全 文 ：formin Hydrochloride． J Pharm Biochem Anal，2009;49(4)∶ 976 ～ 982
11 Wang C，Kong HM，GuanYF，et al． Plasma sphospholipid metabolic
profiling and biomarkers of type 2 diabetes mellitus based on hight perform-
ance liquid chromatographe electrospray mass spectrometry and mutivariate
stastical analysis． Anal Chem，2005;77(13)∶ 4108 ～ 4116
Metabonomics study on the plasma of diabetes rats administrated with total alkaloids from Ｒhizoma Coptidis
Zhang Qiyun，Tang Xilan，Li Bingtao，Li Jia，Tu Jun，Shang Guangbin，Liu Hongning，Xu Guoliang
(Ｒesearch Center for Differentiation and Development of Basic Theory of TCM，University of Jiangxi TCM，Nanchang 330004)
Objective:To study the of the plasma of diabetes rats administrated with total alkaloids from Ｒhizoma Coptidis． Methods:The diabetic
rats model was established by single intraperitoneal injection of streptozotocin 50 mg /kg ． The fasting time of diabetic rat model was screened．
SD rats had been successively administrated total alkaloids from Ｒhizoma Coptidis (578． 7mg /kg and 192． 9 mg /kg )for 68 days． Plasma
was acquired，then detected by LC /MS /MS，at last data was analyzed by PCA，OSC-PLS． Ｒesults:The diabetes rats administrated with total
alkaloids after 68 d，there was obvious difference in the content of endogenous substances among the positive drug group and the two adminis-
trated groups，the overall content level of endogenous substances in the two groups returned to that of the control group，but the difference of
that between the two administrated groups was not obvious． The endogenous substances m /z values as 496． 4，524． 5 the potential biomakers．
Conclusion:The total alkaloids(578． 7mg /kg and 192． 9 mg /kg)could significantly influence the content of endogenous substances in plas-
ma in diabetes rats，and caused the content level corresponding endogenous substance and return in the direction of control group levels in
rats．
Key words total alkaloids from Ｒhizoma coptidis(黄连总生物碱);metabonomics;diabetes
吉祥草乙酸乙酯部位对人宫颈癌 Caski细胞抑制作用及 COX-2 基因表达
与 BCl-2 蛋白家族关系的研究*
白彩虹，邹 坤，贺海波＊＊，王玉婷，汪鋆植，杨 进
(三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室，宜昌 443002)
摘 要 目的:研究吉祥草乙酸乙酯部位对人宫颈癌 Caski细胞抑制作用及可能的作用机制。方法:用不同浓度的吉祥草乙
