全 文 ：遗 传 学 报 , 29(7):565 ～ 570 , 2002
Acta Genetica Sinica
中间偃麦草染色体 2Ai-2特异 PCR新标记的建立
和 St基因组特异序列的克隆
张增艳1 , ① ,王丽丽2 ,辛志勇1 ,林志珊1
(1.中国农业科学院作物育种栽培研究所农业部作物遗传育种重点实验室 ,北京 100081;2.河北科技
大学生物工程与食品科学学院 ,石家庄　050018)
摘要:对中间偃麦草麦 、小麦和小麦-中间偃麦草 2Ai-2 附加系 Z1、Z2 、Z6 , 代换系 ZD28 等进行 RAPD分析 ,从 320 个
RAPD引物中 ,鉴定出 2Ai-2 染色体特异的 2 个 RAPD标记OPO05650和 OPM041400 。利用这2 个特异 RAPD引物 OPO05
和OPM04 , PCR扩增普通小麦 CS(ABD)及其近缘植物中间偃麦草(E1E2St)、拟鹅冠草(St), 长穗偃麦草(E)、簇毛麦
(V)、黑麦(R)、大麦(H)、粗山羊草(D)等基因组 DNA。结果表明 , OPO05650和 OPM041400均是 2Ai-2 染色体上 St基因
组区域的特异标记。将上述 2个特异片段分离回收 、克隆 、测序 ,根据测序结果重新设计 、合成特异引物 , 成功地转
换 RAPD标记为 SCAR(sequence characterized amplified region)标记 SC-O5 和 SC-M4。利用 SCAR标记对不同材料进
行分析的结果表明 ,凡含有 2Ai-2 染色体的抗黄矮病材料及拟鹅冠草均产生一条扩增带 , 不含 2Ai-2染色体的材料 ,
包括小麦 、长穗偃麦草 、簇毛麦 、黑麦 、大麦 、粗山羊草以及含有其他中间偃麦草染色体的附加系 , 均没有扩增产物 ,
说明上述2 个 SCAR标记是中间偃麦草 2Ai-2染色体的特异性 PCR标记 , 且是 2Ai-2染色体上 St基因组区域的特异
性标记。克隆与鉴定中间偃麦草的 2个 SCAR扩增片段 TiSCO5 和 TiSCM4 ,结果表明 , 克隆的中间偃麦草 TiSCO5 和
TiSCM4特异片段 , 分别是 St基因组特异性的寡拷贝序列及多拷贝重复序列 , 为 St基因组遗传研究的新探针。
关键词:中间偃麦草;染色体特异标记;RAPD标记;SCAR标记:St基因组
中图分类号:Q75　　文献标识码:A　　文章编号:0379-4172(2002)07-0627-07
Development of New PCR Markers Specific to a Thinopyrum intermedium
Chromosome 2Ai-2 and Cloning of the St-specific Sequences
ZHANG Zeng-Yan1, ① , WANG Li-Li2 , XIN Zhi-Yong1 , LIN Zhi-Shan1
(1.Key Lab.of Crop Genetics &Breeding , Ministry of Agriculture , Institute of Crop Breeding and Cultivation , Chinese Academy of
Agricultural Sciences , Beijing 100081, China;2.College of Bio-Engineering and Food Science , University of Science
and Technology in Hebei , Shijiazhuang 050018 , China)
Abstract:To meet the need of selecting translocation lines , some new RAPDmarkers for 2Ai-2 chromosome of
Th.intermedium were identified in the paper.Out of 320 RAPD primers , 2 specific primers ,OPO05 and
OPM04 , can amplify respectively a specific band with size of about 650bp and 1400bp in the BYDV resistant
materials containing the chromosome 2Ai-2 , including Th.intermedium , wheat-Th.intermedium partial
amphipoild Zhong 4Awnless , addition lines Z1 , Z2 and Z6 , F1(Z2 Wan7107)and substitute line ZD28 etc , but
absent in all the materials lacking the 2Ai-2 chromosome , including susceptible wheat parents and other
wheat-Th.intermedium addition lines L1 and Z4.The RAPD markers specific to chromosome 2Ai-2 , OPO05650
andOPM041400 , may be located on the St genomic region of 2Ai-2 chromosome by PCR analysis on Th.
