 一 3 0 0 2 ( 20 0 7 ) 0 4 刃2 7 8习5
物鹿蹄真吾 ( L烤ul ar ia ho 匆on i H o k . ) 中分离得到
的 。 t on ce ine 型肝毒性毗咯里西咙生物碱 ,真吾属部
分药用植物的根及根茎在民间习称为山紫苑或川紫
苑 ,常用来代替紫苑 ( sA et : at at ir cu 、 L . f . ) , 治疗咳
嗽 、 肝炎和其他炎症 , 并收人四川 、 云南等省的地方
标准 。
到目前为止 ,关于山冈真吾碱毒性作用分子机
制的研究并不多见 。 早期的研究报道山冈真吾碱具
有致癌 、 致突变的毒性作用 一 ’ 一 ’ 一 。 近来有研究发现 ,
山冈真吾碱在体内可 以形成与谷胧甘肤和 D N A 结
合的代谢产物 ` 4 一 ’ 二。 本实验室前期的实验研究发
现 , 山冈真吾碱在体外可 以强烈地抑制人正常肝 L -
02 细胞的生长 [ 6」。 进一步的实验观察发现 , 山冈真
吾碱的毒性作用可能与其诱导丝裂原活化蛋白激酶
p 38 ( p 3 8 M A P 激酶 ) 的磷酸化和半胧氨酸天冬氨酸
蛋白酶 ( e a s p a s e ) 3 的活化有关 · 7 一 8 : 。 p 3 s M A P 激酶
的磷酸化激活究竟在山冈真吾碱诱导的肝细胞毒性
过程中起多大作用 , 还是只是细胞对外源刺激的应
激反应? 本研究通过观察 p 38 M A P 激酶抑制剂
SKF 8 6 0OZ 对山冈豪吾碱诱导的 p 38 M A P 激酶的磷
酸化及肝细胞毒性的影响 ,进一步阐明 p 38 M AP 激
酶在山冈真吾碱诱导肝细胞毒性过程中的作用 。
1 材料与方法
山冈崇吾碱 ( C h vo ir n e )是从菊科真吾属药用植
收稿 日期 : 2 0 06 一 1 1一 1 4 接受日期 : 2 0 07一 2一5
基金项目 : 国家自然科学基金重点项目 ( 3 0 5 308 40 )
作者简介 : 季莉莉 ( 197 6 一 ) , 女 , 上海人 ,博士 , 助理研
究员 , 主要从事中药药理与毒理研究 ; 王峥涛 ( 19 56 一 ) , 男 ,
辽宁省朝阳人 ,博士 ,研究员 , 主要从事中药活性成分和质量
控制方面的研究
’ 联 系作 者 E 一 m a i l : w an g z h t @ h o rm a i l . c o m 介一:
( 0 2 1 ) 5 1 3 2 2 5 0 7
,
F ax
:
( 0 2 1 )5 13 2 2 5 19
1
.
1 试剂与仪器
L习 2 人胚肝细胞株 ,购自中国科学院上海生物
化学细胞所细胞库 。
R PM I 16 4 0 细胞培养液购 自 G i b e o 一B R L 生物技
术公司 , 噬 哇蓝 〔3 一 ( 4 , 5 一 d im e th y l t h i a z o l一 2 一 y l ) 一 2 , 5 -
d i p h e n y l t e t r a z o li u m b r o m id e
,
M竹〕为 Am r e s e o 公司
产品 ,新生小牛血清购 自杭州 四季青公司 , p 38 磷
酸化 蛋 白和 p 38 总 蛋 白抗体 购 自 C el S i gan l ign
T e e h n o l o舒 公司 , 山羊抗兔二抗购自 J a e k s o n Im m u -
n o R e s e a r e h 公司 , SK F s 6 0 0 2 和台盼蓝购自 S i g m a 公
中国药理学与毒理学杂志 0 27 0年 8月 ; 2 1( 4 )· 7 2 9·
司 ,石肖酸纤维素膜和预染的标准蛋白分子购自 iB 。 -
Rad 公司 ,化学发光检测系统购自 A m er s ha m Ph盯-
m ac i
a
iB ot ec h 生物技术公司 ,蛋白电泳 、转膜仪及其
电源为 B i o 一 R a d 公司产品 , S p e e t r a m ax l 9 0 酶标仪购
自 M o l e e u l a r D e v i e e 公司 。
1
.
2 细胞培养
L一 2 肝细胞培养于含 10 % 新生小牛血清的
R pM I 16 4 0 培养基中 , 常规加人青霉素 ( 10 0 k u ·
L
一 ’
)与链霉素 ( 10 0 k u · L 一 ’ ) ,于 3 7 ℃ , 5 % e o Z 培养
箱中培养 。 根据不同实验 目的 , 取处于对数生长期
的细胞接种于 % 孔培养板做 M T 实验 ,接种于 6
孔培养板做台盼蓝染色实验 。
1
.