酸乙酯部位( 3． 125、4． 6875、6． 25、9． 375、12． 5、18． 75、25． 0、50． 0 μg /ml) 处理宫颈癌 Caski细胞 24h后，采用MTT 法检测不同浓度的
吉祥草乙酸乙酯部位在不同作用时间下对 Caski细胞增殖率的影响;用 12． 5、25． 0 和 50． 0 μg /ml 的吉祥草乙酸乙酯部位处理人宫
颈癌 Caski细胞不同作用时间( 4、8、12、24、48h) 后，MTT 法检测其对细胞活力的影响，Hoechst33258 染色检测其对细胞凋亡的影响，
ＲT-PCＲ测定 COX-2、BCl-2 和 Bax mＲNA表达，并计算 BCl-2 与 Bax的比值。结果:吉祥草乙酸乙酯部位在 3． 125 ～ 50． 0 μg /ml 浓
度范围内对 Caski细胞的生长抑制作用呈明显的时间-剂量依赖性，当药物浓度达到 50． 0 μg /ml时，抑制率达到最大到 58． 4%，并且
经 IC50分析软件进行计算其 IC50值为 35． 29 μg /ml;吉祥草乙酸乙酯部位( 12． 5、25． 0 和 50． 0 μg /ml) 处理能显著抑制 Caski细胞增
殖，促进其凋亡( P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01) ，当药物浓度为 50． 0 μg /ml，作用时间 48h时，其抑制率高达 98． 9% ; 上调 Bax mＲNA表达，下
调 COX-2、BCl-2 mＲNA表达和 BCl-2 与 Bax的比值。结论:吉祥草乙酸乙酯部位有显著的抑制 Caski细胞增殖和诱导凋亡作用，其
作用机制可能与其上调 Caski细胞 Bax mＲNA表达，下调 COX-2、BCl-2 mＲNA表达和 BCl-2 与 Bax 的比值有关。
关键词 吉祥草乙酸乙酯部位;宫颈癌;Caski细胞;凋亡;COX-2
宫颈癌(cervical cancer)是全球妇女中仅次于乳腺癌的第
二大肿瘤，其死亡率居女性恶性肿瘤的首位，尤其是在发展中
国家［1，2］。据 WHO统计数据显示，全球每年约有 50 余万新发
病例，仅我国就约占了 1 /3，而且这一发病率近年来呈现持续上
升趋势，并且日趋年轻化、白领化，因而我国的宫颈癌防治任务
仍十分艰巨［3，4］。吉祥草为百合科吉祥草属植物吉祥草 Ｒei-
neckia carnea (Andr．)Kunth的全草，是百合科植物中的单种属
植物［5］。具有润肺止咳、祛风、接骨的功效，其主要有效成分为
皂苷类［6］。在前期研究中，通过分析吉祥草的总提物及不同萃
取部位对人宫颈癌 Caski 细胞的抑制作用，我们发现吉祥草石
油醚部位和乙酸乙酯部位均能明显抑制 Caski 细胞的增殖，其
中以乙酸乙酯部位作用最强［7］。本实验拟进一步观察吉祥草
54中药药理与临床 2013;29(6)
* 国家自然科学基金资助项目民族民间药用植物吉祥草中基于线粒体途径诱导 CASKI 细胞凋亡活性皂苷的成分解析及其抗肿瘤作用机制
研究，项目号: 21272136 ＊＊通讯作者
DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2013.06.015
乙酸乙酯部位对 Caski 细胞的体外增殖抑制作用，并探讨其可
能的作用机制，为其临床应用提供理论基础和实验依据。
1 材料与方法
1． 1 试验药物 吉祥草根茎采自湖北省长阳土家族自治县乐
园乡，经三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室杨进
副教授鉴定为百合科吉祥草 Ｒeineckia carnea (Andr．)Kunth。
植物标本现保存于三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点
实验室(标本编号:20121023)。吉祥草乙酸乙酯部位的制备:
样品切成小片，以 95%乙醇为溶剂，在 65℃条件下常压回流提
取，提取液过滤后用旋转蒸发仪浓缩(温度:55℃)，得深棕色浸
膏，将浸膏在通风橱中挥干至无醇味，加入蒸馏水于所得浸膏
中，混悬至完全溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和的正丁醇
萃取。每次加入等体积的萃取液与水混匀，超声萃取 2h待两相
分层后，利用虹吸法原理将上层的萃取液吸出，在旋转蒸发仪
上浓缩并回收萃取液，回收后的溶剂继续用于萃取。合并每一
种萃取溶剂的萃取物，于通风橱中挥干溶剂，用 DMSO 配成
1mg /ml的储备液，经 0． 22 μm 滤膜过滤除菌后，用培养基配成
相应的浓度，备用。阳性药丝裂霉素购于浙江海正药业股份有
限公司，用二甲基亚砜配成 250mg /ml储备液备用。
1． 2 细胞株 人宫颈癌细胞(Caski)购自武汉大学中国典型培
养物保藏中心，并由本实验室传代保种。
1． 3 试剂 ＲPMI-1640，美国 Gibco 公司;胎牛血清，杭州四季
青生物材料有限公司;HEPES，胰蛋白酶，四甲基偶氮唑盐
(MTT)，二 甲 基 亚 砜 (DMSO)，美 国 Amresco 公 司;Ho-
