全 文 ：簇毛麦和中间偃麦草 rRNA 基因位点
双色荧光原位杂交分析
裴自友1 , 袁文业1 , 孙善澄1 , 孙　玉1 , 富田因则2 , 安室喜正2
(1.山西省农业科学院作物遗传研究所 ,山西太原　030031;2.鸟取大学农学部育种学研究室 ,日本 鸟取　680-8553)
摘要:簇毛麦和中间偃麦草是小麦改良的重要抗源 , 为了对导入的外源染色体及片段进行有效
鉴定 , 应用分带和双色荧光原位杂交 , 将 25S-5.8S-18S rRNA、 5S rRNA 基因分别定于簇毛麦染
色体 1V 短臂和 5V 短臂上。分别在中间偃麦草的 3 对 、 4对染色体上观察到 25S-5.8S-18S rRNA
和 5S rRNA基因 , 其中有 2 对染色体在其短臂上有两种核糖体 RNA 基因。
关键词:簇毛麦;中间偃麦草;rRNA 基因;双色荧光原位杂交
中图分类号:Q943　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2002)01-0006-05
簇毛麦(Haynaldia vi llosa 2n=14 VV)属小麦族 , 簇毛麦属 , 一年生 , 它具有对白粉病
免疫 , 高抗全蚀病 , 分蘖力强 , 耐旱 、 子粒蛋白质含量高等突出优点 , 通过染色体附加 、代
换及易位已将其导入普通小麦染色体中〔1〕 。中间偃麦草(Thinopyrum intermedium 2n=42 ,
E1E1E2E2StSt)属小麦族 , 薄冰草属 , 多年生 , 具有抗锈病 、 抗黄矮病 、 抗白粉病 、 耐旱 、
耐寒等对小麦改良十分重要的经济性状 , 人们将中间偃麦草的许多有益基因转移到小麦中 ,
创造出许多优异的种质资源〔2〕 。
小麦族植物中已有关于小麦〔3 ,4〕 、 黑麦〔3 ,5 ,6〕 、 大麦〔3 , 7〕、 小伞山羊草〔8 , 9〕 、 长穗偃麦
草〔7 ,10〕和灯芯偃麦草〔7〕rRNA基因位点的报告 , 这些 rRNA基因位点可用于导入外源染色体
的鉴定及对小麦族起源和进化的解析 。有关簇毛麦 rRNA 基因位点的报道还很少〔11〕 , 特别
是中间偃麦草 rRNA 基因位点 、 数量的研究 , 尚未见报道。本研究以不同荧光色素标记
25S-5.8S-18S rRNA 、 5S rRNA基因 , 进行双色原位杂交 , 检测出其在簇毛麦和中间偃麦草
上的位置 。
1　材料和方法
1.1　材料
供试材料簇毛麦及中间偃麦草的种子由本所保存 。
1.2　方法
1.2.1　制片　种子于恒温 25 ℃下发芽 , 待根长到 1 ～ 1.5 cm , 剪取根尖置于 0 ～ 4 ℃冰水
中处理 24 h , 然后用卡诺氏固定液(100%酒精∶冰醋酸=3∶1)固定 24 h后 , 采用酶解法制
片 , 将固定好的根尖放入盛有混合酶液(2% cellulase RS , 1% pectoly ase Y-23 , 0.5%
收稿日期:2001-04-28基金项目:山西省农业科学院青年基金资助项目作者简介:裴自友(1965-),男 , 副研究员 , 主要从事小麦染色体工程育种与分子细胞遗传学研究工作。
华北农学报 2002 , 17(1):6～ 10
Acta Agricultu rae Boreali-Sinica　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
Macerozyme R-200 , 1 mmol·L-1 EDTA , pH 值 4.2)的 1.5 mL 离心管中 , 室温下解离 30
min , 充分水洗后用 45%醋酸压片 , 相差显微镜下观察。制片在-80 ℃冰箱中冰冻 30 min
以上 , 揭去盖片 , 空气干燥后 , -20 ℃下保存 。
1.2.2　染色体 Giemsa C-分带　具体程序参照Gill等人的方法〔12〕 。照相后 , 制片经 2×SSC
洗涤 1 h , 置 45%醋酸中 2 min , 再用 2×SSC洗 5 min , 后经70%, 95%和99%酒精溶液系
列脱水后进入原位杂交。
1.2.3　原位杂交前染色体制片的预处理　将 600 μL 的 RNA酶(80μg·mL -1 sigma 公司)加
到制片上 ,37 ℃温育 1 h 。在 2×SSC中洗涤载玻片5 min ,然后在 70%,95%和 99%酒精中各
脱水 5 min ,空气干燥。
1.2.4　探针的标记　按随机引物法以 Digxigenin-11-dU TP 标记长度为 9 kb ,含小麦 25S-
5.8S-18S rRNA 基因的 rDNA 探针 pTa71〔13〕;以 Bio tin-16-dU TP 标记长度为 410 bp ,含有小
