全 文 ：◇基础研究 ◇
中国临床药理学与治疗学
中国药理学会主办
CN 34-1206 /R，ISSN 1009-2501
http:/ /www． cjcpt． com
2016 Jan;21(1) :42 － 49
2015-04-16 收稿 2015-08-18 修回
湖北省自然科学基金科研项目(2013CFB224) ;湖北省卫生厅中
医药中西医结合科研项目(2010Z-Y09) ;宜昌市科学技术局项目
(A13-302a-14)
周琴，女，本科，主管药师，研究方向:主要从事中药药理与制剂研
究。
Tel:13607209769 E-mail:591761468@ qq． com
石孟琼，通信作者，女，本科，实验师，研究方向:心脑血管药理。
Tel:0717-6396818 E-mail:shmq0212@ 126． com
南赤瓟醇提物通过 PI3K /Akt /mTOR
信号通路促进人宫颈癌 Caski细胞凋亡
周 琴1，杨小姣2，石孟琼3，刘 英3，覃慧林2，冯天艳4，张永峰2，尉小琴2
1三峡大学仁和医院药学部，宜昌 443002，湖北;2 三峡大学生物与制药学院，
3医学院，宜昌 443002，湖北;4 神农架聚能药业有限公司，神农架 422400，湖北
摘要 目的:研究南赤瓟醇提物影响 PI3K /Akt /
mTOR信号通路促进人宫颈癌 Caski 细胞凋亡的
作用机制。方法:用南赤瓟醇提物(0． 062 5、
0． 125、0． 25、0． 50、1． 00、2． 00 mg /mL)作用 Caski
细胞 24 h 后，检测其对细胞增殖的影响;然后用
南赤瓟醇提物(0． 25、0． 50 和 1． 00 mg /mL)作用
Caski细胞 24 h 后，流式细胞术测定细胞周期
DNA 含量及亚 G1 凋亡峰，ELISA 试剂盒检测
Caski细胞中 Caspase-9 和 Caspase-3 活性及线粒
体和胞浆中细胞色素 C(Cyt C)含量，Real-time
PCR测定 P53、Bcl-2 和 Bax mRNA 表达，并计算
Bcl-2 /Bax 比值，Western blot 测定 PI3K、Akt、
mTOR磷酸化水平(p-PI3K、p-Akt、p-mTOR) ，并
计算 p-PI3K /PI3K、p-Akt /Akt 和 p-mTOR /mTOR
比值。结果:南赤瓟醇提物对 Caski 细胞生长抑
制作用呈明显的剂量依赖性;南赤瓟醇提物
(0． 25、0． 50 和 1． 00 mg /mL)能显著抑制 Caski
细胞增殖，并将其阻滞于 G2 /M 期;可抑制 p-
PI3K、p-Akt 和 p-mTOR 蛋白表达水平，降低 p-
PI3K /PI3K、p-Akt /Akt 和 p-mTOR /mTOR 比值;
上调 P53 和 Bax mRNA表达，下调 Bcl-2 mRNA及
Bcl-2 与 Bax 比值;降低线粒体中 Cyt C 含量，升
高胞浆中 Cyt C含量;增强 Caspase-9 和 Caspase-3
活性(P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01)。结论:南赤瓟醇提物
诱导 Caski 细胞凋亡的作用机制与抑制 PI3K /
Akt /mTOR信号通路磷酸化有关。
关键词 南赤瓟;宫颈癌;Caski 细胞;PI3K /
Akt /mTOR信号通路
中图分类号:R965． 2
文献标志码:A
文 章 编 号:1009-2501(2016)01-0042-08
宫颈癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤之
一，由于其恶变程度高，易复发，且死亡率高，当前
已成为全球性的公共卫生问题［1］。化疗药物在
宫颈癌综合治疗中的作用逐渐得到重视，但常常
由于其毒副作用大而限制其临床应用，而天然药
物以毒性低、安全范围广、药源丰富越来越受到人
们的关注，近年来已成为肿瘤治疗领域的一大特
色。我们的前期研究表明，南赤瓟能诱导 Hela 细
胞凋亡，而且能抑制裸鼠移植瘤生长［2-4］，显示出
了在治疗宫颈癌方面潜在的应用价值，因而阐明
其抗宫颈癌的作用机制，具有重要的理论意义和
应用价值。本研究在前期基础上，从 PI3K /Akt /
mTOR信号通路探寻其诱导人宫颈癌 Caski 细胞
凋亡的作用机制。
1 材料与方法
1． 1 实验药物 南赤瓟药材采自神龙架林区，批
号:20141008，经生物与制药学院王玉兵博士鉴定
为葫芦科植物 Thldiantha nudiflora Hemsl 的干燥
·24·
根，其提取物的制备参见我们前期研究［3］。实验
时用二甲基亚砜(DMSO)溶解南赤瓟醇提物样
品，配制成浓度为 10 mg /mL 药液，再用细胞培养