echst33258，碧云天生物技术研究所;PCＲ引物，上海生物工程公
司合成;Trizol，美国 Invitrogen 公司;即用 PCＲ 扩增试剂盒(Tap
DNA Polymerase)，生工生物工程(上海)有限公司;反转录试剂
盒(PrimeScript ＲT reagent Kit)，日本 TaKaＲa 公司，BCl-2、Bax、
COX-2 以及 GAPDH引物(上海生工生物工程有限公司合成)。
1． 4 仪器 3111 CO2 培养箱，美国 Thermo;Olympus KX41 型倒
置显微镜，美国 Thermo;Stat Fax-2100 型酶联酶联免疫检测仪，
美国 Awareness;NIKON TE2000 型荧光倒置显微镜，上海横桥仪
器有限公司;EDC-810 型基因扩增仪，东胜国际贸易有限公司;
电泳仪，北京市六一仪器厂;凝胶电泳成像分析系统，美国 Bio-
ＲAD。
1． 5 方法 Caski细胞用 ＲPMI-1640 培养液培养(另加 2． 0g /L
HEPES、2． 0g /L NaHCO3、100U /ml 青霉素、100μg /ml 链霉素和
10%胎牛血清)，于孵箱中 37 ℃、5 % CO2饱和湿度下培养。细
胞单层长到 80%时，用 0． 25%的胰蛋白酶消化，传代。
1． 5． 1 吉祥草乙酸乙酯部位不同药物浓度对细胞生长的影响
取对数期生长的 Caski细胞，调整细胞悬液浓度并以 1 × 105
个 /ml接种于 96 孔板中，每孔 100μl，四周用 PBS 液封，于孵箱
中 37 ℃、5 % CO2饱和湿度下培养 12h 待细胞贴壁后，更换培
养液，将吉祥草乙酸乙酯部分提取物配制成 8 个浓度梯度(终
浓度 3． 125、4． 6875、6． 25、9． 375、12． 5、18． 75、25． 0、50． 0 μg /
ml)，每孔加入浓度梯度药物 100 μl，每个浓度梯度设 6 个复孔，
并设置空白孔(含细胞的培养液 + MTT + DMSO)、阳性药物孔
(含细胞的培养液 +丝裂霉素 + MTT + DMSO)及调零孔(培养
液 + MTT + DMSO)。37℃、5% CO2 饱和湿度下培养 24h 后加
入 20μl MTT，继续培养 4h 后终止培养，取出 96 孔板小心移走
孔内液体，每孔加入 DMSO 150ml。置摇床上低速振荡 10 min
后，用酶标仪于 490 nm 处测量各孔的吸光度值(OD490nm)根
据公式:细胞抑制率 =(1-药物孔 OD值 /空白孔 OD值)× 100%
计算细胞抑制率。
1． 5． 2 吉祥草乙酸乙酯部位不同作用时间对细胞生长的影响
取对数期生长的 Caski细胞，调整细胞悬液浓度并以 1 × 105
个 /ml接种于 96 孔板中，每孔 100 μl，四周用 PBS液封，于孵箱
中 37 ℃、5 % CO2饱和湿度下培养 12h 待细胞贴壁后，更换培
养液，依据1． 5． 2确定的抑制 Caski 生长的最佳浓度(12． 5、
25． 0、50． 0 μg /ml)，进行药物作用时间(4、8、12、24、48h)的细胞
活性测试，其他实验步骤同1． 5． 2。
1． 5． 3 吉祥草乙酸乙酯部位对细胞形态的影响 将 Caski 细
胞调整细胞悬液浓度并以 2 × 105 个 /ml接种于 24 孔板中，于孵
箱中 37℃、5% CO2饱和湿度下培养 12h 待细胞贴壁后，加入
12． 5、25． 0、50． 0 μg /ml吉祥草乙酸乙酯部位培养 48h 后，将细
胞置于倒置显微镜下观察拍照。
1． 5． 4 Hoechst33258 检测吉祥草乙酸乙酯部位对凋亡细胞形
态的影响 将 Caski细胞调整细胞悬液浓度并以 2 × 105 个 /ml
接种于 24 孔板中，于孵箱中 37℃、5% CO2饱和湿度下培养 12h
待细胞贴壁后，加入 12． 5、25． 0、50． 0 μg /ml 吉祥草乙酸乙酯部
位培养 48h后，吸尽培养液，加入 4%多聚甲醛固定液固定细
胞，固定 10min。去固定液，用 PBS 洗两遍，每次用摇床平摇 3
分钟，吸尽液体。加入 0． 05mg /ml 的 Hoechst33258 染色液，室
温染色 5 min。用 PBS 洗两遍，每次 3 min，晾干，激发光波长
450 nm，发射光波长 490 nm。荧光显微镜下观察凋亡细胞形态
学变化。
1． 5． 5 吉祥草乙酸乙酯部位对 COX-2、BCl-2、Bax mＲNA 表达
的影响
1． 5． 5． 1 细胞总 ＲNA提取 将 Caski细胞，调整细胞悬液浓
度并以 2 × 105 个 /ml接种于 6 孔板中，于孵箱中 37℃、5% CO2
饱和湿度下培养 12h 待细胞贴壁后，加入 12． 5、25． 0、50． 0 μg /
ml吉祥草乙酸乙酯部位培养 48h 后。提取 Caski 细胞总 ＲNA，
将 Caski细胞调整细胞悬液浓度并以 2 × 105 个 /ml接种于 6 孔
板中，于孵箱中 37℃ 、5% CO2饱和湿度下培养 12h待细胞贴壁
后，加入 50、25、12． 5μg /ml 吉祥草乙酸乙酯部分提取物培养
