全 文 ：收稿日期：２０１５－０１－１４
基金项目：湖北省自然科学基金科研项目（２０１３ＣＦＢ２２４）；宜昌市科学技术局项目（Ａ１３－３０２ａ－１４）
通信作者：贺海波（１９７２－），男，副教授，博士，硕士生导师，主要从事民族民间药物研究开发与机制研究．Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｅｈａｉｂｏ２５２２１９＠１６３．ｃｏｍ
ＤＯＩ：１０．１３３９３／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ．１６７２－９４８Ｘ．２０１５．０３．０２５
南赤瓟醇提物对裸鼠宫颈癌Ｃａｓｋｉ移植瘤的抑制作用
王爱玲１　王海燕２　覃慧林１　冯天艳３　贺海波１　杨小姣１　邓　为１　汪鋆植１
（１．三峡大学 生物与制药学院 ＆ 湖北省土家医药研究所，湖北 宜昌　４４３００２；２．湖北省宜昌市中医医院 ＆
三峡大学 中医临床医学院，湖北 宜昌　４４３００２；３．神农架聚能药业有限公司，湖北 神农架　４２２４００）
摘要：探讨了南赤瓟醇提物对裸鼠宫颈癌Ｃａｓｋｉ移植瘤的抑制作用，并在此基础上探寻其可能的机
制．将０．３ｍＬ　Ｃａｓｋｉ（４×１０７ 个／ｍＬ）细胞悬液接种于裸鼠右侧后腿背部皮下，接种２次，间隔时间
１周，建立裸鼠宫颈癌Ｃａｓｋｉ移植瘤模型．将移植瘤裸鼠随机分为模型组、南赤瓟醇提物组（２００和
４００ｍｇ／ｋｇ）组，每组５只，每天给药１次，连续给药４周，停药次日处死裸鼠，测量裸鼠体重、移植瘤
体积、瘤重，计算抑瘤率；光镜下观察移植瘤组织形态学变化；Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ－ＦＩＴＣ／ＰＩ染色测定细胞
凋亡率，荧光定量ＰＣＲ测定Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ和Ｃａｓｐａｓｅ－３、Ｃａｓｐａｓｅ－９ｍＲＮＡ表达，并计算Ｂｃｌ－２与Ｂａｘ
比值．结果表明南赤瓟醇提物可显著降低移植瘤体积和抑瘤率，上调Ｂａｘ和Ｃａｓｐａｓｅ－３、Ｃａｓｐａｓｅ－９
ｍＲＮＡ表达，下调Ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ表达和Ｂｃｌ－２与Ｂａｘ比值，与模型组比较具有显著性差异（Ｐ＜
０．０５或Ｐ＜０．０１）．南赤瓟醇提取物对人宫颈癌Ｃａｓｋｉ细胞移植瘤生长具有明显抑制作用，其作用
机制与调节Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ和Ｃａｓｐａｓｅ－３、Ｃａｓｐａｓｅ－９基因表达有关．
关键词：南赤瓟醇提物；　Ｃａｓｋｉ细胞；　裸鼠；　移植瘤；　凋亡
中图分类号：Ｒ２８４　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１６７２－９４８Ｘ（２０１５）０３－０１０８－０５
Ｅｆｆｅｃｔ　ａｎｄ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　Ａｌｃｏｈｏｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｔｈｌｄｉａｎｔｈａ　Ｎｕｄｉｆｌｏｒａ　Ｈｅｍｓｌ
ｏｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｃｅｒｖｉｃａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃａｓｋｉ　Ｃｅｌｓ　ｉｎ　Ｎｕｄｅ　Ｍｉｃｅ
Ｗａｎｇ　Ａｉｌｉｎｇ１　Ｗａｎｇ　Ｈａｉｙａｎ２　Ｑｉｎ　Ｈｕｉｌｉｎ１　Ｆｅｎｇ　Ｔｉａｎｙａｎ３　
Ｈｅ　Ｈａｉｂｏ１　Ｙａｎｇ　Ｘｉａｏｊｉａｏ１　Ｄｅｎｇ　Ｗｅｉ　１　Ｗａｎｇ　Ｊｕｎｚｈｉ　１