液稀释，经滤膜(孔径 0． 22 μm)过滤后，置于
4 ℃ 冰箱中保存备用。
1． 2 细胞 人宫颈癌 Caski 细胞株由中国医学
科学院基础医学研究所细胞资源中心提供。
1． 3 仪器与试剂 GENios 酶标仪，瑞士 Tecan
公司;EPICS XL-4 流式细胞仪、荧光检测仪，美国
Backman Coulter 公司;CKX41 倒置显微镜，日本
奥林巴斯公司;NU-4750E 型 CO2 培养箱，美国 Nu
Aire公司;SW-4T-2F 洁净工作台，上海博讯实业
有限公司;HVE-50 灭菌器，日本 Hirayama 公司;
CDF-3220 多元定量 PCR 仪，美国 MJ Research 公
司。RPMI1640 细胞培养基、胎牛血清、胰酶、DM-
SO，美国 Gibco公司;碘化丙啶(PI)、四甲基偶氮
唑盐(MTT) ，美国 Sigma 公司;细胞色素 C(Cyt
C)、Caspase-9 和 Caspase-3 ELISA试剂盒，南京碧
云天生物技术有限公司;Trizol、DEPC，美国 In-
vitrogen公司;即用 PCR 扩增试剂盒(Tap DNA
Polymerase) ，生工生物工程(上海)股份有限公
司;反转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit) ，宝
生物工程(大连)有限公司;P53、Bcl-2、Bax 和 β-
actin引物合成，生工生物工程(上海)股份有限公
司;PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR 抗
体，美国 Santa Cruz 公司;β-actin 抗体，北京博奥
森生物技术有限公司;羊抗兔二抗，北京中杉金桥
生物技术有限公司;总蛋白抽提试剂盒、ECL发光
试剂盒和蛋白含量测定试剂盒(碧云天生物技术
研究所)。
表 1 荧光定量 PCR引物序列
基因名称 上游 下游引物序列 片段长度(bp)
P53 5-GCTCTGACTGTACCACCATCC-3 5-CTCTCGGAACATCTCGAAGCG-3 311
Bcl-2 5-TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3 5-TCACTTGTGGCTCAGATAGG-3 280
Bax 5-GCGTCCACCAAGAAGCTGAG-3 5-ACCACCCTGGTCTTGGATCC-3 311
β-actin 5-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3 5-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3 278
1． 4 方法
1． 4． 1 Caski 细胞培养 将 Caski 细胞培养于
RPMI1640 培养基(含 10%胎牛血清、100 U /mL
青霉素、100 μg /mL 链霉素)中，置于37 ℃、5%
CO2 的培养箱中培养。
1． 4． 2 Caski细胞抑制率检测 将 Caski 细胞制
成 1 × 105 个 /mL 细胞悬浮液，按照每孔 100 μL
接种于 96 孔板中，四周用 PBS 液封，置于 37 ℃、
5% CO2 的培养箱中培养，待细胞贴壁后，更换培
养液。然后将南赤瓟醇提取物(终浓度 0． 0625、
0． 125、0． 25、0． 50、1． 00、2． 00 mg /mL)100 μL 加
入 96 孔板的培养孔中，每个浓度设 5 个复孔，并
设置空白孔(含细胞的培养液 + MTT + DMSO)及
调零孔(培养液 + MTT + DMSO) ，置于 37 ℃、5%
CO2 的培养箱中培养 24 h 后加入 20 μL MTT，继
续培养 4 h 后，吸去上清液，每孔加入 DMSO
150 mL，振荡 15 min 后，用酶标仪测量各孔的吸
光度值 OD (490 nm) ，计算细胞抑制率 =(1 －南
赤瓟醇提物组 OD值 /对照组 OD值)× 100%。
1． 4． 3 细胞周期 DNA 含量及亚 G1 凋亡峰检测
将 用 南 赤 瓟 醇 提 物 (0． 25、0． 50 和
1． 00 mg /mL)处理的 Caski 细胞置于 37 ℃、5%
CO2 的培养箱中培养 24 h 后，收集上清，与用
0． 125%胰蛋白酶消化后的细胞悬液合并，用 PBS
振荡洗涤 3 次，每次 5 min，调整细胞浓度为 1 ×
106 /mL。然后取上述细胞悬液 100 μL，先加入
200 μL 固定、破膜剂混匀，10 s 后再加入 2 mL 含
RNase的 PI 染液混匀，室温暗处避光孵育染色
20 min，经 300 目尼龙网过滤后，进行流式细胞仪