24h后，每孔加 Trizol 1 ml，室温放置 5min;吸取细胞裂解液于
1． 5 ml无 ＲNase的离心管中，然后 4℃ 12000rpm，离心 5min 取
上清 950μl，加 0． 2 ml 氯仿摇匀，室放置 15min，过后再次 4℃
12000rpm 15min离心后取上层水相移至新无 ＲNase 的离心管
中，加入 0． 5 ml 异丙醇摇匀，室温放置 10min，随后 4℃
13200rpm，离心 15min，去上清，加入 1 ml 75%乙醇洗涤沉淀，最
后 4℃ 13200rpm，离心 20min去上清，室温晾干。每管加入 20μl
Elution Buffer 溶解样品。用核酸测定仪计算其 ＲNA 含量，
OD260nm /OD280nm分析其纯度。
1． 5． 5． 2 逆转录反应 先将 DEPC 处理水配制的 Oligo dT18
(10 nmol / l)与 DEPC 处理水配制的总 ＲNA(0． 1mg / l)按体积比
1:1 混合于无 ＲNase 的离心管中，70℃孵育 5 min，4 ℃冷却 2
min。吸取上述混合液 20 μl加入无 ＲNase的离心管管中，振荡
混匀，快速离心数 10 秒，置 PCＲ 循环仪中，42 ℃逆转录反应 60
min，然后 94℃终止反应 5 min。
1． 5． 5． 3 PCＲ 扩增 PCＲ 引物采用在线软件 Primer Premier
6． 0 进行设计。BCl-2 上游引物:5＇-GGTGAACTGGGGGAGGATT-
64 中药药理与临床 2013;29(6)
GT -3＇，下游引物:5＇-CTTCAGAGACAGCCAGGAGAA -3＇;Bax上游
引物:5＇- TTCCGAGTGGCAGCTGACAT -3＇，下游引物:5＇- TTCCA-
GATGGTG- AGTGAGGC -3 ＇;COX-2 上游引物:5 ＇- CTGTATC-
CCGCCCTGCTGGTG -3 ＇，下游引物:5 ＇- ACTTGCGTTGATGGTG-
GCTGTCTT -3 ＇;GADPH 上游引物:5 ＇- CGGATTTGGTCGTATT-
GGG -3＇，下游引物:5＇- TCTCGCTCCTGGAAGATGG -3＇。PCＲ 反
应如下:25μl反应总体积，取 cDNA 2μl，加 10 × PCＲ buffer 2． 5
μl，25 mmol / l MgCl2 1． 5 μl，10 mmol / l dNTP 0． 5 μl，5U /μl MBI
DNA聚合酶 0． 2 μl，BCl-2(或 Bax，COX-2)及 GAPDH上下游引
物各 0． 2 μl，灭菌水 16． 6 μl。反应条件:Bax 和 BCl-2:95 ℃预
变性 5min，94 ℃ 变性 45s，55℃退火 30s，72℃ 延伸 1min，72℃
终末延伸 8min，35 个循环;COX-2:95 ℃预变性 5min，94 ℃变性
45s，56℃退火 30s，72℃延伸 1min，72℃终末延伸 8min，35 个循
环;GAPDH:95 ℃预变性 5min，94℃变性 45s，55℃退火 30s，
72℃延伸 1min，72℃终末延伸 8min，28 个循环。
1． 5． 5． 4 PCＲ产物的分析 取 6μl PCＲ 反应产物上样于 1． 5
%琼脂糖凝胶(含 0． 5 μg /ml 溴化乙啶)梳孔中，采用 0． 5 × TBE
电泳缓冲液，以 3 ～ 5V/cm 电压条件下电泳 50min。将凝胶转移
至凝胶分析系统暗箱中，在紫外线照射下测定 PCＲ 扩增产物的
荧光强度值(结果表示为:被检测基因扩增产物荧光强度值 /相应
GAPDH扩增产物荧光强度值 ×100%)，比较其表达量的变化。
1． 5． 6 统计分析 每项试验至少重复 3 次，所有实验结果的
数据以均数 ±标准差(x ± s)表示，数据分析在 SPSS13． 0 统计软
件包上进行，以单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多组间
差异的比较，以 Dunnett-t检验比较两组间均数的差异，P ＜ 0． 05
说明差异具有统计学意义。
2 结果
2． 1 吉祥草乙酸乙酯部位不同药物浓度对 Caski 细胞生长的
影响 吉祥草乙酸乙酯部位对 Caski 细胞有明显的抑制作用，
如表 1 所示，吉祥草乙酸乙酯萃取部位在 3． 125 ～ 50 μg /ml 浓
度范围内对 Caski细胞有明显的抑制作用，且呈良好的剂量依
赖关系，由表可以看出当药物浓度为 50 μg /ml时细胞抑制率达
到最大为 58． 4%，经 IC50分析软件进行计算其 IC50值为 35． 29
μg /ml，在后续实验中，分别用 12． 5、25． 0、50． 0 μg /ml吉祥草乙
酸乙酯部位进行实验。
表 1 吉祥草乙酸乙酯部位不同浓度作用 24． 0h 对 Caski细胞生长
的影响(珋x ± s，n = 6)
组别 剂量(μg /ml) 吸光度 抑制率(%)
空白对照 1． 235 ± 0． 04
丝裂霉素 50 0． 159 ± 0． 03 87． 5 ± 0． 03＊＊
