全 文 ：　中间偃麦草染色体臂 7Ai-1L端体的细胞遗传学
鉴定及显微分离与克隆
林志珊 , 张增艳 , 辛志勇 , 马有志 , 孔凡晶 , 李连城 , 王晓平
(中国农业科学院作物育种栽培研究所/ 农业部作物遗传育种重点开放实验室 ,北京　100081)
摘要:利用细胞遗传学的方法 , 在确认测试材料根尖体细胞有丝分裂中期染色体数及花粉母细胞(pollen
mo ther cell , PMC)减数分裂期染色体行为的基础上 ,通过对测试材料与普通小麦的杂种 F 1 PMC 染色体配对构型
的观察 , 并结合目标染色体所应具有的黄矮病抗性及芽鞘颜色的鉴定 ,证实了测试材料中的端体为目标染色体臂
7Ai-1L。在此基础上显微分离 、扩增了该染色体臂 , 对扩增产物进行了连接 、转化 、克隆 , 初步构建了 7Ai-1L 的
DNA 文库。对文库中部分阳性克隆进行 Southern杂交分析 , 获得 6 个中间偃麦草特异的序列。
关键词:中间偃麦草;端体;细胞遗传学;显微分离;微克隆
Identification of Ditelosome 7Ai-1L of the Chromosome Arm
in Thinopyrum intermedium by Cytogenetic Methods
and its Microdissect ion and Microcloning
LIN Zhi-shan , ZHANG Zeng-yan , XIN Zhi-yong , MA You-zhi ,
KONG Fan-jing , LI Lian-cheng , WANG Xiao-ping
(Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding , Ministry of Agriculture / Institute of Crop Breeding and Cultivation ,
Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 100081)
Abstract:Cy togenetic methods were employed in this study.After mitotic count and meio tic observation ,
the exact chromosome numbers and their behavio r in the tested material were confirmed.The chromosome con-
f ig uration of the PMC of the hybrids betw een tested material and common wheat w ere observed then.Combin-
ing identification fo r the BYDV resistance and the coleoptile color , the target chromosome should have.The re-
sults showed that the ditelosomes in this material were the target chromosome arms 7Ai-1L.The chromosome
arms then w ere microdissected and microcloned.A DNA library of 7Ai-1L had been constructed.Six specific se-
quences of Th.intermedium were isolated by Southern blo t analy sis.
Key words:Thinopyrum intermedium ;Ditelosome;Cy togenetics;M icrodissection;Microcloning
收稿日期:2002-03-26
基金项目:国家植物转基因专项(J99-A-011)
作者简介:林志珊(1962-),女 ,广东揭阳人 , 副研究员 ,主要从事小麦遗传育种研究 , E-mail:z slin-62@163.com ,通讯作者为张增艳 , Tel:010-
