全 文 ：江苏农业学报(JiangsuJ.ofAgr.Sci.), 2007, 23(5):410～ 414
葡萄糖氧化酶基因在草地早熟禾转基因植株中的表达
刘慧玲 1, 2 , 　佘建明2 , 　倪万潮 2 , 　袁　生 1
(1.南京师范大学生命科学学院 ,江苏 南京 210097;2.江苏省农业科学院农业生物技术研究所 , 江苏 南京 210014)
收稿日期:2006-11-02
基金项目:浙江省科技厅科研项目(2003C32067);江苏省农业科学
院重点学科领域(研究领域)建设课题(6420301)
作者简介:刘慧玲(1981-),女 ,内蒙古包头人 ,硕士研究生 ,研究方向
为植物基因工程。
通讯作者:倪万潮 , (E-mail)jaasicb@public1.pt.js.cn
　　摘要:　用农杆菌介导法将含有葡萄糖氧化酶基因(GO)和新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)的重组质粒导入草
地早熟禾品种超级伊克利 , 经卡那霉素筛选获得具有卡那霉素抗性的再生植株。 PCR检测证明 , GO基因已整合到
草地早熟禾基因组中。 RT-PCR检测 、淀粉-KI显色反应和 H
2
O
2
定量检测结果均表明 , GO基因在转录和翻译水平
上已得到表达。抗病性鉴定结果显示 ,转 GO基因植株对锈病具有较高的抗性。
关键词:　葡萄糖氧化酶;草地早熟禾;转基因植株
中图分类号:　S688.4　　　文献标识码:　A　　　文章编号:　1000-4440(2007)05-0410-05
ExpressionofGlucoseOxidaseGeneinTransgenicPlantsofKentucky
Bluegras(PoapratensisL.)
LIUHui-ling1, 2 , 　SHEJian-ming2 , 　NIWan-chao2 , 　YUANSheng1
(1.ColegeofLifeScience, NanjingNormalUniversity, Nanjing210097, China;2.InstituteofAgro-biotechnology, JiangsuAcademyofAgriculturalSci-
ences, Nanjing210014, China)
　　Abstract:　ThroughAgrobacterium-mediatedtransformation, therecombinantplasmidcarryingglucoseoxidasegene
(GO)andneomycinphosphotransferasegene(NPTⅡ)wasintroducedintoKentuckybluegrass(PoapratensisL.).Re-
generatedplantswithkanamycinresistancewereobtained.PCRanalysisconfirmedthatGOgenehadbeenintegratedinto
thegenomeofthetransgenicplants.ExpressionoftheGOgenewasverifiedbyRT-PCRandcolorreactionwithKI-starch
andmeasurementofH
2
O
2
content.TheGOtransgenicplantsshowedstrongresistancetorustafterinoculatingleaveswith
Pucciniacoronatavar.coronatacummins.
Keywords:　glucoseoxidase;Kentuckybluegrass(PoapratensisL.);transgenicplant
　　草地早熟禾(PoapratensisL.)属禾本科草本植
物 ,原产欧洲和亚洲北部 。它具有抗寒性强 、绿期
长 、颜色光亮 、草质柔软 、耐践踏和耐修剪等优良性
状 ,为北美地区重要的草种之一。但草地早熟禾易
受多种真菌感染 ,其病害的发生和蔓延 ,轻者可使草
坪褪绿 、黄化 ,形成枯死斑块 ,影响观赏和利用价值;
重者可使整块草坪迅速衰败 ,难以利用 [ 1 ～ 3] 。因此 ,
培育具有广谱抗病性能的草地早熟禾新品种具有重
要的意义 。
葡萄糖氧化酶(GO)是 Muler于 1928年在黑曲
霉提取物中发现的 [ 4] ,可以催化 β -D-葡萄糖氧化生
成葡萄糖酸和 H2O2。此酶已从黄色蠕形霉(Talaro-
mycesflavus)、点青霉(Peniciliumnotatum)和黑曲霉
(Aspergilusniger)中得到纯化 ,目前在植物和动物
中尚未发现能控制该酶的基因。过氧化氢是植物和
病原微生物互作中快速合成的一种早期活性氧 ,可
在植物受到病原微生物侵染后引发的一系列防御反
应中起着非常重要的作用 ,如直接杀死病原菌;氧化
交联细胞壁结构蛋白阻止病菌侵入;作为超敏反应
组织者;诱导植保素生成;通过激活水杨酸合成来诱
410
导防卫系统基因的表达以及最终诱导系统获得性抗
性等[ 5, 6] 。已有研究结果表明 ,将 GO基因转化至马
铃薯 、水稻 、小麦和番茄等作物 ,所获得的转基因植
株对马铃薯软腐病 、水稻稻瘟病 、小麦白粉病及番茄
叶霉病等具广谱抗性 [ 7 ～ 11] 。
本研究在应用农杆菌介导法获得草地早熟禾转
葡萄糖氧化酶基因(GO)工程植株的基础上 [ 12] ,试
图通过过氧化氢定性 、定量测定和抗病性生物学鉴
定 ,选择具有抗病性的草地早熟禾新材料 。
1　材料与方法
1.1　供试品种与受体材料
草地早熟禾品种超级伊克利(PoapratensisL.