麦 5S rRNA基因的 rDNA 探针 pTa794〔14〕 。
1.2.5　杂交液配制与杂交　含 50%甲酰胺 ,2×SSC ,探针 DNA(3 ng/μL),鲑鱼精 DNA(300
ng/μL)的杂交液于 99 ℃下变性10 min , 迅速转入冰水中保持5 ～ 10 min , 然后按每片 15μL
将杂交液加到经预处理过的染色体制片上 , 加盖片封片 , 置于分子原位杂交仪上 , 70 ℃处
理 6 min后 , 37 ℃杂交过夜 。
1.2.6　杂交后的漂洗　杂交完毕后 , 制片首先在 2×SSC 中脱去盖玻片 , 然后在 40 ℃的 2
×SSC 中洗 3次 , 每次 10 min , 40 ℃的 4×SSC中漂洗 10 min。
1.2.7　荧光信号的放大和检测　每片加 5%牛血清蛋白 600 μL , 37 ℃温育 5 min , 去掉废
液 , 加含 10%avidin-FITC 、 anti-dig-rhodamin(Blehringer M annheim)抗体溶液70μL , 37 ℃
恒温 1 h , 40 ℃的 BT 缓冲液中洗 3次 , 每次 10 min , 2×SSC中洗 10 min 。
荧光信号的放大 , 制片上加 5%羊血清蛋白 600 μL , 37 ℃恒温 5 min , 续之加 2% Bi-
ot inylated Anti-Avidin(Vecto r laboratory)70 μL , 保湿盒 37 ℃1 h , 用 40 ℃BT 缓冲液洗 3
次 , 每次 10 min , 加 5%牛血清蛋白 600 μL , 37 ℃5min , 然后加 2% Extro-Avidin-FITC
(Vector labo ratory), 37 ℃1 h , 进行荧光信号放大 , 经 BT 缓冲液 40 ℃下洗 2次 , 每次 10
min , 2×SSC中洗 10 min。最后加 1 μg/mL 的 DAPI 对比染色 , 荧光褪色剂封片后 , 用
Olympus BX40观察 , 以地高辛标记的探针为红色荧光信号 , 以生物素标记的探针呈黄绿色
荧光 , 未杂交部分呈蓝色荧光 。用 WIGV , WIBV , WBV 三种滤光片多重叠加曝光照相 。
照相用 Fuji color HG1600胶卷 。
2　结果与分析
2.1　簇毛麦染色体 C带和 rRNA基因位点的双色原位杂交
图1-B所示 , 25S-5.8S-18S rRNA 基因在簇毛麦带有随体的染色体短臂核仁形成区
(NOR)位置检出一个位点 , 5S rRNA 基因在另一染色体近末端检出一个位点 , 观察到 25S-
5.8S-18S rRNA 比 5S rRNA基因位点的荧光信号强 , 结合 C分带结果(图 1-A)可知 , 25S-
5.8S-18S rRNA基因位于簇毛麦带随体的 1V染色体的短臂上 , 5S rRNA 基因位于 5V 染色
体短臂末端。
71期　　　　　　　　　裴自友等:簇毛麦和中间偃麦草 rRNA 基因位点双色荧光原位杂交分析
　　　A　簇毛麦体细胞染色体 C分带;B　簇毛麦 rRNA 基因位点双色荧光原位杂交;C 、 D　中间偃麦草体细胞中期染色
体双色荧光原位杂交
图 1　簇毛麦和中间偃麦草 rRNA基因位点双色荧光原位杂交
2.2　中间偃麦草染色体上 rRNA基因位点的双色原位杂交
中间偃麦草 C 分带效果不佳 , 特征带不明显 , 仅以双色原位杂交结果看 , 25S-5.8S-18S
rRNA基因在中间偃麦草染色体上检出 3个位点(图 1-C),5SrRNA 在 4个位置检出(图 1-
D)。其中有 2对染色体相同短臂上观察到 25S-5.8S-18S rRNA 基因(短臂末端)和 5S rRNA
(短臂近着丝点处)。此外 ,有 1对染色体仅短臂上有25S-5.8S-18S rRNA基因 ,有 2对染色体
短臂上只有 5S rRNA ,其中的 1个 5S rRNA 基因较其他 3个位点荧光信号弱。
3　讨论
在小麦远缘杂交和染色体工程育种中 ,如何快速地鉴定出外源染色体片段和易位发生的
位置是一个非常具有现实意义的问题 ,经典的方法周期长 、工作量大 ,通过多色原位杂交不仅
可以检测出外源物质 ,而且能够对其进行准确的染色体定位〔15〕。本研究以簇毛麦 、中间偃麦
草为材料进行双色原位杂交 ,探明了 25S-5.8S-18S rRNA 和 5S rRNA基因在这两个近缘种上
的杂交位点和数量。对簇毛麦 C 分带连续双色荧光原位杂交结果表明 , 25S-5.8S-18S rRNA
基因位于 1V 染色体核仁形成区(NOR), 5S rRNA 基因位于 5V 染色体短臂上 , 今后对于利
用C 分带不易区别的 4V 、 5V染色体可根据 5S rRNA基因位点的检测加以区分〔16〕 。