检测，用 488 nm 激发光检测 DNA 含量，用 DNA
Multicycle软件分析细胞周期和凋亡。
1． 4． 4 Caspase-3、Caspase-9 活性检测 将用南
赤瓟醇提物(0． 25、0． 50 和 1． 00 mg /mL)处理的
Caski细胞置于 37 ℃、5% CO2 的培养箱中培养
24 h 后，收集细胞，按照 Ma 等人［5］介绍的方法。
Caski 细胞先用胰蛋白酶消化后收集细胞，
15 000 r /min 离 心 5 min，用 PBS 悬 浮 移 入
1． 5 mL EP管中，同样条件离心洗涤两次，按照每
2 × 106 个细胞加入 100 μL 裂解液的比例加入裂
解液，重悬沉淀，冰浴裂解 15 min。4 ℃ 15 000 ～
·34·中国临床药理学与治疗学 2016 Jan;21(1)
20 000 r /min 离心 10 ～ 15 min。把上清转移到冰
浴预冷的离心管中。取少量样品用 BCA 法测定
蛋白浓度，尽量使蛋白浓度达到 1 ～ 3 mg /mL。按
照试剂盒反应体系加入各种反应物及底物以及抽
提的蛋白样品，37 ℃ 反应 2 h，测定 A405。将 A405
代入回归方程求出 pNA的浓度，并依据蛋白浓度
计算出 Caspase-3、Caspase-9 的酶比活。
1． 4． 5 胞浆和线粒体中 Cyt C 含量检测 将用
南赤瓟醇提物(0． 25、0． 50 和 1． 00 mg /mL)处理
的 Caski细胞置于 37 ℃、5 % CO2 的培养箱中培
养 24 h 后，收集细胞。按照杨敬华等人介绍的方
法［6］。调整细胞浓度至 1 × 106 个 /mL 加入细胞
裂解液，用超声波细胞粉碎机进一步裂解细胞，
匀浆液于 4 ℃ 下 1 500 r /min 离心 10 min，取上
清，再于 4 ℃ 下 15 000 r /min 离心 1 h，所得沉
淀部分为线粒体，上清为胞浆。取线粒体、胞浆样
品，加入 0． 02 mmol /L 连二亚硫酸钠，振摇后，测
定 A520。
1． 4． 6 Real-time PCR 测定 P53、Bcl-2 和 Bax
mRNA表达 将用南赤瓟醇提物(0． 25、0． 50 和
1． 00 mg /mL)处理的 Caski 细胞置于 37 ℃、5%
CO2 的培养箱中培养 24 h 后，收集细胞，用 Trizol
试剂提取心肌细胞总 RNA，按说明书操作。将提
取的 RNA反转录为 cDNA，然后在 RNase Free 处
理过的反应管中加入 SYBR Premix Ex TaqTM II
(2X)12． 5 μL，PCR Forward Primer (10 μmol /L)
1 μL，PCR Reverse Primer (10 μmol /L)1 μL，
DNA 模板 2 μL，dH2O(灭菌蒸馏水)8． 5 μL，最
终反应体系为 25 μL。将样品放入 real-time PCR
仪中按 95 ℃ 预变性 30 s、95 ℃ 变性 5 s、退火
30 s、72 ℃ 延伸 20 s 条件扩增 30 次。利用 PCR
仪汇出扩增曲线，进行结果分析。
1． 4． 7 Western blot 检测 PI3K、p-PI3K、Akt、p-
Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达 将用南赤瓟醇提
物(0． 25、0． 50 和 1． 00 mg /mL)处理的 Caski 细
胞置于 37 ℃、5% CO2 的培养箱中培养24 h后，
收集细胞，用蛋白提取试剂盒提取 Caski 细胞蛋
白，进行蛋白定量后，加样品缓冲液煮沸 5 min，
各取 20 μL 加样;10% ～ 15%聚丙烯酰胺凝胶，
在 120 V、28 mA 条件下电泳 1． 5 h;然后在
100 mA，转膜(PVDF 膜)2 h;5%脱脂牛奶封闭，
分别滴加 PI3K (1 ∶ 500)、p-PI3K(1 ∶ 400)、Akt(1
∶ 500)、p-Akt(1∶ 400)、mTOR(1∶ 400)、p-mTOR(1
∶ 400)和 β-actin(1 ∶ 500) ，4 ℃ 过夜;用 TBS(含
0． 1% Tween 20)冲洗 3 次，每次 5 min，然后用辣
根过氧化物酶标记的二抗(1∶ 1 000)室温下孵育
2 h，用 0． 1% TBST 冲 3 次，每次洗 15 min，ECL
发光检测，用 X 光片显影，扫描图像，计算灰度
值，然后用 β-actin 为内对照标准化后，比较其表
达量的变化。
1． 5 统计学分析 每项实验至少重复 3 次，所有
实验结果的数据以均数 ±标准差(x ± s)表示，所
有数据分析在 SPSS 13． 0 统计软件包上进行，以
单因素方差分析进行多组间差异的比较，以 Dun-