cv.totaleclipse)的成熟种子为外植体材料;从种子
诱导产生的颗粒状胚性愈伤组织为农杆菌介导法基
因转化的受体材料。
1.2　质粒与菌株
携带 pBGO的农杆菌菌株 LBA4404由中国农
业科学院生物技术研究所提供 ,质粒 pBGO含有葡
萄糖氧化酶基因(GO)和选择标记新霉素磷酸转移
酶基因 (NPTI), 其 T-DNA区结构示意式为:RB-
Nos.P-NptⅡ-Nos.T-35SP-Ψ-GO-Nos.T-LB。
1.3　再生植株的获得
采用农杆菌介导法将质粒 pBGO导入草地早熟
禾品种超级伊克利 ,经卡那霉素筛选获得具有卡那
霉素抗性的再生植株 。具体方法见参考文献 [ 13] 。
1.4　PCR扩增分析
采用 SDS法从转基因草地早熟禾植株中提取
基因组 DNA,以其为模板进行 PCR扩增 , GO基因的
引物序列为 GOX-1;5′-GTCTTTGGAAATGAGGGCT-
GGAA-3′和 GOX-2:5′-CTCCAGGATGGACTTCATTC-
CGATA-3′。
1.5　RT-PCR
采用 TRIZOL法提取草地早熟禾的总 RNA,用
RQ1 DNase(Promega公司)处理总 RNA,参照 “M-
MLVreversetranscriptase”(Invitrogen公司)的说明
书制备 cDNA第一链 。用于 RT-PCR的基因特异引
物为 GOX-1和 GOX-2。根据持家基因 β -微管蛋白
设计的引物 TUB-1:5′-GTGGAGTGGATCCCCAA-
CAA-3′和 TUB-2∶5′-AAAGCCTTCCTCCTGAACAT-
GG-3′[ 13]作为参照以及检测是否有 DNA污染。
1.6　转基因植株 H2O2的定性及定量检测
取具有卡那霉素抗性的转基因植株和对照非转
基因植株的叶片 ,切成约 1 cm长的片段 ,平铺在经
过高压灭菌的淀粉-碘化钾培养基 (2.5%淀粉 , 50
mmol/L碘化钾 , 1%琼脂)平板上 ,置室温(25 ℃左
右)培养 ,观察叶片颜色的变化。
H2O2的定量测定采用丙酮抽提 ,萃取脱色 , Ti
(IV)-PAR法比色 ,在刘俊等 [ 14]方法的基础之上略
作改动 ,取 1.0g草地早熟禾叶片 ,剪碎后加 3 ml预
冷的丙酮 , 4 ℃, 10 000 g离心 10 min,取 1 ml上清
液 ,加 3ml萃取剂(CCl4∶CHCl3 =3∶1,体积比)混
匀 ,再加 5 ml蒸馏水 ,混匀 , 4 000 r/min离心 ,上层
水相为 H2O2待测液 。取 1 ml待测液 ,另取 1 ml蒸
馏水作为空白对照 ,两组分别加 1 ml0.2 mol/L、pH
7.8的磷酸缓冲溶液 ,再加 1 ml10.2 mmol/L的 Ti
(IV)-PAR显色剂 , 45 ℃水浴保温 20 min,静置 1 h
至室温 ,测 508nm的吸光值。根据 A508值计算 H2O2
的含量 ,采用相同方法 H2O2的标准曲线 。
1.7　转基因植株盆栽抗锈病性鉴定
冠锈菌 (Pucciniacoronatavar.coronatacum-
mins)夏孢子自草地早熟禾锈病发病叶片上收集。
将夏孢子制成悬浮液(低倍镜下每视野 30 ～ 40个孢
子),涂抹于健康的草地早熟禾叶片上 ,套袋保湿 48