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　＆Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｃｈｉｎａ　Ｔｈｒｅｅ　Ｇｏｒｇｅｓ　Ｕｎｉｖ．，Ｙｉｃｈａｎｇ　４４３００２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｔｒａｄｉ－
ｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｃｌｄｉｃｉｎｅ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｈｉｎａ　Ｔｈｒｅｅ　Ｇｏｒｇｅｓ　Ｕｎｉｖ．，Ｙｉｃｈａｎｇ　４４３００２，Ｃｈｉｎａ；３．Ｓｈｅｎｎｏｎ－
ｇｊｉａ　Ｊｕｎｅｎｇ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓｈｅｎｎｏｎｇｊｉａ　４４２４００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ａｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｔｈｌｄｉａｎｔｈａ　ｎｕｄｉｆｌｏｒａ　Ｈｅｍｓｌ　ｏｎ　ｔｈｅ
ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｎｕｄｅ　ｍｉｃｅ　ｗｉｔｈ　Ｃａｓｋｉ　ｃｅｌｓ　ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｔｕｍｏｒ　ｉｓ　ｅｘｐｌｏｒｅｄ．Ｎｕｄｅ　ｍｉｃｅ　ｍｏｄｅｌ　ｗｉｔｈ
ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｔｕｍｏｒ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｃａｎｃｅｒ　Ｃａｓｋｉ　ｃｅｌｓ　ａｒｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ　ｂｙ　ｉｎｊｅｃｔｉｎｇ　０．３ｍＬ　ｃｅｌｓ
（４×１０７）ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｒｉｇｈｔ　ｈｉｎｄ　ｌｅｇ　ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ，ｔｗｉｃｅ　ｆｏｒ　ａ　ｗｅｅｋ．Ｆｉｆｔｅｅｎ　ｎｕｄｅ　ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　３
ｇｒｏｕｐｓ　ｒａｎｄｏｍｌｙ，ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ，ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｔｈｌｄｉａｎｔｈａ　ｎｕｄｉｆｌｏｒａ　Ｈｅｍｓｌ　ｇｒｏｕｐ（２００，４００ｍｇ／
ｋｇ）．Ｅａｃｈ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　５，ｏｎｃｅ　ａ　ｄａｙ　ｆｏｒ　４ｗｅｅｋｓ．Ｔｈｅｎ　ａｌ　ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｓａｃｒｉｆｉｃｅｄ　２４ｈａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｆｉｎａｌ　ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ，
ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｔｕｍｏｒ　ｍａｓｓ　ｖｏｌｕｍｅ　ａｎｄ　ｗｅｉｇｈｔ　ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｔｏ　ｃａｌｃｕｌａｔｅ　ｔｈｅ　ｔｕｍｏｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｒａｔｅ；ｔｈｅ
ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｔｈｌｄｉａｎｔｈａ　ｎｕｄｉｆｌｏｒａ　Ｈｅｍｓｌ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ
ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｔｕｍｏｒ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｕｎｄｅｒ　ｌｉｇｈｔ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ａｆｔｅｒ　ＨＥ　ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ／ＰＩ
ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｃａｓｋｉ　ｃｅｌｓ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ；ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｂｃｌ－２，
第３７卷　第３期
２０１５年６月
三峡大学学报（自然科学版）
Ｊ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ　Ｔｈｒｅｅ　Ｇｏｒｇｅｓ　Ｕｎｉｖ．（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）
Ｖｏｌ．３７Ｎｏ．３
Ｊｕｎ．２０１５
Ｂａｘ，Ｃａｓｐａｓｅ－３ａｎｄ　Ｃａｓｐａｓｅ－９ｍＲＮＡ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ；ａｎｄ　Ｂｃｌ－２／Ｂａｘ　ｒａｔｉｏ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ．Ａｌ－
ｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍＴｈｌｄｉａｎｔｈａ　ｎｕｄｉｆｌｏｒａ　Ｈｅｍｓｌ　ｍｉｇｈｔ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｅｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅ　ｔｕｍｏｒ　ｖｏｌｕｍｅｓ　ａｎｄ　ｔｕｍｏｒ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｒａｔｅ，ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｔｈｅ　ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　Ｂａｘ，Ｃａｓｐａｓｅ－３ａｎｄ　Ｃａｓｐａｓｅ－９，ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｅｘ－
ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　Ｂｃｌ－２ａｎｄ　Ｂｃｌ－２／Ｂａｘ　ｒａｔｉｏ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５　＆Ｐ＜０．０１，
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）．Ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｔｈｌｄｉａｎｔｈａ　ｎｕｄｉｆｌｏｒａ　Ｈｅｍｓｌ　ｅｘｅｒｔｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ
ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｔｕｍｏｒｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｃａｎｃｅｒ　Ｃａｓｋｉ　ｃｅｌｓ　ｉｎ　ｎｕｄｅ　ｍｉｃｅ．Ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｍａｙ　ｂｅ
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｇｅｎｅｓ　Ｂｃｌ－２，Ｂａｘ　ａｎｄ　Ｃａｓｐａｓｅ－９，Ｃａｓｐａｓｅ－３．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｔｈｌｄｉａｎｔｈａ　ｎｕｄｉｆｌｏｒａ　Ｈｅｍｓｌ；　Ｃａｓｋｉ　ｃｅｌｓ；　ｎｕｄｅ　ｍｉｃｅ；　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ
ｔｕｍｏｒ；　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
　　南赤瓟为葫芦科植物 Ｔｈｌｄｉａｎｔｈａ　ｎｕｄｉｆｌｏｒａ
Ｈｅｍｓｌ．的根，又名野南瓜、毛土瓜、球子莲，四棍汝
等，其性味苦，凉，具有清热解毒、理气活血、泻热祛
瘀、消肿散结、止痢通乳的功效［１］，民间主要用于治疗
痈肿、肠炎、痢疾、毒蛇咬伤、通乳及妇科疾病．在前期
研究中，发现南赤瓟水提物和醇提物可显著诱导 Ｈｅ－
ｌａ和Ｃａｓｋｉ细胞凋亡［２－３］．本研究拟在此基础上通过
裸鼠宫颈癌Ｃａｓｋｉ移植瘤模型，观察南赤瓟醇提物对
裸鼠宫颈癌Ｃａｓｋｉ移植瘤的抑制作用，并在此基础上
探寻其可能的机制，以期为其用于宫颈癌的临床治疗
提供实验依据．
１　材料与方法
１．１　南赤瓟醇提物的制备
南赤瓟醇提物的制备参见前期研究报道［３］．实验
时将南赤瓟醇提物干浸膏，实验时用０．５％羧甲基纤
维素钠溶液配成所需浓度．
１．２　实验细胞及动物
人宫颈癌Ｃａｓｋｉ细胞株购自武汉大学中国典型
培养物保藏中心提供；雌性ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ裸鼠１５只，
４～６周龄，体重１８～２２ｇ，由武汉大学动物中心提供，
饲养于ＳＰＦ级动物实验室，裸鼠适应环境１周后即
进行成瘤实验．
１．３　药品及主要试剂
ＲＰＭＩ－１６４０，美国Ｇｉｂｃｏ公司；胎牛血清，杭州四
季青生物材料有限公司；ＨＥＰＥＳ，胰蛋白酶，美国
Ａｍｒｅｓｃｏ公司；Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ－ＦＩＴＣ，晶美生物工程有限
公司；Ｔｒｉｚｏｌ，美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；反转录试剂盒
（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ），日本 ＴａＫａＲａ公司，
Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、Ｃａｓｐａｓｅ－９、Ｃａｓｐａｓｅ－３和ＧＡＰＤＨ（引物序
列见表１）、即用ＰＣＲ扩增试剂盒（Ｔａｐ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙ－
ｍｅｒａｓｅ），生工生物工程（上海）有限公司；其他试剂均
为市售分析纯．
表１　荧光定量ＰＣＲ引物序列
基因名称 上游引物序列 下游引物序列
Ｂｃｌ－２　 ５′－ＴＧＴＧＧＣＣＴＴＣＴＴＴＧＡＧＴＴＣＧ－３′ ５′－ＴＣＡＣＴＴＧＴＧＧＣＴＣＡＧＡＴＡＧＧ－３′
Ｂａｘ　 ５′－ＧＣＧＴＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＧ－３′ ５′－ＡＣＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＴＴＧＧＡＴＣＣ－３′