3 M T T 法测定细胞生长
每孔 1 0 0 0 0 个 L刃 2 肝细胞铺人 9 6 孔板中 , 12
h 后待细胞贴壁生长状态良好时加人待测药物 。 山
冈真吾碱组加人 10 林m ol · L 一 ’ 山冈真吾碱 ;对照组
则加人等量 的磷酸盐缓冲液 ; SK F8 6 0 0 2组加人 10
林m o l · L 一 ’ s K F8 6 0 o Z 与细胞孵育 ; SKF 8 6 o 0 2 与山冈
真吾碱共处理组先加人 10 林m o l · L 一 ` SK Fs 6 o 0 2 与
细胞预孵育 巧 m in ,再加人 10 林m ol · L 一 ’ 山冈真吾
碱与细胞孵育 。 各组细胞分别孵育 36 及 48 h 后加
人 10 林L M竹 (终浓度 0 . 5 9 · L 一 ’ )置培养箱反应 4
h
,再加人三联剂 ( 10 % SD S一 5% 异丁醇习 . 0 1 m o l ·
L
一 ’
H C I )在 3 7℃培养箱中溶解 12 h 以上 ,在 5 7 0 n m
处测定吸光值度 ( A ) 。
1
.
4 台盼蓝染色测定细胞活性
每孔 2 x lo , 个细胞铺人 6 孔板 , 12 h 后待细胞
贴壁生长状态 良好时加人待测药物 。 药物浓度及加
人顺序同 1 . 3 。 各组细胞孵育 36 h 后 , 收集孔中所
有细胞 ,用 0 . 2% 台盼蓝染色 10 m in ,在光学显微镜
下计数细胞 , 活细胞不会被台盼蓝染色 ,而死细胞则
会被染成蓝色 。
细胞存活率 (% ) = 活细胞数 / (活细胞数 + 死
细胞数 ) x 10 0%
1
.
5 w es et rn 杂交测定 3P 8 M A P 激酶的磷酸化
每孔 2 x lo , 个细胞铺人 6 孔板 , 12 h 后换含
0
.
1% 牛血清白蛋白无血清的即M l 16 40 培养基 , 2
h 后 ,加人山冈真吾碱 。 在抑制剂阻断实验中先加
人 s K F s 6 0 0 2 ( 10 林m o l · L 一 ’ ) 与细胞预孵育 15 m i n
后再加 山冈真吾碱 ( 1 0 0 林m o l · L 一 ’ ) ,在 3 7℃刺激 3 0
m in 后 , 吸净培养液 , 立 即加人样品缓冲液 ( 62 . 5
m m o l
·
L
一 ’ T五s 一H e l , p H 6 . 5 , 2% S D S , 10% 甘油 , 5 0
m m ol
·
L
一 ’ 二硫代苏糖醇 , 0 . 1% 澳酚蓝 )裂解 ,在冰
上超声波裂解 巧 S , 10 ℃ 水浴 5 m in 变性 。 然后样
品以 10 % s D s 一 P A GE 胶电泳 ,胶上 的蛋白电转移至
硝酸纤维素膜上 。 用含 5 % 脱脂奶 粉和 0 . 1%
T w e n 一。 的 TB s T 溶液封闭之后 , 硝酸纤维素膜先
与 p 38 磷酸化一抗孵育 , 再与辣根过氧化物酶标记
的二抗孵育 。 过氧化物酶活性用增强型化学发光检
测系统检测 ( Am er sha m ) 。 硝酸纤维素膜用洗脱缓
冲液 ( 6 2 . 5 m m o l · L 一 ` T ir s 一H C I , pH 6 . 7 , 10 0 m m o l ·
L
一 ’
2
一琉基乙醇 , 2% SD S ) 洗脱第 l 次 w e s t e m 杂交
分析的抗体 ,再检测总 p 38 蛋白的含量 。 结果用密
度灰度分析软件扫描 X 感光胶片定量 。
1
.
6 统计学分析
数据以 无 士 、 表示 ,用 t 检验进行组间比较 。
2 结果
2
.
1 S K I
,
8 6 0 0 2 对 山冈素吾碱诱导的肝细胞毒性
的影响
从表 I M竹 实验可见 , 孵育 48 h , p 38 M A P 激
酶抑制剂 S KF 8 6O02 对 L一 2 细胞增殖没有明显影
响 ;但以其预处理细胞 巧 m in ,可以在一定程度上降
低山冈真吾碱对 L毛 2 细胞的毒性 。 表 2 台盼蓝染
色实验结果表明 , S KF8 6 002 预处理细胞可 以明显减
少山冈真吾碱诱导的 L习 2 细胞死亡 , 提高细胞存活
率 。
2
.