吉祥草乙酸乙酯部位 3． 125 1． 140 ± 0． 05 6． 7 ± 0． 05
4． 688 1． 124 ± 0． 07 8． 0 ± 0． 07
6． 25 1． 170 ± 0． 06 4． 2 ± 0． 06
9． 38 1． 099 ± 0． 04 10． 1 ± 0． 04*
12． 5 1． 048 ± 0． 02 14． 3 ± 0． 02＊＊
18． 75 0． 783 ± 0． 03 36． 0 ± 0． 04＊＊
25． 0 0． 577 ± 0． 02 52． 8 ± 0． 02＊＊
50． 0 0． 513 ± 0． 02 58． 4 ± 0． 02＊＊
与空白对照组相比 * P ＜0． 05，＊＊ P ＜0． 01(下同)
2． 2 吉祥草乙酸乙酯部位不同作用时间对 Caski 细胞生长的
影响 由表 2 可知:吉祥草乙酸乙酯部位在不同作用时间(4、
8、12、24、48h)点和不同浓度(12． 5、25． 0、50． 0 μg /ml)时对 Cas-
ki细胞生长均有抑制作用，与空白对照组比较，差异具有显著
性;而且同一浓度的吉祥草乙酸乙酯部位对 Caski 细胞的生长
抑制率随作用时间的延长而提高，与作用 4h 时间比较，差异具
有显著性。实验表明吉祥草乙酸乙酯部位对 Caski 细胞的生长
抑制作用呈明显的时间-剂量依赖性。
表 2 吉祥草乙酸乙酯部位不同作用时间对 Caski细胞生长的影响(珋x ± s，n = 6)
组别
剂量
(μg /ml)
时间(h，抑制率%)
4． 0 8． 0 12． 0 24． 0 48． 0
空白对照
吉祥草乙酸乙酯部位 12． 5 1． 9 ± 0． 02 17． 8 ± 0． 02＊＊△△ 20． 3 ± 0． 01＊＊△ 17． 8 ± 0． 05＊△ 21． 8 ± 0． 006＊＊△△
25． 0 1． 7 ± 0． 01 19． 0 ± 0． 005* 38． 4 ± 0． 03＊＊△△ 51． 0 ± 0． 03＊＊△△ 53． 2 ± 0． 04＊＊△△
50． 0 25． 9 ± 0． 04＊＊ 22． 7 ± 0． 009＊＊ 53． 7 ± 0． 02△ 52． 1 ± 0． 02△ 98． 9 ± 0． 001＊＊△△
与空白对照组相比较 * P ＜ 0． 05，＊＊ P ＜ 0． 01;与同一浓度吉祥草乙酸乙酯部位作用 4h比较 △ P ＜ 0． 05，△△ P ＜ 0． 01
2． 3 吉祥草乙酸乙酯部位对 Caski 细胞形态影响 在倒置显
微镜下观察，空白对照组 Caski 细胞贴壁生长，呈上皮细胞型，
其形态为扁平多角形或梭形，贴壁牢固，密集，折光性好，胞质饱
满，细胞彼此紧密连成单层;实验组细胞变小，间隔增大，生长密
集度明显下降，贴壁性差，细胞圆缩，部分从其附着处脱落下来
或与周围细胞分离，且其形态学改变呈浓度依赖性，见图 1。
2． 4 吉祥草乙酸乙酯部位对 Caski 细胞凋亡形态影响 Caski
细胞经 Hoechst33258 荧光染色后，荧光显微镜下空白对照组
Caski细胞细胞核较大，染色质分布均匀，折光性好，胞质饱满，
呈低荧光强度;吉祥草乙酸乙酯部位干预组可见细胞核固缩变
小，细胞核呈致密浓染，呈亮蓝色荧光，可见凋亡小体，为典型凋
亡细胞表现，凋亡小体产生的个数随药物的浓度增大而增加，
由此可得出吉祥草乙酸乙酯部位诱导 Caski 细胞凋亡，且呈剂
量依赖性，见图 2。
图 1 吉祥草乙酸乙酯部位对 Caski细胞形态影响
74中药药理与临床 2013;29(6)
图 2 吉祥草乙酸乙酯部位对 Caski细胞凋亡形态影响
2． 5 吉祥草乙酸乙酯部位对 Caski 细胞 BCl-2、Bax 和 COX-2
mＲNA表达的影响 如表 3 和图 3 所示，空白对照组中 COX-2
和 BCl-2 mＲNA表达水平明显升高，Bax 表达水平显著降低，最
终导致 BCl-2 /Bax 的比值增加;用吉祥草乙酸乙酯部位(12． 5、
25． 0 和 50． 0 μg /ml)处理后可使 Caski 细胞中 COX-2 和 BCl-2
mＲNA表达水平降低，Bax mＲNA 表达水平升高，BCl-2 /Bax 的
比值降低，与空白对照组比较具有显著性差异(P ＜ 0． 05，P ＜ 0．
01)，且随着给药浓度的升高而增强。
表 3 吉祥草乙酸乙酯部位对 Caski 细胞 COX2、BCl-2、Bax mＲNA
表达的影响(珋x ± s，n = 4)
组别
剂量
(μg /ml)
COX-2 /GAPDH BCl-2 /GAPDH Bax /GAPDH BCl-2 /Bax
空白对照 1． 194 ± 0． 072 0． 694 ± 0． 039 0． 163 ± 0． 049 4． 517 ± 1． 353
吉祥草乙酸 12． 5 0． 723 ± 0． 103＊＊ 0． 384 ± 0． 080＊＊ 0． 294 ± 0． 046* 1． 299 ± 0． 077＊＊
乙酯部位 25． 0 0． 616 ± 0． 077＊＊ 0． 211 ± 0． 058＊＊ 0． 310 ± 0． 038＊＊ 0． 680 ± 0． 161＊＊