nett-t检验比较两组间的差异;P ＜ 0． 05认为差异
有统计学意义。
2 结果
2． 1 南赤瓟醇提物对 Caski 细胞的生长抑制作
用 南赤瓟醇提物在 0． 062 5 ～ 2． 00 mg /mL 浓
度范围内对 Caski 细胞的生长有显著抑制作用，
而且随着南赤瓟醇提物浓度升高，其抑制作用更
为明显，与空白对照组比较，具有统计学差异(P
＜ 0． 01) ，用 分 析 软 件 算 得 其 IC50 值 为
0． 574 mg /mL，据此在后续实验中，我们选用南赤
瓟醇提物 0． 25、0． 50 和 1． 00 mg /mL 的剂量进行
实验。
表 2 南赤瓟醇提物对Caski细胞生长的影响(x ± s，n =5)
组别
剂量
(mg /mL)
吸光度 抑制率(%)
空白对照组 － 1． 191 ± 0． 04 0． 00 ± 0． 00
南赤瓟醇提物组 0． 0625 0． 986 ± 0． 03 17． 9 ± 0． 03c
0． 125 0． 819 ± 0． 02 32． 4 ± 0． 04c
0． 25 0． 748 ± 0． 04 37． 6 ± 0． 05c
0． 50 0． 642 ± 0． 04 48． 1 ± 0． 04c
1． 00 0． 467 ± 0． 05 61． 2 ± 0． 03c
2． 00 0． 411 ± 0． 04 65． 0 ± 0． 05c
与空白对照组比较cP ＜ 0． 01。
2． 2 南赤瓟醇提物对 Caski 细胞周期及凋亡的
影响 由表 3 和图 1 可见，正常生长的 Caski 细
胞绝大多数处于 G0 /G1 期，G2 /M 期细胞少;用南
赤瓟醇提物(0． 25、0． 50 和 1． 00 mg /mL)处理后，
G0 /G1 期细胞比例减少，在 G0 /G1 期前均出现了
一个亚二倍体峰即凋亡峰(Sub-G1) ，而 G2 /M 期
·44· Chin J Clin Pharmacol Ther 2016 Jan;21(1)
细胞增加，细胞周期被阻滞于 G2 /M期，并呈现出
的量效关系。实验提示，干扰 Caski 细胞分裂增
殖并诱导凋亡可能是南赤瓟醇提物发挥抗肿瘤活
性的重要形式之一。
表 3 南赤瓟醇提物对 Caski细胞周期及凋亡的影响(x ± s，n =4)
组别 剂量(mg /mL) Sub-G1(%) G0 /G1(%) S (%) G2 /M (%)
空白对照组 － 0． 71 ± 0． 31 80． 25 ± 10． 98 10． 91 ± 2． 29 5． 69 ± 1． 96
南赤瓟醇提物组 0． 25 1． 74 ± 0． 25c 72． 45 ± 8． 20 13． 83 ± 3． 65 12． 60 ± 3． 41c
0． 50 2． 90 ± 0． 74c 68． 47 ± 10． 14 14． 44 ± 3． 28 14． 78 ± 3． 87c
1． 00 3． 47 ± 1． 25c 63． 97 ± 9． 78b 15． 71 ± 4． 26 16． 71 ± 1． 75c
与空白对照组比较bP ＜ 0． 05，c P ＜ 0． 01。
图 1 南赤瓟醇提物对 Caski细胞周期及凋亡的影响
A:空白对照组;B:0． 25 mg /mL南赤瓟醇提物;C:0． 50 mg /mL南赤瓟醇提物组;D:1． 00 mg /mL南赤瓟醇提物组。
2． 3 南赤瓟醇提物对 Caski 细胞中 Cyt C 含量
和 Caspase 活性的影响 南赤瓟醇提物(0． 25、
0． 50 和 1． 00 mg /mL)可使 Caski 细胞线粒体中
Cyt C 含 量 分 别 降 低 20． 68%、29． 19% 和
37． 98%，胞浆中 Cyt C 含量分别升高 21． 90%、
39． 52%和 65． 60%;胞浆中 Caspase-9、Caspase-3
活性分别提高 18． 23%、24． 27%、40． 73% 和
19． 87%、27． 13%、39． 13%，与空白对照组比较具
有统计学差异(P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01) ，且其作用效
果随着南赤瓟醇提物浓度的升高而增强(表 4)。
表 4 南赤瓟提取物对 Caski细胞中 Cyt C含量和 Caspase活性的影响(x ± s，n =5)
组别
剂量
(mg /mL)
线粒体 Cyt C
(ng /106 细胞)
胞浆 Cyt C
(ng /106 细胞)
Caspase-3 活性
(相对于对照组%)
Caspase-9 活性
(相对于对照组%)
空白对照组 － 28． 91 ± 2． 86 24． 80 ± 1． 35 100． 43 ± 4． 02 101． 23 ± 7． 64