Ｃａｓｐａｓｅ－３　 ５′－ＴＴＴＧＴＴＴＧＴＧＴＧＣＴＴＣＴＧＡＧＣＣ－３′ ５′－ＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＡＧＡＧＣＣＣＣＧ－３′
Ｃａｓｐａｓｅ－９　 ５′－ＣＣＣＡＣＡＣＡＧＡＴＧＣＴＧＴＴＴＡＣＣＡＴ－３′ ５′－ＧＣＡＣＡＡＣＡＡＡＧＣＡＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣ－３′
ＧＡＰＤＨ　 ５′－ＧＧＧＡＧＣＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＴＣＴＣ－３′ ５′－ＣＣＡＴＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣＴＴＣＣＧＴＴＣ－３′
１．４　方法
１．４．１　细胞培养和动物模型的建立
Ｃａｓｋｉ细胞培养于含１０％新生小牛血清、１０５　Ｕ／
Ｌ青霉素、１００ｍｇ／Ｌ链霉素的 ＲＰＭＩ－１６４０培养基
中，置于３７℃、ＣＯ２ 体积分数为５％的饱和湿度条件
下培养，待Ｃａｓｋｉ细胞贴壁生长，取对数生长期细胞，
制备单细胞悬液，调整密度至４×１０７ 个／ｍＬ，裸鼠于
右侧后腿背部皮下注射０．３ｍＬ／只单细胞悬液，注射
局部出现明显皮丘，一周内注射２次．待肿瘤长出后，
每日测量肿瘤体积，待瘤体生长至大于１００ｍｍ３ 时，
进行实验．
１．４．２　实验分组
待瘤体生长至大于１００ｍｍ３ 后，将裸鼠完全随机
分为３组：模型组，南赤瓟醇提物组（２００ｍｇ／ｋｇ）和南
赤瓟醇提物组（４００ｍｇ／ｋｇ），每组５只，每组灌胃给予
相应的药物，每天１次，连续给药４周．
１．５　观察指标
１．５．１　南赤瓟醇提物对Ｃａｓｋｉ细胞移植瘤裸鼠一般
情况的影响
每３ｄ测量１次裸鼠体重、饮食量、饮水量，每天
９０１第３７卷　第３期　　　　　　　　　　王爱玲，等　南赤瓟醇提物对裸鼠宫颈癌Ｃａｓｋｉ移植瘤的抑制作用
观察裸鼠的精神状态、活动力、反应、肿瘤生长情况、
大便形态等．分组后第２ｄ（ｄ１）开始测量各组移植瘤
的长度（Ｌ）和宽度（Ｗ），每３ｄ测量１次，肿瘤体积
（Ｖ）＝（Ｌ×Ｗ２）／２，以观测时间（ｄ）作为横轴，瘤体积
的均值（ｍｍ３）为纵轴绘制移植瘤生长曲线．
１．５．２　南赤瓟醇提物对Ｃａｓｋｉ细胞移植瘤裸鼠瘤重
和抑瘤率的影响
停药后２４ｈ将裸鼠脱颈法处死，完整剥出瘤组
织，观察各组瘤块情况及有无周围组织浸润，常规剖
腹观察有无腹水及其它脏器转移，称瘤体重量，计算
抑瘤率．抑瘤率＝［１－（治疗组瘤重／对照组瘤重）］×
１００％．
１．５．３　南赤瓟醇提物对Ｃａｓｋｉ细胞移植瘤裸鼠肿瘤
组织细胞凋亡的影响
取瘤组织约１０ｍｍ３，用４℃的ＰＢＳ清洗２次，用
眼科剪反复剪碎组织块后，２００目尼龙网过滤２次，
制成单细胞悬液；取２×１０７ 细胞，用流式细胞仪进行
细胞凋亡检测，具体方法参见Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ－ＦＩＴＣ试剂
盒说明书．
１．５．４　南赤瓟醇提物对Ｃａｓｋｉ细胞移植瘤裸鼠肿瘤
组织形态学的影响
取瘤后，４％多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，ＨＥ
染色后，置于光镜下观察各组裸鼠移植瘤组织的形态
学变化．
１．５．５　 南赤瓟醇提物对肿瘤组织 Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、
Ｃａｓｐａｓｅ－３和Ｃａｓｐａｓｅ－９ｍＲＮＡ表达的影响
用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取移植瘤组织总ＲＮＡ，具体方
法遵照说明书进行，然后将提取的 ＲＮＡ反转录为
ｃＤＮＡ；在ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ处理过的反应管中加入ＳＹＢＲ
Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　ＴａｑＴＭ　ＩＩ（２Ｘ）１２．５μＬ，ＰＣＲ　Ｆｏｒｗａｒｄ
Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）１μＬ，ＰＣＲ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）１
μＬ，ＤＮＡ模板２μＬ，灭菌蒸馏水８．５μＬ，最终反应体
系为２５μＬ．将样品放入实时定量ＰＣＲ扩增仪中按
９５℃预变性３０ｓ、９５℃变性５ｓ、退火３０ｓ、７２℃延伸２０
ｓ条件扩增３０次．利用ＰＣＲ仪汇出扩增曲线，进行结
果分析．
１．６　统计学处理
所有实验数据以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，用
ＳＰＳＳ１５．０软件进行统计分析，组间比较用Ｏｎｅ－Ｗａｙ
ＡＮＯＶＡ分析，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义的
标准．
２　结　果
２．１　南赤瓟醇提物对Ｃａｓｋｉ细胞移植瘤裸鼠一般情
况的影响
Ｃａｓｋｉ细胞接种后第１０ｄ起，裸鼠右侧后腿背部
出现黄豆大小的移植瘤，１５只裸鼠全部成瘤，用药前
各组间平均肿瘤体积大小无显著性差异（Ｐ＞０．０５）．
用南赤瓟醇提物（２００和４００ｍｇ／ｋｇ）治疗后，各组裸
鼠的进食量、饮水、大小便均正常，精神状态良好，活动
正常，反应敏捷，皮肤颜色如常，移植瘤组织未见破溃．
２．２　南赤瓟醇提物对Ｃａｓｋｉ细胞移植瘤裸鼠肿瘤体
积的影响
由图１可见，模型组的移植瘤生长迅速，用南赤
瓟醇提物（２００和４００ｍｇ／ｋｇ）治疗后，肿瘤体积虽然
继续增大，但生长速度明显变缓，从治疗后第７ｄ开
始，与模型组比较，具有显著性差异（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜
０．０１），且随着治疗时间的延长，其疗效愈加明显．
图１　南赤瓟醇提物对Ｃａｓｋｉ细胞移植瘤裸鼠肿瘤体积的
影响（与模型组比较，＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１）
２．３　南赤瓟醇提物对Ｃａｓｋｉ细胞移植瘤裸鼠肿瘤组
织形态学的影响
由表２可知，模型组瘤体积和瘤重明显增加，用
南赤瓟醇提物（２００和４００ｍｇ／ｋｇ）治疗后，其瘤重明
显降低，与模型组比较具有显著性差异（Ｐ＜０．０１）；
其抑瘤率随剂量的增加而逐渐增高，与模型组比较具
有显著性差异（Ｐ＜０．０１）．
表２　南赤瓟醇提物对Ｃａｓｋｉ细胞移植瘤裸鼠瘤重、抑瘤率和细胞凋亡的影响（ｘ±ｓ，ｎ＝５）
组别
剂量
／（ｍｇ·ｋｇ－１）
瘤体积
／ｃｍ３
瘤重
／ｇ
抑瘤率
／％
凋亡率
／％
模型组 － ３．９３±０．３８　 １．８３±０．１５　 ０．００±０．００　 ２．５３±０．３７
南赤瓟醇提物组 ２００　 ２．４６±０．３３＊＊ １．３７±０．１０＊＊ ０．２５±０．１０＊＊ １２．５５±１．８２＊＊
南赤瓟醇提物组 ４００　 １．６１±０．２８＊＊ １．０９±０．１６＊＊ ０．４０±０．０９＊＊ ３７．８０±２．２８＊＊
　　与模型组比较，＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１．
０１１ 三 峡 大 学 学 报（自 然 科 学 版）　　　　　　　　　　　　　　２０１５年６月
２．４　南赤瓟醇提物对Ｃａｓｋｉ细胞移植瘤裸鼠肿瘤组
织细胞凋亡的影响
模型组瘤组织的细胞凋亡率比较低，用南赤瓟醇
提物（２００和４００ｍｇ／ｋｇ）治疗后，其肿瘤细胞凋亡明
显增加，与模型组比较，具有显著性差异，且随着南赤
瓟提取物剂量增加凋亡率提高（Ｐ＜０．０１）（见表２）．
２．５　南赤瓟醇提物对Ｃａｓｋｉ细胞移植瘤裸鼠肿瘤组
织形态学的影响
Ａ．模型组；Ｂ．２００ｍｇ／ｋｇ南赤瓟醇提物组；Ｃ．２００ｍｇ／ｋｇ南赤瓟醇
提物组；ＨＥ染色
图２　南赤瓟醇提物对Ｃａｓｋｉ细胞移植瘤裸鼠
肿瘤组织形态学的影响
　　由图２可见：模型组肿瘤细胞细胞核增大，核呈
２个或多个，大小、形态不一，核仁清晰，染色质增多，
核膜显著增厚；用南赤瓟醇提物治疗后，瘤细胞出现