2 山冈囊吾碱激活肝细胞内 3P 8 M A P 激酶的
磷酸化
从图 1 可见 ,随着山冈真吾碱 ( 10 0 林m ol · L 一 ` )
与肝 L习2 细胞孵育时间的延长 , 细胞内 p 38 M A P
激酶的磷酸化水平不断增加 , 在 1 m in 时 , p 3 8 M A P
T a b 1
.
E l】沁Ct o f S K F 8 6 0 0 2 o n c h v o r i n e 一i n d u c e d
L 刃2 c e l l inj u yr m e a s u r e d b y M T T a s s a y
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C or u P —36 4 8 ( h )C o n t or l 0 . 260 士 0 . 0 0 8 0 . 50 土 0 . 0 4S K F860 02 0 . 2 5 0 土 0 . 00 5 0 . 57 士 0 . 0 5C li v o五n e 0 . 17 0 士 0 . 003 * * 0 . 2 0 0 士 0 . 00 3SK F8600 2 + e liv o ir n e 0 . 2 1 0 士 0 . X() 8 率* 洲 0 . 33 士 0 . 03 * * 洲L一2 h e p a t o e y t e s w e r e p er ter a t e d w i th o r w ith o u t SK F8 600 2 fo r15 m i n , a n d th e n in e u b a t e d w ir h 10 0 林m o l · L 一 ’ e l iv o r in e of r 36o r 4 8 h . 无 士 s , n = 8 . 申 ’ P < 0 . 0 1 , e o m p a r e d w i t h e o n t or l :洲尸 < 0 . 0 1 , e o m p a er d iw t h e l iv o ir n e .
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Co n tro l 88 士 5
S K F860 02 88 士 2
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, a n d th e n s t i m u la t e d w it h ( li v o
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s i s o f im m u n o b l o t
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e o n tor l 脚 u p : 佣 p < 0 . 0 1 , e o m p a er d w irh e l iv o ir n e g r o u p .
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一 w e ll p l a t e s a t th e d e n s i t y of Z x 一。 ,
p e r w e l l a n d s t im u la t e d w ith e li v o ir n e ( 10 0 林m o l
·
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A : p h o s p h o叮 la t io n o f p 3 8 M A P K w a s d e t e r -
m i n e d b y i m m u n ob l
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d e n s i t o m e t r ie a n a ly s is o f im m u n o b lo t
. 肠 n e l : e o n t or l ; l a n e s
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.
x 士 s , n = 3 . ’ . P < 0 . 0 1 , e o m p aer d w i
th e o n otr l 缈 u p .
被明显抑制 , 而细胞内总 p 38 MA P 激酶的蛋白表达
无明显影响 。 进一步证明 , p 38 M AP 激酶特异性抑
制剂 SKF 8 6O0 2 可抑制山冈崇吾碱诱导的 p 38 M AP
激酶的磷酸化激活 , 从而降低山冈真吾碱的细胞毒
性 。
42
.奋
n曰U名dy下的认已
3 讨论
激酶有微弱的磷酸化 ,而在 5 m in 后 p 38 M A P 激酶
磷酸化比较明显 , 并且保持持续的磷酸化激活 , 到
6 0 m in 稍有减弱 , 而山冈真吾碱对细胞内总 p 38 蛋
白表达没有明显的影响 。
2
.