南赤瓟醇提物组 0． 25 22． 93 ± 1． 07b 30． 23 ± 2． 78b 118． 23 ± 7． 88b 119． 87 ± 7． 89b
0． 50 20． 47 ± 1． 54c 34． 60 ± 2． 33c 124． 27 ± 6． 41c 127． 13 ± 4． 29c
1． 00 17． 93 ± 1． 25c 41． 07 ± 2． 47c 140． 73 ± 4． 07c 139． 13 ± 9． 77c
与空白对照组比较bP ＜ 0． 05，c P ＜ 0． 01。
2． 4 南赤瓟醇提物对 Caski 细胞中 P53、Bcl-2、
Bax mRNA 表达的影响 南赤瓟醇提物(0． 25、
0． 50 和 1． 00 mg /mL)可使 Caski 细胞中 Bcl-2
mRNA表达量降低，P53 和 Bax mRNA 表达水平
升高，Bcl-2 和 Bax 的比值降低，与空白对照组比
较具有明显差异(P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01) ，且其作用
效果随着南赤瓟醇提物浓度的升高而增强(表
5)。
表 5 南赤瓟提取物对 Caski细胞 P53、Bcl-2、Bax mRNA表达的影响(x ± s，n =4)
组别 剂量(mg /mL) P53 /β-actin Bcl-2 /β-actin Bax /β-actin Bcl-2 /Bax
空白对照组 － 0． 467 ± 0． 051 0． 697 ± 0． 064 0． 429 ± 0． 037 1． 631 ± 0． 185
南赤瓟醇提物组 0． 25 0． 571 ± 0． 027b 0． 522 ± 0． 054b 0． 524 ± 0． 024b 1． 002 ± 0． 148c
0． 50 0． 639 ± 0． 034c 0． 468 ± 0． 059c 0． 592 ± 0． 047c 0． 791 ± 0． 097c
1． 00 0． 681 ± 0． 024c 0． 390 ± 0． 036c 0． 644 ± 0． 052c 0． 611 ± 0． 092c
与空白对照组比较bP ＜ 0． 05，c P ＜ 0． 01。
·54·中国临床药理学与治疗学 2016 Jan;21(1)
2． 5 南赤瓟醇提物对 Caski细胞中 PI3K /AKT /
mTOR信号通路蛋白表达影响 南赤瓟醇提物
(0． 25、0． 50 和 1． 00 mg /mL)可使 Caski 细胞中
p-PI3K、p-Akt 和 p-mTOR 蛋白表达水平明显降
低，PI3K、Akt 和 mTOR 蛋白表达水平不变，p-
PI3K /PI3K、p-Akt /Akt和 p-mTOR / mTOR 比值降
低，与空白对照组比较具有明显差异(P ＜ 0． 05，P
＜ 0． 01) ，且其作用效果随着南赤瓟醇提物浓度
的升高而增强(表 6 ～ 8 和图 2)。
表 6 南赤瓟醇提物对 Caski细胞中 PI3K、p-PI3K蛋白表达的影响(x ± s，n =4)
组别 剂量(mg /mL) PI3K /β-actin p-PI3K /β-actin p-PI3K /PI3K
空白对照组 － 0． 527 ± 0． 032 0． 870 ± 0． 034 1． 654 ± 0． 042
南赤瓟醇提物组 0． 25 0． 536 ± 0． 045 0． 709 ± 0． 050c 1． 324 ± 0． 057c
0． 50 0． 522 ± 0． 033 0． 525 ± 0． 034c 1． 006 ± 0． 022c
1． 00 0． 531 ± 0． 018 0． 434 ± 0． 054c 0． 816 ± 0． 076c
与空白对照组比较cP ＜ 0． 01。
表 7 南赤瓟醇提物对 Caski细胞中 Akt、p-Akt蛋白表达的影响(x ± s，n =4)
组别 剂量(mg /mL) Akt /β-actin p-Akt /β-actin p-Akt / Akt
空白对照组 － 0． 764 ± 0． 063 0． 852 ± 0． 022 1． 120 ± 0． 093
南赤瓟醇提物组 0． 25 0． 756 ± 0． 047 0． 664 ± 0． 059c 0． 877 ± 0． 026c
0． 50 0． 774 ± 0． 046 0． 443 ± 0． 067c 0． 571 ± 0． 068c
1． 00 0． 764 ± 0． 070 0． 351 ± 0． 073c 0． 458 ± 0． 071c
与空白对照组比较cP ＜ 0． 01。
表 8 南赤瓟醇提物对 Caski细胞中 mTOR、p-mTOR蛋白表达的影响(x ± s，n =4)