h,选用正常生长的非转基因植株为对照 ,置于 25℃
的温室培养。 12d后调查发病情况 。
2　结 果
2.1　PCR扩增分析
采用 SDS法从植株叶片中提取基因组 DNA
作为模板进行 GO基因的 PCR扩增 ,以质粒 pBGO
作为阳性对照 ,以非转基因植株基因组 DNA作为
阴性对照 。扩增产物在 1%琼脂糖凝胶上电泳 ,结
果(图 1)显示 ,阳性对照和转基因植株中扩增出
558 bp的特异性片段 ,而阴性对照中则没有扩增
出目的片段 。
2.2　RT-PCR分析
以草地早熟禾 β-微管蛋白作为参照 ,对 GO基
因的表达进行分析 。结果(图 2)显示 ,转基因植株
中扩增出 558 bp的特异性片段 ,而对照非转基因植
株中则没有扩增出该片段。
411刘慧玲等:葡萄糖氧化酶基因在草地早熟禾转基因植株中的表达
1:阴性对照;2～ 7:转基因植株;8:阳性对照;9:DNA分子量标
准。箭头所示为 558bp的扩增片段。
1:Negativecontrol;2-7:Transgenicplants;8:Positivecontrol;9:
Marker.Arowshowsthe558bpfragmentbyPCR.
图 1　转 GO基因 T0 代植株的 PCR分析
Fig.1　PCRanalysisofT0 generationplantsGOgene
2.3　转基因植株 H2O2的定性及定量检测
转基因植株中 GO基因表达的葡萄糖氧化酶能
将葡萄糖氧化并释放出 H2O2 , H2O2能氧化 KI形成
I2 ,在淀粉存在时显蓝色 ,据此进行 GO基因的定性鉴
定。放置 12h后转基因植株叶片的切口处出现浅蓝
色 , 并随着时间延长而加深 ,范围扩大。对照非转基
因植株的叶片在淀粉 -碘化钾培养基上 48h内无颜色
变化 , 72h叶片切口处呈现浅褐色(图 3)。说明 GO
基因已在蛋白质水平上表达 ,并且能催化葡萄糖氧化
放出 H2O2。试验中还观察到不同株系发生蓝色反应
的时间不同 ,推测其原因可能是 GO基因在不同株系
中表达的时间和强度存在较大的差异。
1:非转基因植株;2 ～ 5:转基因植株;A:558bp片段由 GO基因
特异引物扩出;B:300bp片段是 β-微管蛋白基因引物扩增结果。
1:Non-transgenicplant;2 -5:Transgenicplants;A:The558 bp
fragmentisamplifiedbythespecificGOprimes;B:The300bpfrag-
mentisamplifiedbytheβ-tubulinprimers.
　图 2　转 GO基因 T0代植株的 RT-PCR分析
　Fig.2　RT-PCRanalysisofT0 generationplantsGOgene
A、B:分别为正 、反面观察。每个平皿的上面两排为转基因植株的叶片 ,下面两排为非转基因对照植株的叶片。
A:Positiveviewoftheplate;B:Negativeviewoftheplate.Theleavesintheupperandlowertworowsineachplatearefromtransgenicandnon-trans-
genicPoapratensisL.plants, respectively.