皱缩，细胞质密集，核染色质边集，可见细胞凋亡，并
有坏死区域出现，而且随南赤瓟醇提物剂量的增加，
凋亡细胞明显增多，坏死区域出现显著增大．
２．６　南赤瓟醇提物对Ｃａｓｋｉ细胞移植瘤裸鼠肿瘤组
织Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ　ｍＲＮＡ表达影响
如表３所示，模型组肿瘤组织中Ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ表
达水平明显增加，Ｂａｘ　ｍＲＮＡ表达水平明显降低；用
南赤瓟醇提物（２００和４００ｍｇ／ｋｇ）治疗后，Ｂｃｌ－２ｍＲ－
ＮＡ表达明显降低，Ｂａｘ　ｍＲＮＡ表达明显升高，Ｂｃｌ－
２／Ｂａｘ的比值降低，与模型组比较具有显著性差异
（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１），且随着南赤瓟醇提物剂量增
加而增强．
表３　南赤瓟醇提物对Ｃａｓｋｉ细胞移植瘤裸鼠肿瘤组织Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ　ｍＲＮＡ表达的影响（ｘ±ｓ，ｎ＝５）
组别 剂量／（ｍｇ·ｋｇ－１） Ｂｃｌ－２／ＧＡＰＤＨ　 Ｂａｘ／ＧＡＰＤＨ　 Ｂｃｌ－２／Ｂａｘ
模型组 － ０．６３±０．０４　 ０．４３±０．０６　 １．４７±０．０９
南赤瓟醇提物组 ２００　 ０．５２±０．０３＊ ０．５９±０．０７＊ ０．８８±０．０４＊＊
南赤瓟醇提物组 ４００　 ０．３８±０．０５＊＊ ０．６３±０．０５＊＊ ０．６０±０．０３＊＊
　　与模型组比较，＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１．
２．７　南赤瓟醇提物对Ｃａｓｋｉ细胞移植瘤裸鼠肿瘤组
织Ｃａｓｐａｓｅ－３、Ｃａｓｐａｓｅ－９ｍＲＮＡ表达的影响
如表４所示，模型组肿瘤组织中 Ｃａｓｐａｓｅ－３、
Ｃａｓｐａｓｅ－９ｍＲＮＡ表达水平明显降低；用南赤瓟醇提
物（２００和４００ｍｇ／ｋｇ）治疗后，肿瘤组织中Ｃａｓｐａｓｅ－
３、Ｃａｓｐａｓｅ－９ｍＲＮＡ表达水平明显升高，与模型组比
较具有显著性差异（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１），且随着南
赤瓟醇提物剂量增加而增强．
表４　南赤瓟醇提物对Ｃａｓｋｉ细胞移植瘤裸鼠肿瘤组织
Ｃａｓｐａｓｅ－３、Ｃａｓｐａｓｅ－９ｍＲＮＡ表达的影响（ｘ±ｓ，ｎ＝５）
组别
剂量
／（ｍｇ·ｋｇ－１）
Ｃａｓｐａｓｅ－３／
ＧＡＰＤＨ
Ｃａｓｐａｓｅ－９／
ＧＡＰＤＨ
空白对照组 － ０．４２±０．０６　 ０．３９±０．０６
南赤瓟醇提物组 ２００　 ０．６２±０．０７＊ ０．５６±０．０５＊＊
南赤瓟醇提物组 ４００　 ０．６８±０．０８＊＊ ０．６７±０．０８＊＊
　　与模型组比较，＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１．
３　讨　论
宫颈癌是临床最常见的妇科恶性肿瘤，由于其恶
性程度高，多易复发，而且死亡率高，使得当前已成为
全球性的公共卫生问题［４］．据 ＷＨＯ统计统计，全球
每年新发宫颈癌病例有５５．５１万，其中我国就有１３．１５
万，占新发病例２８．８％［５－６］．尤其应该关注的是，当前
我国宫颈癌的发病率不仅出现明显的上升趋势，而且
呈现底年龄化．因而，在我国宫颈癌的防治任务显得
尤为艰巨［３，７］．目前在宫颈癌的综合治疗中，除手术、
放疗之外，化疗是防治该肿瘤的重要手段之一，但由
于当前的一线化疗药物费用昂贵，加之毒副作用大，
极大的增加了患者的负担和痛苦．因此，新型的高效、
低毒的化疗药物亟待开发．近年来，许多少数民族地
区流传使用的草药以毒性低、安全范围广、药源丰富
越来越受到人们的关注，已成为肿瘤治疗领域的一大
特色．南赤瓟作为土家族民间草药，主要用来治疗痈
肿、肠炎、痢疾、毒蛇咬伤，通乳及妇科疾病．我们前期
发现其水提物和醇提物可显著诱导 Ｈｅｌａ和Ｃａｓｋｉ细