组别 剂量(mg /mL) mTOR/β-actin p-mTOR/β-actin p-mTOR/ mTOR
空白对照组 － 0． 875 ± 0． 035 0． 798 ± 0． 051 0． 911 ± 0． 024
南赤瓟醇提物组 0． 25 0． 885 ± 0． 025 0． 638 ± 0． 047b 0． 720 ± 0． 033c
0． 50 0． 882 ± 0． 044 0． 555 ± 0． 051c 0． 629 ± 0． 028c
1． 00 0． 880 ± 0． 025 0． 417 ± 0． 050c 0． 473 ± 0． 045c
与空白对照组比较bP ＜ 0． 05，c P ＜ 0． 01。
图 2 南赤瓟醇提物对 Caski 细胞中 PI3K /AKT/mTOR
信号通路蛋白表达影响
1:空白对照组;2:0． 25 mg /mL 南赤瓟醇提物组;3:0． 50 mg /mL
南赤瓟醇提物组;4:1． 00 mg /mL南赤瓟醇提物组。
3 讨论
南赤瓟作为土家族习用草药，民间有它来治
疗痢疾、肠炎、虫蛇咬伤、痈肿、乳汁不通等疾病的
传统。在前期研究中，我们发现其提取物可显著
诱导人宫颈癌 Hela细胞凋亡作用，并在裸鼠移植
瘤模型上发现其对人宫颈癌 Caski 细胞移植瘤的
生长具有较好的抑制作用，初步证实了其抗肿瘤
作用与调控细胞凋亡的相关基因有关联［2-4］，但确
切的分子机制尚不清楚。本实验将在前期研究基
础上，从 PI3K /Akt /mTOR 信号通路探寻其诱导
Caski细胞凋亡的作用机制，为此我们进行了本实
验。本实验结果显示，南赤瓟醇提物在不同浓度
(0． 062 5、0． 125、0． 25、0． 50、1． 00、2． 00 mg /mL)
作用 24 h 后对 Caski 细胞生长均有抑制作用，而
且随着浓度的增加，其抑制作用更加明显。实验
·64· Chin J Clin Pharmacol Ther 2016 Jan;21(1)
结果表明南赤瓟醇提物对 Caski 细胞生长具有较
好抑制作用，且存在较好的量效关系。
近年来，随着人们对肿瘤研究的不断深入，越
来越多的肿瘤信号通路被发现介导了肿瘤的发生
发展。比如，MAPK 信号通路、MAPK /ERK 通路、
JNK /SAPK 通路、JAK /STAT 通路、Wnt /β-catenin
信号通路、Notch 信号通路、PI3K /AKT /mTOR 信
号通路和线粒体信号通路等［7-11］。其中，以 PI3K
介导的信号转导通路近年来成为国内外学者关注
的重点。大量的实验和临床研究证实 PI3K /Akt /
mTOR信号通路在肿瘤的发生、发展中起着极为
重要作用［12-14］。综合国内外的文献报道，我们发
现 PI3K /Akt /mTOR信号通路的磷酸化在促进肿
瘤发生、发展的主要机制体现为以下几个方面:①
对肿瘤细胞凋亡通路的直接调节作用:当机体受
到生长因子受体、细胞因子、激素等刺激后，常可
导致 PI3K激活，并在质膜上产生第二信使 PIP3，
然后与细胞内含有 PH 结构域的信号蛋 Akt 和
PDK1 结合，使 Akt 转位于细胞膜并获得催化活
性，引起 BAD 磷酸化受阻和磷酸化 Bcl-2 家族成
员 Bax的 Ser184 位点，负调控促凋亡功能;同时
活化的 Akt可以使 Caspase-9 的 Ser196 位点磷酸
化而失活，抑制其促凋亡作用，从而导致肿瘤的发
生、发展［15-16］。② 对转录因子家族(P53、NF-κB
等)施加影响来发挥促进肿瘤细胞存活:研究发
现，磷酸化 Akt能结合 MDM2 /P53 上的 MDM2，并
磷酸化其 Ser166 和 Ser186 位点，诱导核输入或
上调泛素连接酶的活性，进而促进 P53 的失活或
降解，阻断 P53 介导的促肿瘤细胞的凋亡转录反
应;同时磷酸化的 Akt 使 NF-κB 磷酸化，激活它
的转录功能，使促进细胞存活的 Bc1-2 家族成员
Bcl-xl表达增强，从而促进肿瘤细胞的存活［16-18］。
③ 通过干预细胞周期来促进肿瘤细胞增殖:由于
哺乳类动物 mTOR是 Akt下游的一个重要作用靶
点，它能够被磷酸化的 Akt 活化形成磷酸化的
mTOR，通过激活下游的核糖体激酶 p70s6k 和真
核起始因子 4E 结合蛋白 1(4E-BP-1)通路，促进
特定亚组分的转录和翻译，进而加速蛋白质合成，
促进的肿瘤细胞的增殖、增生。研究表明，mTOR
的活性能够被 PI3K 的抑制剂 Wortmannin 和
LY294002 所抑制，抑制 mTOR 能够阻断其下游
的 p70s6k 与 4E-BP-1 的信号通路，阻滞肿瘤细胞
周期在 G1 期，导致肿瘤细胞生长停滞
［16，19］。④
通过抑制线粒体释放凋亡因子来抑制肿瘤细胞凋
亡:线粒体内包含一些与细胞凋亡有密切关系的