图 3　转 GO基因植株叶片 H2O2的检测
Fig.3　QualitatuiedetectionofincreasedH2O2 productionintheleavesoftransgenicPoapratensisL.plants
　　为了进一步验证 ,采用 TiCl4 -PAR比色法定量
测定 H2O2。结果表明 H2O2 的含量在 102.53
μmol/L与 353.07μmol/L之间 ,均高于非转基因植
株(70.55 μmol/L)。且各转基因株间差异较大。
H2O2含量最高的是非转基因植株的 5倍左右(图
4)。并且 H2O2含量较高的株系在定性检测中也较
412 江 苏 农 业 学 报 　2007年 第 23 卷 第 5期
早出现蓝色反应 ,说明定性和定量检测结果一致。
2.4　转基因植株抗锈病性的鉴定
PCR检测结果为:阳性的盆栽苗接种锈孢子 12
d后 ,非转基因苗出现明显的锈病症状 ,叶片上形成
黄褐色的夏孢子堆 ,部分叶片变黄枯死(图 5A);转
基因植株中 ,仅有少数叶片出现局部病斑 ,并且不再
1:非转基因植株;2～ 5:转基因植株。
1:Non-transgenicplant;2-5:Transgenicplants.
图 4　转 GO基因植株叶片 H2O2含量的检测结果
Fig.4　ContentsofH2O2 intransgenicandnon-transgenicPoa
pratensisL.plants
扩展(图 5B)。
3　讨 论
H2O2不仅对病原菌有直接的杀伤作用 ,而且在
植物 -病原互作中起信号传导作用。在病原侵染早
期 ,氧化激增导致 H2O2的大量产生 ,诱导了一系列
植物防卫基因的表达并最终诱发系统获得性抗性。
本研究将 GO基因转入草地早熟禾品种超级伊克
利 ,获得的转基因植株对叶锈病的抗性比对照明显
提高 ,转基因植株中 H2O2含量均高于非转基因植
株 ,最高的 H2O2含量提高近 5倍 。但高浓度的
H2O2对植物细胞也会造成伤害 ,本研究中就发现得
到的部分转基因草地早熟禾植株不能抽穗开花结
实。推测其原因可能 GO的过量表达导致 H2O2大
量积累产生毒害作用 ,影响了种子形成。前人也有关
于转 GO基因植物发生毒害作用的报道 , 如 GO基因
A:非转基因植株;B:转基因植株。
A:Non-transgenicplant;B:Transgenicplant.
图 5　转 GO基因植株的抗病性鉴定结果
Fig.5　ResistancetoPucciniacoronatavar.CoronatacumminsoftransgenicPoapratensisL.plant
在棉花根中的过量表达会使植株变矮 ,并影响结实
及种子萌发 ,转 GO基因的甘蓝和烟草 ,当组成性表
达时 ,也发生了结籽数减少 ,发芽率降低的毒害作
用 [ 15] 。GO基因的这种毒害作用在不同植物及同一
植物不同发育时期的差异很大 [ 8, 15, 16] 。对于有性繁
殖的植物 ,需要获得结实与发芽均正常的转基因植
株 。而草地早熟禾为兼性无融合生殖方式 ,不会受
这方面的限制 ,在扩繁阶段外源基因也较有性繁殖
的作物稳定。倘若转基因植株能够保持不开花结
实 ,则可以阻断花粉途径的基因漂移 ,不会引发潜在
的生态安全。
前人报道的有关植物体内 H2O2含量的测定方
法主要有 3种:Ferguson的丙酮抽提 , TiCl4 -H2O2比
色法 [ 17] ;Paterson的 5%三氯乙酸溶液抽提 ,活性炭
脱色 , TiCl4 -PAR比色法 [ 18] ;Chen的化学发光法[ 19] 。
本研究采用丙酮抽提 ,萃取脱色 , Ti(IV)-PAR比色
法测定 H2O2含量 ,既克服了 Ferguson方法中背景
物质的干扰 ,又避免了 Paterson方法的活性炭吸附
脱色对 H2O2定量测定的影响 ,同时此方法所用试
剂和仪器较为简单 ,避免了化学发光法复杂试剂和
413刘慧玲等:葡萄糖氧化酶基因在草地早熟禾转基因植株中的表达
昂贵仪器的需求 。因此该方法具有快速 、简便 、准确
的特点 ,更适宜普通实验室测定植物材料中的 H2O2
含量。
本试验接种叶锈病病菌的结果表明 ,转基因草
地早熟禾植株的抗病性明显提高 。 Wu等[ 7] 、彭昊
等 [ 10] 、裴新梧等[ 20]将 GO基因转入马铃薯 、水稻 、香
蕉等作物 ,也得到了抗病转基因植株。说明将 GO
基因应用于植物广谱抗病基因工程是一条切实可行
的途径 。
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