胞凋亡［２－３］．本研究拟在此基础上通过裸鼠宫颈癌
Ｃａｓｋｉ移植瘤模型，观察南赤瓟醇提物对对裸鼠宫颈
癌Ｃａｓｋｉ移植瘤的抑制作用，并在此基础上探寻其可
能的机制，为此我们设计了此实验．研究发现，南赤瓟
醇提物（２００和４００ｍｇ／ｋｇ）可显著抑制瘤体组织中的
肿瘤细胞增殖，且随南赤瓟醇提物剂量增加，其瘤体
积、瘤重均明显减小，抑瘤率显著增大，与模型组比较
具有显著差异（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）．细胞形态改变
和细胞凋亡是评价抗肿瘤药物的重要依据，本实验通
过 ＨＥ染色和细胞凋亡检测发现，Ｃａｓｋｉ细胞移植瘤
１１１第３７卷　第３期　　　　　　　　　　王爱玲，等　南赤瓟醇提物对裸鼠宫颈癌Ｃａｓｋｉ移植瘤的抑制作用
裸鼠用南赤瓟醇提物治疗后，肿瘤组织的形态学也发
生改变，出现肿瘤细胞凋亡及坏死；流式细胞仪检测
发现，南赤瓟醇提物可显著诱导导肿瘤细胞凋亡，而
且随着其剂量的增加其作用效果愈加明显．实验结果
表明，南赤瓟醇提物对裸鼠宫颈癌Ｃａｓｋｉ移植瘤的生
长具有显著的抑制作用，该作用主要是通过诱导肿瘤
细胞的凋亡来实现的．
总所周知，细胞凋亡是生物体细胞在正常生理或
病理状态下所发生的一种自发的、程序化的死亡过
程，通常情况下，该过程受到生物体信号网络的严密
调控［８－９］．在总舵的调控因素中，Ｂｃｌ－２家族最受备受
关注，通常情况下，Ｂｃｌ－２基因在细胞凋亡的上游发挥
调控作用，它通过和Ｂａｘ结合形成异源二聚体，来抑
制Ｂａｘ的促凋亡作用；当Ｂａｘ表达升高时，由于Ｂａｘ
同源二聚体形成增多，使得细胞凋亡加速；反之，当
Ｂｃｌ－２表达升高时，会加速Ｂａｘ同源二聚体解离，进而
形成Ｂｃｌ－２／Ｂａｘ异源二聚体，发挥抑制细胞凋亡作
用，因此Ｂｃｌ－２／Ｂａｘ的比值常常决定着细胞的存活或
死亡［３］．本研究中，我们发现南赤瓟醇提物可显著地
升高Ｃａｓｋｉ细胞移植瘤裸鼠肿瘤组织中Ｂａｘ　ｍＲＮＡ
表达，降低Ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ 表达和 Ｂｃｌ－２与 Ｂａｘ的比
值．实验结果表明，南赤瓟醇提物对裸鼠宫颈癌Ｃａｓｋｉ
移植瘤的细胞凋亡促进作用可能与其调节Ｂｃｌ－２和
Ｂａｘ基因表达水平有关．
在细胞凋亡的调控通路中，除Ｂｃｌ－２家族参与细
胞凋亡外，细胞质中的Ｃａｓｐａｓｅ蛋白激酶家族在这一
过程扮演了重要角色［１０］．总所周知，在凋亡过程中，
Ｂｃｌ－２家族在细胞凋亡的上游过程发挥作用，而
Ｃａｓｐａｓｅ蛋白激酶家族则在下游发挥作用，在这一过
程中有多种促凋亡和抗凋亡的蛋白相互博弈来决定
着细胞命运．比如，Ｂｃｌ－２家族基因异常表达，使得
Ｂｃｌ－２／Ｂａｘ比值降低，导致线粒体膜通透性增加，使细
胞色素Ｃ从线粒体释放到胞浆中，与凋亡蛋白酶活
化因子－１和Ｃａｓｐａｓｅ－９的前体结合形成凋亡小体，来
激活Ｃａｓｐａｓｅ－９，再酶解Ｃａｓｐａｓｅ－３前体，释放出Ｃ末
端小肽片段，从而活化 Ｃａｓｐａｓｅ－３，然后瀑布式激活
Ｃａｓｐａｓｅ－２，Ｃａｓｐａｓｅ６，Ｃａｓｐａｓｅ８，Ｃａｓｐａｓｅ１０等蛋白激
酶．最终激活脱氧核糖核酸酶，水解核酸和细胞骨架
蛋白，导致细胞凋亡［３，１１－１２］．因此，激活Ｃａｓｐａｓｅ－９及
Ｃａｓｐａｓｅ－３是细胞凋亡的必经之路．本研究中，我们发
现南赤瓟醇提物可显著升高Ｃａｓｋｉ细胞移植瘤裸鼠
肿瘤组织中Ｃａｓｐａｓｅ－９及Ｃａｓｐａｓｅ－３的 ｍＲＮＡ表达
水平，其实验结果与肿瘤组织形态学和细胞凋亡分析
结果一致．
综上所述，南赤瓟醇提物可显著抑制裸鼠宫颈癌
Ｃａｓｋｉ移植瘤的生长，促进瘤体肿瘤细胞的凋亡，且呈
明显的剂量依赖性，并初步证实其机制可能与上调
Ｂａｘ、Ｃａｓｐａｓｅ－９、Ｃａｓｐａｓｅ－３和下调Ｂｃｌ－２凋亡相关的
基因表达有关．．
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［责任编辑　周文凯］
２１１ 三 峡 大 学 学 报（自 然 科 学 版）　　　　　　　　　　　　　　２０１５年６月