68918781;Fax:010-68975212
　　小麦-中间偃麦草二体附加系 L1 是法国的
Cauderon 利用部分双二倍体 TAF46 与普通小麦
Vilmorin27杂交 、回交选育而成的[ 1] 。其附加的中
间偃麦草染色体与小麦的第 7 群染色体部分同
源[ 2 ,3] 。该染色体被命名为 7Ai-1[ 4] 。辛志勇等[ 5]
1991年报道了包括中间偃麦草在内的 13个小麦近
缘种属及其衍生材料附加系 L1等对大麦黄矮病毒
BYDV 的PAV株系表现出良好的抗性 ,而一个附加
了与 L1 相同的外源染色体短臂的端体附加系
TAF2d被鉴定出携带 1个控制红色胚芽鞘的基因 ,
同时对 BYDV 表现出高度感病[ 6] ,从而证明了 BY-
DV抗性基因位于这条染色体的长臂。
尽管已将 L1的黄矮病抗性导入了普通小麦并
育成一批育种上可利用的亲本[ 7]或生产上推广的
中国农业科学　2002 , 35(9):1049-1054
Scientia Ag ricultura Sinica
品种 ,并找到一些与该抗病基因共分离的分子标
记[ 8 ,9] ,但克隆该抗黄矮病基因的工作依然面临着
许多困难 ,其中主要的原因在于外源染色体片段与
小麦染色体间的交换频率低 ,难以精确定位分子标
记与抗病基因间准确的遗传距离。为此 ,需要寻找
大量与该基因共分离的分子标记 ,以期“染色体着
陆”抗病基因区 。
利用微切割和微分离技术 ,建立携有抗病基因染
色体臂的 DNA文库 ,可为抗病基因的克隆及分子标
记的富集提供一个良好的技术操作平台。而这一工
作的开展首先要求对目标染色体进行准确地识别 。
本文将报道对 1个 7Ai-1L 端体材料的鉴定结
果。在此基础上显微分离 7Ai-1L 并初步构建该染
色体臂 DNA文库。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　测试材料　7Ai-1L 由澳大利亚 Larkin博士
惠赠;L1 为小麦-中间偃麦草二体附加系 ,由法国
INRA 的 Cauderon博士育成并惠赠;SP2是 1992年
本室从 L1的自交后代中选择获得的二体代换系 。
1.2　方法
1.2.1　细胞学材料的准备　浸种 ,待种子萌动露白
后转入 4℃冰箱 12h 以上以控制根生长的相对同
步。再将种子置 25℃左右的温度条件下培养 ,待根
长至 1.0 ～ 1.5cm 时 ,截取根尖于冰水中预处理
24h ,使根尖分生组织部位中处于中期分裂相的细胞
大量积累 ,再用卡诺固定液(3 份乙醇∶1 份冰乙酸)
固定适当时间 ,换 70%乙醇-20℃条件下保存备
用。
植株孕穗挑旗后 ,取大小合适的幼穗 ,卡诺固定
液固定处于减数分裂中期的花药 ,换 70%的乙醇于
-20℃冰箱中保存待检。
根尖及花药采用孚尔根染色 、常规压片法镜检 。
1.2.2　配制测试材料　配制与普通小麦宛7107等
的杂交组合;种植杂种 F1;固定花药方法同上。
1.2.3　芽鞘颜色观察　取过根尖的种子 ,在光照条
件下生长数天后 ,观察芽鞘颜色的变化 。
1.2.4　抗病性鉴定　苗期接种带毒蚜虫 ,待对照普
通小麦品种充分发病后 ,调查植株黄矮病发病情况 。
1.2.5　显微切割标本片的制备　取材方法同1.2.
1。卡诺固定液固定材料的时间分别为:根尖
30min ,花药 15min。制片前水洗 10 ～ 20min ,混合
酶液(2.0%纤维素酶+2.0%果胶酶 +1.5%离析
酶)37℃下处理根尖 35 ～ 42min ,花药 18 ～ 20min。
然后吸去酶液 ,加入柠檬酸缓冲液(0.1mol/L 柠檬
酸+0.1mol/L 柠檬酸钠以 4∶6的体积比储存 ,用时
稀释 10倍)低渗 20 ～ 30min。45%冰乙酸压片 ,液
态 N 冻片 ,揭去盖玻片。随即进行显微切割 。
1.2.6　显微切割与体外扩增　在 Narishige Model
PB-7拉针仪拉制微细玻璃针。利用显微操纵器在
倒置显微镜下将目标染色体完整挑取下来 。附着于
针尖的染色体连同针尖折断于装有 20μl蛋白酶 K
溶液的 0.5ml 离心管中 , 58℃水浴锅中保温 3h ,
75℃灭活酶 20min 。蛋白酶 K溶液的配制以及随后