50． 0 0． 433 ± 0． 091＊＊ 0． 097 ± 0． 040＊＊ 0． 398 ± 0． 054＊＊ 0． 250 ± 0． 064＊＊
与空白对照组相比 * P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01
图 3 吉祥草乙酸乙酯部位对 Caski细胞 COX-2、BCl-2、Bax mＲNA表达
的影响
3 讨论
吉祥草一直以来为我国苗族和土家族人民所青睐，并广泛
用于咽喉肿痛、目赤翳障、疳积、痈肿疮疖、黄疸、肾结石、胆结
石、跌打损伤、扭伤、骨折、冷风湿等疾病的治疗［8］。我们初步
研究观察到其石油醚部位和乙酸乙酯部位具有较强的抗癌活
性，尤其是乙酸乙酯部位［7］，同时还发现乙酸乙酯部位中重要
甾体皂苷 ＲCE-4 能够诱导肿瘤细胞凋亡［9］，该实验结果与刘
海［10］等人报道的吉祥草根茎及果实中富含甾体皂苷类化合物
的正丁醇分离部位为其主要的抗肿瘤活性部位一致。同时我们
在前期研究中发现吉祥草乙酸乙酯部位能够显著抑制由脂多
糖诱导分化的 THP-1 细胞分泌的 IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎症因
子，具有良好的抗炎活性，但其抗炎和抗肿瘤之间存在何种联
系，尚待进一步研究［11］。基于此，本研究以人宫颈癌 Caski细胞
为研究对象，进行了吉祥草乙酸乙酯部位对人宫颈癌 Caski 细
胞抑制作用及 COX-2 基因表达与 BCl-2 蛋白家族关系的研究。
结果显示吉祥草乙酸乙酯部位在不同浓度(3． 125、4． 6875、6．
25、9． 375、12． 5、18． 75、25． 0、50． 0μg /ml)和不同作用时间(4、8、
12、24、48h)点时对 Caski 细胞生长均有抑制作用，而且随着浓
度的增加和作用时间的延长，其抑制作用更加明显。实验表明
吉祥草乙酸乙酯部位对 Caski细胞生长的抑制作用与药物作用
的浓度和时间有密切关系。
细胞凋亡是一切生物正常胚胎发生过程和人类发育过程
中细胞清除的正常途径。这一过程的紊乱将导致发育异常，并
给人类造成许多严重的疾病。许多证据表明，肿瘤的发生与细
胞凋亡的调节紊乱有密切关系。细胞凋亡参与了癌症的起始过
程，并对癌症的发生起负调控作用［12］。因此，肿瘤细胞凋亡及
其增殖抑制成为评估抗癌药物作用能力的重要指标。大量研究
证明:细胞凋亡是多种促凋亡因素和抗凋亡因素互相作用综合
调节的结果［13］。近年来研究表明线粒体在细胞凋亡过程中发
挥重要作用，被形象的成为细胞凋亡的燃烧室。其中 BCl-2
家族蛋白在这一过程中扮演及其重要的角色，是凋亡进程中的
一个主要调节因子，它由抗凋亡蛋白(如 BCl-2，Bag-1，BCl-x，
MCl-1 等)和促凋亡蛋白(如 Bax，Bak，Bad，Bid 等)组成。在肿
瘤细胞中，BCl-2 表达水平升高，而 Bax 表达下降。上调 BCl-2
或下调 Bax能抑制多种因素诱导的多种肿瘤细胞凋亡。反之，
下调 BCl-2 或上调 Bax则促进多种肿瘤细胞凋亡，因此，BCl-2 /
Bax的比例决定(或部分决定)细胞生存或者凋亡［14，15］。在实
验中，我们发现 Caski 细胞经吉祥草乙酸乙酯部位处理后 Bax
mＲNA表达水平明显增加，BCl-2 mＲNA 表达显著降低，BCl-2 /
Bax显著降低。实验结果表明吉祥草乙酸乙酯部位对 Caski 细
胞凋亡促进作用可能与其调节 BCl-2 和 Bax表达有关。
环氧化物酶(cyclooxygenase，COX)又称前列腺素类过氧化
物合成酶，是催化花生四烯酸转化为前列腺素类物质的限速酶。
COX有两种同工酶 COX-1 和 COX-2。COX-1 是呈结构性表达;
COX-2 在大多数组织中呈诱导性表达，并能被多种胞外刺激所
诱导表达，如脂多糖、炎症细胞因子、内毒素、肿瘤促进剂、一氧
化氮等，受刺激后诱导表达成为炎症过程中重要的诱导酶［16］。
近年来的大量实验研究表明，COX-2 在许多类型的肿瘤中表达
84 中药药理与临床 2013;29(6)
增高。如宫颈癌、肺癌、前列腺癌、胃肠道肿瘤等［17］，并通过抑
制肿瘤细胞的凋亡、免疫应答及逃避免疫监视，来促进肿瘤组
织周围血管生成及肿瘤的转移和复发［18］。体外实验表明 COX-
2 基因转染或高表达的肿瘤细胞生长能力增强而凋亡受到抑
制，高表达 COX-2 基因的肿瘤细胞对凋亡的抵抗能力增强［19］。
结合我们前期发现吉祥草乙酸乙酯部位显示出的良好的抗炎
活性，我们进行了 Caski细胞中 COX-2 的 mＲNA表达水平分析，
实验结果证实空白对照组 COX-2 表达水平显著升高，用不同剂
量的吉祥草乙酸乙酯部位干预后，其表达水平得到了显著的抑
制。
由于细胞凋亡异常在肿瘤的发生和发展中占据着重要地
位，而 COX-2 的表达水平的增高会提高无疑会增强肿瘤细胞对
凋亡的抵抗性，从而促进肿瘤的发生和发展［20］。研究表明细胞
中 COX-2 的过度表达可降低花生四烯酸水平，调节 BCl-2 引起
细胞周期 G1 期延长，延长细胞生存，增加二次突变的机会，同
时该代谢产物还可直接促进内皮细胞移位和生长因子诱导的