物质，如 Cyt C、AIF、Ca2 +和 ROS 等。研究发现，
磷酸化的 Akt可降低线粒体膜的通透性，有效阻
止线粒体内 Cyt C、AIF 和 ROS 等释放，从而起到
抗肿瘤细胞凋亡的作用［16，20-22］。
为了观察南赤瓟醇提物是否通过抑制 PI3K /
Akt /mTOR信号途径来实现其抗肿瘤目的。在实
验中，我们针对 PI3K /Akt /mTOR信号途径在肿瘤
形成、发展过程中主要机制的各个环节分别进行
了相关指标的检测分析。首先，针对“肿瘤细胞
凋亡通路的直接调节作用”环节，我们进行了
Caski 细胞中 Caspase-9、Caspase-3 活性，PI3K、p-
PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白和 mRNA 表达分
析。研究发现，南赤瓟醇提物可使 Caski 细胞中
p-PI3K、p-Akt 蛋白表达水平和 p-PI3K /PI3K、p-
Akt /Akt的比值显著降低;使细胞中 Caspase-3 和-
9 活性及 Bax mRNA 表达水平明显升高，Bcl-2
mRNA表达水平和 Bcl-2 /Bax 的比值显著降低。
实验证实，南赤瓟醇提物抑制了 PI3K /Akt /mTOR
信号通路，通过干预其对细胞凋亡通路的直接调
节作用来发挥抗肿瘤作用。然后，针对“对转录
因子家族(P53、NF-κB 等)施加影响来发挥促进
肿瘤细胞存活”环节，我们进行了 Caski 中
P53mRNA表达分析，研究发现南赤瓟醇提物可使
Caski细胞中 P53 mRNA 表达水平明显升高。实
验证实，南赤瓟醇提物通过抑制 PI3K /Akt /mTOR
信号通路对 P53 的影响来发挥抗肿瘤作用。其
次，针对“干预细胞周期来促进肿瘤细胞增殖”环
节，我们分别进行 Caski 细胞中 mTOR、p-mTOR
蛋白表达分析及细胞周期和凋亡检测。研究发
现，南赤瓟醇提物可使细胞中 p-mTOR 蛋白表达
水平和 p-mTOR /mTOR 的比值明显降低;可阻滞
Caski细胞增殖周期于 G2 /M 期。实验证实，南赤
瓟醇提物通过抑制 PI3K /Akt /mTOR信号通路，实
现干预细胞周期来抑制肿瘤细胞增殖。最后，针
对“抑制线粒体释放凋亡因子来抑制肿瘤细胞凋
亡”环节，我们用 ELISA方法检测了 Caski胞浆和
线粒体中 Cyt C 含量。研究发现，南赤瓟醇提物
可显著降低线粒体中 Cyt C 含量，明显升高胞浆
中 Cyt C含量。实验证实，南赤瓟醇提物抑制了
·74·中国临床药理学与治疗学 2016 Jan;21(1)
PI3K /Akt /mTOR信号通路，通过促进线粒体释放
Cyt C来促进肿瘤细胞凋亡。
综上所述，本研究证实南赤瓟醇提物有显著
的诱导 Caski 细胞凋亡作用，其机制可能是通过
抑制 PI3K /Akt /mTOR信号通路的磷酸化发挥作
用。
参 考 文 献
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·84· Chin J Clin Pharmacol Ther 2016 Jan;21(1)
Alcohol extraction from Thldiantha nudiflora Hemsl promotes apopto-
sis of human cervix cancer Caski cells through PI3K/Akt /mTOR
pathway
ZHOU Qin1，YANG Xiao-jiao2，SHI Meng-qiong3，LIU Ying3，QIN Hui-lin2，FENG Tian-
yan4，ZHANG Yong-fen2，YU Xiao-qin2
1 Department of Pharmacy，Renhe Hospital，Three Gorges University，Yichang 443002，Hubei，China;2 College
of Biological and Pharmaceutical Sciences，Three Gorges University，Yichang 443002，Hubei，China;3 College
of Medical Sciences，Three Gorges University，Yichang 443002，Hubei，China;4 Shennongjia Juneng Pharma-
ceutical Co．，Ltd，Shennongjia 442400，Hubei，China
ABSTRACT AIM:To investigate the effect of al-
cohol extraction from Thldiantha nudiflora Hemsl on