的步骤包括 Sau3A酶切 ,接头连接及两轮 PCR扩增
基本参照 Diego[ 10]等的方法 ,略有修改:(1)用于接
头合成的 2个寡核苷酸片段由宝生物工程公司合
成 ,其中的 23mer 已作 5 磷酸化修饰 。(2)PCR扩
增体系为 50μl ,扩增条件参照文献[ 11] 。
以不加端体 ,其余成分和反应步骤相同的样品
为空白对照 。
1.2.7　PCR产物的连接 、转化 、克隆　PCR产物用
QIAquick PCR产物纯化试剂盒纯化。根据说明书
取 3μl纯化产物与 pGEM-Teasy 载体(Promega)连
接过夜(4℃),转化感受态的大肠杆菌 JM 109细胞 ,
并涂布于含有氨苄(Amp)、X-gal+IPTG的 LB平板
培养基上 ,37℃培养过夜。挑选白色转化子克隆 。
1.2.8　插入片段大小分析法　随机挑取上述白色
单菌落160个分别于2.5ml含 Amp(50mg/L)的 LB
液体培养基中 ,37℃震摇培养 12h 。按分子克隆小
量提取质粒法提取质粒 DNA 。用最靠近插入位点
的限制性内切酶 EcoRI 消化质粒 ,并在 1%的琼脂
糖胶中电泳 ,EB染色 ,紫外凝胶成像系统观测 、照相。
1.2.9　PCR扩增产物 Southern杂交和重组子质粒
的点杂交　染色体端体经两轮 PCR扩增后的电泳
分离样品胶经 0.25 mol/L HCl 脱嘌呤后在 0.4
mol/L 的 NaOH 溶液中通过 Southern 吸印将胶上
的 DNA片段全部转移到硝酸纤维素膜上。2×SSC
溶液中和后 ,滤纸上晾干 。保鲜膜包好放 4℃冰箱
保存备用。
重组子质粒依浓度不同分别用 2 ～ 5μl依次排
列点在硝酸纤维素膜上 ,经碱变性 、中和处理及晾干
后 ,在紫外交联仪上交联 3.3min (1 200×100uJ/
cm2)。保鲜膜包好于 4℃冰箱中保存备用 。
分别以α-32P-dCTP 标记的中间偃麦草和小麦
中国春的基因组 DNA 为探针对 LA-PCR扩增产
物 、重组子质粒进行杂交。探针的标记参照 Fein-
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berg 和 Vogelstein的随机六聚体引物法进行。
2　结果与分析
2.1　根尖体细胞染色体观察
测试材料的根尖体细胞染色体数为 2n=42+
2t ,有 2个清晰的端体染色体(图 1)。此外 ,大多数
细胞具有 4个明显的随体染色体。表明其背景不携
带 1B/1R易位染色体 。对照二体附加系 L1染色体
数为 2n=44;二体代换系 SP2 染色体数为 2n=42 ,
它们同样具有 4个明显的随体染色体 。由于 L1 中
附加的染色体与小麦染色体间无论在大小还是在形
态上均无明显差别 ,很难区别出外源染色体 ,因而也
无法辨别测试材料中端体是否属于外源染色体。
箭头示 2个端体
Arrow s indicate the telocent ric ch romosomes
图 1　测试材料根尖体细胞 2n=42+2 t
F ig.1　Mitotic metaphase plate of the tested material 2n=42+2t
2.2　花粉母细胞减数分裂行为观察
测试材料处于中期 I 的染色体构型为 2n=21II
+1t t ,两个端体染色体可正常配对形成 1个形态较
小的二价体(图 2)。大多数的端体染色体在后期可
正常分离进入两极 ,说明端体在遗传上较为稳定 。
相反 ,或许由于端体的影响 ,一些细胞中常会出现不
配对的单价体 ,或者出现 1 ～ 2 对染色体的提早分
离。
2.3　杂种 F1 花粉母细胞减数分裂中期 I染色体构
型的观察
取普通小麦宛 7107与测试材料杂种 F 1的花药
进行减数分裂过程染色体配对构型的观察 。中期
I ,染色体的平均配对构型为 2n=20.86I I+0.272 I
+1t 。在观察的 66个细胞中 ,端体未能与任何小麦
染色体相配对 ,而呈单价状态 。86%的细胞可观察
到小麦染色体与测试材料染色体间的完全配对(图
3)。充分表明 ,端体与小麦染色体的亲缘关系较远 ,
因而端体为外源染色体 。
箭头示 1对端体二价体
Arrow indicates a pair of the telocent ric ch romosome