血管形成，通过刺激 BCl-2 抑制内皮细胞凋亡，使突变细胞幸
存，促进肿瘤形成和发展［21］。Lin等［22］将 COX-2 表达载体转染
肺腺癌 CL1． 0 细胞，发现 COX-2 过表达的细胞对紫外线、长春
花碱诱导的细胞凋亡产生抑制，其凋亡抑制作用与 BCl-2 相关。
在实验中，我们也发现了 COX-2 在空白对照组 Caski 细胞中
mＲNA高表达，并且发现吉祥草乙酸乙酯部位能够显著地抑制
COX-2 的表达;同时在实验中也发现 COX-2 高表达的空白对照
组 BCl-2 mＲNA表达水平高，Bax mＲNA 表达水平低;用吉祥草
乙酸乙酯部位干预后后能够有效逆转上述异常表达，该实验结
果与 MTT分析和细胞形态学观察结果一致。
综上所述，本研究证实吉祥草乙酸乙酯部位对 Caski 细胞
有明显抑制作用，其作用机制可能与上调 Bax mＲNA表达，下调
COX-2 和 BCl-2 mＲNA表达及 BCl-2 与 Bax 的比值有关。
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Studys of the inhibition effects of ethyl acetate extraction from Ｒeineckia carnea (Andr．)Kunth on
Caski cells and COX-2 gene expression and BCl-2 protein family relationship
Bai Caihong，Zou Kun，He Haibo，Wang Yuting，Yang Xiaojiao，Wang Junzhi，Yang Jin
(Hubei Key Laboratory of Natural Products Ｒesearch and Development，China Three Gorges University，Yichang 443002)
Objective:To investigate the inhibition effects of ethyl acetate extraction from Ｒeineckia carnea (Andr．)Kunth on cervix cancer Caski
cells，and to explore the possible mechanism． Methods:Caski cells were treated with different concentration of ethyl acetate extraction from
94中药药理与临床 2013;29(6)
Ｒeineckia carnea (Andr．)Kunth (3． 125，4． 6875，6． 25，9． 375，12． 5，18． 75，25． 0，50． 0 μg /ml)for 24h ;After Caski cells were treated
with ethyl acetate extraction from Ｒeineckia carnea (Andr．)Kunth (12． 5，25． 0 and 50． 0 g /ml)at different times (4，8，12，24，48h)，
cell viability was determined by MTT assay，the apoptosis cells morphous were observed by hoechst33258 through fluorescence microscope，
the Expressions of COX-2，BCl-2 and Bax mＲNA were detected by ＲT-PCＲ，and BCl-2 /Bax ratio was analyzed． Ｒesults:Ethyl acetate ex-
traction from Ｒeineckia carnea (Andr．)Kunth from 3． 125 to 50． 0 μg /ml concentration range for Caski cells growth inhibition was obvious
time-dose dependent，when the concentration of drug at 50． 0 μg /ml，reached the maximum inhibition rate to 58． 4%，and by the IC50 anal-
ysis software to calculate the IC50 value concentration of 35． 29 μg /ml;ethyl acetate extraction from Ｒeineckia carnea (Andr．)Kunth(12． 5，
25． 0 and 50． 0 g /ml)treatment could significantly inhibit Caski cell proliferation，promote apoptosis (P ＜ 0． 05 or P ＜ 0． 01)，when the drug