3 S K F 860 02 对山冈囊吾碱诱导的 3P 8 M A P 激
酶磷酸化的影响
从图 2 可见 , 当细胞先与 p 38 M A P 激酶特异性
抑制剂 SK F8 60 2 ( 10 林m o l · L 一 ’ )预孵育 15 m i n 后 ,
山 冈真吾碱诱导 的p 38 M A P激酶的磷酸化激活水平
哺乳动 物 中表达 的丝 裂 原活 化 蛋 白激 酶
( M AP K )主要分为 4 类 :胞外信号调节激酶 ( E RKI /
2 )
,
p 3 8 M Ap 激酶 ( p 3 8留 p / , / 8 ) , e 一 J u n 氨基端激酶
( JN K I 2/ 3/ )和 E RKS ,它们主要将细胞表面受体信
号连接到胞内 ,调控细胞生长 、 分化 、 凋亡等生理病
理过程 〔’ 一 ’ “ 〕 。 文献报道 , p 38 M A P 激酶参与许多不
同外源物质诱导 的细胞凋亡和炎症反应 , 如重金属
锅 、 氧化的低密度脂蛋白 、 高浓度 D 一葡萄糖和砷
等 [ ” 一 ” 〕。 本研究结果表明 , 山 冈真吾碱可以诱导
p 3 8 M Ap 激酶的磷酸化激活 。 SK F8 6 0 0 2 为 p 3 8 M Ap
激酶的抑制剂 , 有研究发现 SK 8F 6 0 02 可以抑制由
紫外线激活诱导的 p 38 蛋白活化而介导的细胞凋
亡 〔 ’ “ 〕 。 本研究结果可见 , s K8F 6 0 o Z 明显降低山冈
中国药理学与毒理学杂志 2 ) X (7年 8月 ;2 1 (4)2 1 8
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`.1J且.`1尸一ìf
聚吾碱诱导的 p 38 M AP 激酶磷酸化水平 , 并部分阻
断山冈真吾碱诱导的 L刃 2 细胞毒性 , 说明 p 38 M A P
激酶信号在山冈臭吾碱所诱导的细胞毒性作用中可
能起一定的调节作用 。 因其不能完全拮抗山冈崇吾
碱的细胞毒性 ,说明可能还有其他细胞内分子信号
通路参与调节山冈真吾碱的细胞毒性 。 上述结果提
示 , p38 M AP 激酶信号通路在山冈真吾碱诱导的肝
L刃 2 细胞毒性过程中发挥了比较重要的作用 。 然
而 M A PK 信号通路中其他信号分子如 E R K 、 JN K 激
酶 ,细胞内的其他信号分子通路如 ca s p as e 级联信号
通路等是否参与了山冈臭吾碱的细胞毒性有待进一
步研究 。 本研究主要是用体外实验研究了山冈真吾
碱的细胞毒性作用机制 , 未考察生物体内的整体调
节作用 ,可能与山冈真吾碱体内毒性作用机制会有
一定的差距 。 因此 , 山冈臭吾碱的体内毒性作用机
制有待进一步探讨 。
[ 7 〕
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(本文编辑 乔 虹 )
· 书评 ·
《D N A eR P ia r , G e n e it c I n s at b ili yt a n d C a n c e r 》
(《D N A 修复 ,遗传不稳定性和癌症 )
癌症已成为人类最重要的死亡原因之一 。 D N A修复在维持细胞遗传稳定性和细胞稳态等方面起着重要的作用 。 D N A 修复失常与癌症发
生有关 ,并且是癌症治疗的重要靶点 。 自上世纪 70 年代起 , D NA 修复一直是生物化学 、遗传学 、毒理学和癌症研究的热门课题 。 19 94 年 “ cS i -
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” 杂志曾评选明星分子作为封面 ,此后有关的研究报告迅速增加 , 方法和概念不断改进 ,更新和扩展 , 取得了大量新的成果 。 美国 T ax as 大
学魏庆义教授 ( Qi n 盯1 We i ) ,李磊 (比 i u )和陈正已 ( D a v i d J C h e n )主编了《 D N A R e p ia r , eG n e t i e I n s tab i li t y an d C a n e e r》 ( 《D N A 修复 , 遗传不稳定
性和癌症 》 )一书 ( W o rl d S e i e n t沮 。 uP b li s hi n g C o . 2X() 7 . P . 3 5 3 ) ,对此进行了全面论述和总结。
该书分为 12 章 ,第 1 章讨论 D N A 损伤的感受和信号转导 ,第 2 一 10 章深人介绍主要的 D N A 修复途径扩分子机制 ,包括碱基切补修复 、 核
昔酸切补修复 、错配修复 、同源重组修复和非同源重组修复 , 第 1 章讨论癌症研究中基因组学和表观基因组学的整合 ,第 12 章讨论 D N A 修复
和癌症易感性的分子流行病学研究 。
该书的 2 位撰写者均为科研第一线的著名学者 , 造诣深厚 。 此书具有 “ 全 ” 和 “ 新 ” 两大特点 , “ 全 ’ 是详细地论述了 D N A 修复的各种途径
的作用和分子机制及与癌症发生中的意义 , “ 新 ” 是不仅介绍了 D N A 修复与癌症基础研究相关的新概念和进展 , 癌症易感性的分子流行病学研
究成果 ,突出了疾病 (癌 ) 一 基础研究 一 人群流行病学研究的结合 。
魏庆义教授是我国 9 73 计划 “ 环境化学污染物 ( EC P 。 )致机体损伤及其防御的基础研究” 首席科学家之一 ,此书出版后魏庆义教授即赠阅
一本 ,通读一遍收益匪浅 ,故特向基础医学界和预防医学界推荐该书 ,并建议能以中文出版 , 以方便国内读者 , 推动我国有关 D N A 修复基础研
究和人群流行病学研究的发展 。 (北京大学医学部 周宗灿 )