图 2　测试材料 PMC中期Ⅰ 2n=21Ⅱ+1tt
Fig.2　Meiotic metaphase o f the tested material in PMC 2n=
21Ⅱ+1tt
箭头示端体
Arrow indicates a telosome
图 3　测试材料×宛 7107 F1的 PMC中期 I
Fig.3　Meiotic metaphase I in F1 hybrid of tested material ×
Wan7107
2.4　BYDV抗性鉴定
苗期田间接种饲毒蚜 。约 4周后 ,对照普通小
麦品种出现典型的黄矮病症状 ,而 L1 、SP2及测试
材料保持着抗病性(表)。说明位于染色体长臂的抗
病基因存在于附加系 、代换系及测试材料中。
2.5　芽鞘颜色的观察
将取过根尖的种子放在光照条件下培养数天
后 ,观察芽鞘颜色的变化。二体附加系 L1 、二体代
换系 SP2均为红芽鞘 ,而测试材料芽鞘一直保持着
正常绿色 。从表型上判断 ,控制芽鞘颜色基因所在
染色体区段不存在测试材料中。
综合以上几方面的观察结果 ,可以确认 ,测试材
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表　田间 BYDV抗性鉴定结果
Table　Results o f BYDV resistance test in the field
材料
Materials
总株数
The numbers of
total plants
抗病株
Resistant
plants
感病株
Suscept ible
plants
CA9211(CK) 35 0 35
L1 18 18 0
SP2 20 20 0
测试材料 203 202 1
Tested material
料中的端体确为中间偃麦草 7Ai-1L 染色体臂 ,该材
料为 7Ai-1L双端体附加系。
2.6　两轮 PCR扩增产物的电泳及 Southern杂交结
果
显微分离了上述材料中的端体 。并将分离得到
的端体进行酶解 、连接头和 LA-PCR扩增 。图 4 示
显微分离的端体经两轮 PCR扩增的电泳图谱 。图
中 3 ,4泳道各为 5条端体的扩增产物。片段大小范
围为 200 ～ 1 500bp ,与泳道 1 的阳性对照中间偃麦
草相近 ,而泳道 2的空白对照则无任何扩增产物。
1:中间偃麦草;2:空白对照;3 、4:端体
1:Th.intermedium ;2:CK;3 , 4:Telosome
图 4　LA-PCR结果 , M:λDNA/ EcoRⅠ +HindⅢ marker
F ig.4　The products of second LA-PCR , M:λDNA/ EcoRⅠ +
HindⅢ
　　以32P-dCTP 标记的中间偃麦草基因组 DNA 为
探针对 LA-PCR扩增产物进行 Southern 杂交 。结
果表明 ,扩增产物与中间偃麦草能产生较强的杂交
信号(图 5),表明扩增产物确实来自中间偃麦草 。
2.7　插入片段大小
随机挑取 160 个白色克隆 ,用 EcoRI 酶切消化
后 ,在 1%的琼脂糖胶上电泳分离。图 6显示部分
消化产物电泳结果。经统计 , 插入片段在 150 ～
1 580 bp ,平均大小为 238.6 bp。
1:空白对照;2:中间偃麦草;3:端体
1:CK;2:Th.in termedium;3:Telosome
图 5　以 a-32P-DCTP标记的中间偃麦草基因组 DNA为探针
对 LA-PCR的 Southern杂交结果
Fig.5　Southern blot analysis of the second LA-PCR products ,
using a probe of total Th.intermedium DNA labeled
by a-32P-dCTP
图 6　部分克隆 EcoRI酶切结果
Fig.6　Some EcoRI-digested clones showing the sizes of the in-
sert fragments
2.8　插入片段性质
对白色克隆进行点杂交分析 ,图 7示部分点杂
交结果 。根据 137个点杂交的统计资料 ,约 33%的
插入片段与中间偃麦草具有较强的杂交信号 ,推测