the apoptosis in human cervix cancer Caski cells and
its influence in PI3K /Akt /mTOR signaling pathway，
and to clarify its possible mechanism． METHODS:
Caski cells were treated with Thldiantha nudiflora
Hemsl (0． 062 5，0． 125，0． 25，0． 50，1． 00，2． 00
mg /mL)for 24 h，its effect on cell proliferation was
detected;After Caski cells were treated with alcohol
extraction from Thldiantha nudiflora Hemsl (0． 25，
0． 50 and 1． 00 mg /mL)at 24 h，the cell cycle of
DNA and the content of sub G1 apoptosis peak were
examined through flow cytometry;the activities of
caspase-9 and caspase-3，and contents of Cyt C in
the mitochondria and cytoplasm were measured by
ELISA assay kit;the mRNA expressions of Bcl-2
and Bax were detected by real-time PCR，and Bcl-
2 /Bax ratio was analyzed． Western blot method was
used to measure the phosphorylation levels of PI3K，
Akt and mTOR (p-PI3K，p-Akt and p-mTOR) ，
and p-PI3K /PI3K，p-Akt /Akt and p-mTOR /mTOR
ratios were analyzed． RESULTS:The inhibitory
effect of alcohol extraction from Thldiantha nudiflora
Hemsl on Caski cells displayed a significant dose re-
sponse;alcohol extraction from Thldiantha nudiflora
Hemsl (0． 25，0． 50 and 1． 00 mg /mL)might sig-
nificantly promote apoptosis，and arrest in G2 /M
phase;inhibit the proteins levels of p-PI3K，p-Akt
and p-mTOR，decrease the p-PI3K /PI3K，p-Akt /
Akt and p-mTOR /mTOR ratios; up-regulate the
mRNA expression levels of P53 and Bax，down-reg-
ulate the expression level of Bcl-2 and Bcl-2 /Bax ra-
tio，decrease the content of Cyt C in the mitochon-
dria，increase the content of Cyt C in the cytoplasm，
and increase the activities of caspase-9 and caspase-
3，when compared with the control group (P ＜
0． 05，P ＜ 0． 01，respectively)． CONCLUSION:
Alcohol extraction from Thldiantha nudiflora Hemsl
can effectively induce apoptosis in Caski cells，and
its possible mechanism may be related to inhibiting
PI3K /Akt /mTOR signaling pathway．
KEYWORDS Thldiantha nudiflora Hemsl;cervix
cancer; caski cells; PI3K /Akt /mTOR signaling
pathway
本文编辑:储冀汝
·94·中国临床药理学与治疗学 2016 Jan;21(1)