concentration of 50． 0 μg /ml，time of 48 h，the inhibition rate might up to 98． 9%;up-regulate the mＲNA expression level of Bax，down-
regulate expression levels of COX-2，BCl-2 and BCl-2 /Bax ratio compared with the negative control group(P ＜ 0． 05 ＆ P ＜ 0． 01，respective-
ly)． Conclusion:Ethyl acetate extraction from Ｒeineckia carnea (Andr．)Kunth could effectively inhibit proliferation and induce apoptosis
in cervix cancer Caski cells． The mechanism may be related to up-regulating the Bax mＲNA expression，down-regulating the COX-2，BCl-2
mＲNA expressions，decreasing BCl-2 /Bax ratio．
Key words ethyl acetate extract from Ｒeineckia carnea (Andr．)Kunth (吉祥草醋酸乙脂提取物) ;cervix cancer;Caski cells;apopto-
sis;COX-2
荞麦花叶总黄酮体外抗肿瘤及促细胞凋亡作用研究
*
郭 兰1，赵志宇2，韩淑英1＊＊
(1河北联合大学，唐山 063000;2河北联合大学附属医院，唐山 063000)
摘 要 目的:研究荞麦花叶总黄酮( extraction of buckwheat flower and leaf EBFL) 的体外抗肿瘤作用及其可能的机制。方法:
MTT法观察荞麦花叶总黄酮对 H22 细胞体外增殖的影响，计算肿瘤细胞生长抑制率。流式细胞术观察荞麦花叶总黄酮对 H22 细胞
周期的影响。PI 染色法检测荞麦花叶总黄酮对 H22 细胞凋亡的影响，计算细胞平均凋亡率。结果:荞麦花叶总黄酮在 48h 300μg /
ml、150μg /ml浓度对 H22 细胞增殖具有明显抑制作用，抑制率分别为 35． 33 ± 1． 53，40． 33 ± 2． 52。EBFL 150μg /ml浓度将肿瘤细胞
周期阻止于 G0 /G1 期，抑制肿瘤细胞的分裂增殖。荞麦花叶总黄酮对 H22 细胞具有明显的促进凋亡作用，以 150μg /ml 浓度组最
为明显。凋亡率 48h为 40． 67 ± 2． 08。结论:荞麦花叶总黄酮可直接抑制 H22 细胞增殖，将 H22 细胞周期阻止于 G0 /G1 期，促进
H22 细胞凋亡。
关键词 荞麦花叶总黄酮;肿瘤;凋亡
荞麦花叶总黄酮(EBFL)是从蓼科植物甜荞麦花叶中提取
的活性成分。研究表明，荞麦中的生物活性物质具有显著的降
血脂、降血糖功能，有降低血管脆性及异常的通透性、抑制血小
板聚集、抗氧化、影响血管活性物质、抗炎、强心、解痉等作
用［1 ～ 4］。最近，有文献报道金荞麦提取物对小鼠黑色素瘤、S180
肉瘤、肝癌等体外有抗侵袭活性和体内抗转移作用［5］。但有关
荞麦提取物抗肿瘤作用的实验研究目前尚未见报道。本实验
旨在观察荞麦花叶总黄酮体外抗肿瘤活性，为进一步的体内试
验及新药开发和临床应用提供理论基础和实验依据。
1 材料与方法
1． 1 试验药物 荞麦花叶(取自内蒙古库伦旗)为秋冬季因霜
冻未结果的甜荞麦花和叶，取风干剁碎的荞麦花叶 500 克，用
10 倍量乙醇回流提取 3 次(时间依次为 60，30，30min，温度
70℃)，合并 3 次滤液，用旋转蒸发器回收乙醇，并浓缩成膏状，
经 70℃烤干即为荞麦花叶总黄酮，经中国科学院药物研究所鉴
定为黄酮类，总黄酮含量为 98%。环磷酰胺，上海华联制药有
限公司 产品批号 080612。
1． 2 动物及瘤株 昆明种小鼠，SPF 级，雌雄各半，体重 19 ±
3g，由中国医学科学院实验动物研究所提供，合格证号:医动字
第 SCXK(京)2005-0013 号。饲料为中国医学科学院实验动物
研究所提供，合格证号:医动字第 SCXK(京)2006-0003 号。动
物自由饮水、进食，在华北煤炭医学院实验动物中心(证号:
SYXK(冀)2005-0038)饲养和实验。小鼠 H22 细胞由我河北联
合大学预防医学院馈赠，每 7d传代 1 次。
05 中药药理与临床 2013;29(6)
* 基金项目:河北省自然科学基金项目( C2010001795) ，为唐山市十一五重点工程项目( 072631B － 1) ;河北省卫生厅 2012 医学科学重点项
目( 20120402) ;唐山市科技攻关项目( 111302025b) ＊＊通讯作者
DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2013.06.016