中间偃麦草为六倍体 , 且染色体小 , 鉴定困难〔17〕 , rRNA基因是中间偃麦草染色体有
8 华　北　农　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　17卷
效的分子标记 , 中间偃麦草由来自二倍体的长穗偃麦草的 E组染色体组成〔9〕 , 长穗偃麦草
5E与 6E染色体短臂上有 25S-5.8S-18S rRNA 基因位点〔7 ,10〕 , 因此可以推测中间偃麦草上
带有 25S-5.8S-18S rRNA基因的 3个染色体中有第 5 , 6同祖群的染色体 。
小麦族中小麦 、 黑麦 、大麦 、 小伞山羊草 、 长穗偃麦草 、 灯芯偃麦草 rRNA基因在其染
色体上的数量和位置已有报道 。在小麦上 25S-5.8S-18S rRNA基因位于 1B , 6B染色体〔3〕 ,
5S rRNA 基因存在于A , B , D染色体组的第 1 、 第 5 同源群所有染色体的短臂上 。黑麦则
是25S-5.8S-18S rRNA 和 5S rRNA 基因存在于 1R染色体短臂上 , 5R , 3R短臂上亦有 5S
rRNA基因〔3 , 6〕。25S-5.8S-18S rRNA 基因位于大麦和长穗偃麦草的第 5 , 6同祖群的染色体
上 , 5S rRNA 则位于第 1同祖群染色体上〔3 ,7 ,18〕 。本研究中簇毛麦与小麦 、 黑麦表现一致 ,
25S-5.8S-18S rRNA基因位于第 1 同祖群 , 但 1V 染色体上没检出 5S rRNA 基因 。如上所
述 , 小麦族植物中 rRNA基因的数量 、 位置有很大差异 , 簇毛麦 rRNA基因位点的鉴定 , 为
在分子水平上研究小麦族的物种起源与进化提供了新的信息。
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Double Color FISH of rRNA Genes in Wheat Relatives of
H.villosa and Th .intermedium
PEI Zi-you1 , YUAN Wen-ye1 ,SUN Shan-cheng1 , SUN Yu1 ,
M Tomita
2 ,Y Yasumuro2
(1.Crop Genetics Research Institute , Shanxi Academy of Agricultural Sciences , Taiyuan　030031 , China;
2.Faculty of Agriculture , Tottori University , Tottori　680-8553 , Japan)
Abstract:Haynaldia v illosa(2 n =14 , VV)and Thinopyrum intermedium (2n=42 , E1E1E2E2
S tSt)are important w heat relatives providing useful resistant genes fo r w heat improvement.In
this paper , rRNA genes coding 25S-5.8S-18S rRNA and 5S rRNA are visualized on H .vi llosa
and Th.intermedium chromosomes by double color fluorescence in si tu hybridization.The 25S-
5.8S-18S rRNA genes are localized on the sho rt arm of 1V chromosome , and 5S rRNA genes are
on the sho rt arm of 5V chromosome of H .vi llosa.On the other hand , three pai rs of the 25S-
5.8S-18S rRNA genes and four pai rs of the 5S rRNA genes are observed on the Th.intermedi-
um chromosomes , in w hich 2 pairs of chromosomes have both rRNA genes on their short arms.
Key words:Haynaldia v il losa;Thinopyrum intermedium ;rRNA genes;Two color FISH
10 华　北　农　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　17卷