为多拷贝序列 。约 67%的插入片段与中间偃麦草
杂交信号较弱或没有 ,推测为单 、低拷贝序列。其中
有 38个与中间偃麦草杂交信号较强 ,而与中国春的
杂交信号较弱;另 6个仅与中间偃麦草杂交 ,而与中
国春没有杂交信号 ,说明这 6个片段是中间偃麦草
特异序列 。目前 ,正在对这些插入片段的性质做进
一步的分析 。
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图 7　分别以32P-dCTP标记的中间偃麦草(左)、中国春(右)基因组 DNA为探针点杂交部分结果
Fig.7　Do t hybridization of some plasmids cloned using probes of total Th .intermedium(left), CS(right)DNA la-
beled by a-32P-dCTP respectively
3　讨论
构建特定染色体或染色体区段的 DNA 文库 ,
对于建立高密度的分子标记及其图位克隆特定基因
均具有重要的意义。而特定染色体或染色体区段的
准确识别则是以上工作的基础 。六倍体小麦具有
42条染色体 ,除了 2对随体染色体外 ,其它染色体
间无明显的形态差异 。中间偃麦草染色体与小麦染
色体间也没有可以明显区分的形态特征 。
引进的材料在田间春播时可正常抽穗 ,明显不
同于表现强冬性的二体附加系 L1 及其小麦亲本
Vilmorin27 ,推测该材料不是直接产生于 L1 ,而可能
是通过杂交选育获得的。因而其遗传背景较为复
杂 ,因此对外源染色体的识别也显得尤为重要 。
染色体显微操作中对切割扩增产物进行 South-
ern杂交以确定切割染色体的基因组来源是目前普
遍采用的一种方法[ 10～ 13] 。然而 ,对于中间偃麦草
来说 ,若未事先确认目标染色体 ,则利用此方法将很
难准确判断切割扩增产物基因组的归属 。因为中间
偃麦草与普通小麦具有较近的亲缘关系 ,远缘杂交
的育种实践说明了这一点 。祁适雨等[ 14]曾经报道 ,
中间偃麦草与小麦杂交的当代平均结实率可达
39%以上 ,而通过各种育种途径 ,迄今也已获得了大
批的小麦-中间偃麦草易位系[ 5 , 15 ,16] 。何聪芬[ 17]曾
将中间偃麦草染色体 2Ai-2的显微扩增产物为标记
探针 ,在杂交液中不包含小麦基因组作封阻的情况
下与 2Ai-2二体附加系杂交 ,结果大约 80%的染色
体中出现明显杂交信号 ,且杂交信号几乎分布于每
条染色体上。本研究点杂交试验以中间偃麦草和小
麦基因组 DNA为对照 ,并分别将它们作为探针进行
相互杂交 ,结果它们彼此间均可产生一定强度的杂交
信号。这在分子水平上也进一步证明了中间偃麦草
和小麦基因组间的亲缘关系。因此 ,本试验在显微操
作前对分离染色体的准确识别是十分必要的。
本研究通过对杂种 F1 花粉母细胞减数分裂的
染色体配对构型的观察 ,证明了测试材料中的端体
为外源染色体 ,而测试材料的黄矮病抗性及绿芽鞘
则表明了外源染色体长臂的存在和短臂的缺失 。
细胞学观察结果表明 ,测试材料的端体在减数
分裂中期 I可形成稳定的特殊二价体 。这为该染色
体的显微识别和分离提供了便利 。由于同一花药中
花粉母细胞发育时期的相对同步 , 1 枚处于合适发
育期的花药 ,将可提供足够数量的分裂相 。不仅如
此 ,由于端体可稳定配对 ,分离时 1次可同时获得 1
对端体 ,从而提高了显微分离的效率 。但花药的取
材受植株生育期的限制 。根尖体细胞的取材则具有
时间上的灵活性 。在经过适当的预处理后 ,根尖体
细胞中的端体染色体清晰可辨。因此 ,无论花药 、根
尖均可成为理想的端体染色体分离材料。
插入片段大小是评价一个 DNA 文库质量的重
要指标。许多研究者都采用载体上的 M13正 、反向
引物扩增插入片段 。这样扩增出的片段大小包含了
部分载体的序列 ,约 200多个碱基 。本研究用最靠
近插入片段的内切酶 EcoRI 消化质粒 ,获得的插入
片段大小更接近实际值 。在考虑以上因素的基础
上 ,与前人的工作相比较 ,本研究所获得的插入片段
大小中等 ,可进行分子标记的筛选。
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