intermedium (E1E2St), Pseuderogneria strigosa (St), Th .elongatum (E), Haynaldia villosa (V),
　　收稿日期:2001-10-25;修订日期:2002-02-22
基金项目:国家“转基因植物专项”(J99-A-011)和“ 863”课题(2001AA211011)资助[ The project was supported by the Special Fund of Natural
Transgenic Plant(J99-A-011)and “ 863 Hi-Tech”Project(2001A211011)]
①联系人。 E-mail:zengyanzhang@yahoo.com
〗Secale cereale (R), Hordeum vulgare (H), Aegilops squrrosa (D)and Triticum aestivum (ABD)genomic
DNA.The specific bands of RAPD markers OPO05650 and OPM041400 were isolated and cloned.After the
clones were subjected to restrict digestion analysis ,PCR and Southern hybridization analysis , some clones were
sequenced.Based on the sequences , 1 pair of primers SC-O5(U+L)and 1 pair of primers SC-M4(U+L)
were designed , synthesized and used to amplify the materials with and without 2Ai-2 chromosome.The results
showed that the SCARmarkers of chromosome 2Ai-2 , SC-O5 and SC-M4 , were converted successfully from the
RAPD markers OPO05650 and OPM041400 .The Th.intermedium fragments amplified by the primers of SC-O5
(U+L)and SCM4(U+L)were cloned and analyzed.The results of Southern hybridization indicated that
TiSCO5 , the cloned fragment of Th .intermedium amplified by primers of SC-O5(U+L)was a low-copy
sequence specific to St genome , and another sequence TiSCM4 , the cloned fragment of Th .intermedium
amplified by primers of SC-M4(U+L)was a repeat sequence specific to St genomic.The sequences will be
new probes to detect St genomic chromatin.
Key words:Thinopyrum intermedium ;chromosome specific marker;RAPD;SCAR;St genome
　　中间偃麦草 [ Thinopyrum intermedium (Host)
Barkworth &Dewey = Agropyron intermedium(Host)
Beauvoir]是异源六倍体的小麦近缘野生植物 ,其染
色体组为 E1 、E2 、St(S)3个基因组构成 。E1 、E2 源于
二倍体长穗偃麦草的 Ee 基因组以及灯芯偃麦草的
E
b基因组;拟鹅冠草属两个二倍体物种 Ps.stipifolia
和Ps.strigosa 是中间偃麦草 St(S)基因组的供
体[ 1 ,2] 。由于中间偃麦草具有许多十分重要的性状 ,
而且易与小麦杂交 ,被广泛应用于小麦改良 ,育成多
个部分双二倍体 、附加系 、代换系和易位系。
外源染色体的准确鉴定是有效利用外源有益基
因的基础 。近年来分子标记已成为检测外源染色体
的有力工具 ,其中特异性 PCR标记因简便 、快捷和
良好的稳定性等特点成为首选的实用分子标记。近
年来 , 利用由 RFLP 标记转换的特异性 PCR-STS
(sequence tagged site)标记 ,鉴定了导入小麦中的大
麦[ 3] 、中间偃麦草[ 4] 和黑麦[ 5 , 6] 染色体或染色体片
段。利用从 RAPD标记转换的 SCAR标记 ,成功地
检测了小麦背景中的大麦[ 7] 和簇毛麦[ 8] 染色体或其
片段 。但关于中间偃麦草特定染色体的 SCAR标记
鲜见报道 。虽然鲍晓明等[ 9] 、朱其洪等[ 10] 、张增艳
等[ 11]报道了中间偃麦草染色体或其片段的RAPD标
记 ,但对于具有多个有益基因的中间偃麦草而言 ,其
PCR标记数量仍然有限 ,难以满足检测 、选育小片段
易位系的需求。为此 ,本研究又从 320 个 RAPD 引
物中鉴定出携抗黄矮病基因的中间偃麦草 2Ai-2
染色体特异的两个新 RAPD 标记 ,将其转换为该染
色体特异性 PCR标记 -SCAR标记 ,并克隆与鉴定
出两个SCAR扩增片段TiSCO5和TiSCM4 ,是St基因
组特异性的序列 。
1　材料和方法
1.1　植物材料
小麦-中间偃麦草 2Ai-2附加系 Z1(无芒中 4/
中 7902×4 ,2n=44)、Z2(无芒中 4/宛 7107×4 , 2n=
44)、Z6(无芒中 4/中 8423×4 ,2n=44),代换系ZD28
(Z6/陕 7859 ,2n=42),F1(Z2/宛 7107),L1衍生的易
位系 HW642 ,由本室选育保存;中间偃麦草 ,簇毛麦
(Haynaldia villosa shur.VV), 黑麦(Secale cereale L.
RR)品种“冬牧 70” ,大麦(Hordeum vulgare L.HH)品
种“Betzes” 、粗山羊草(Aegilops squarrosa L.Ae249 ,
DD), 由本室收集 、保存;拟鹅冠草(Pseuderogneria
strigosa ,StSt)由中国科学院遗传与发育生物学研究
所贾旭研究员惠赠;二倍体长穗偃麦草(Thinopyrum
elongatum ,EE)由中国农业科学院品种资源研究所李
立会研究员惠赠;感病小麦亲本:“中国春”(CS)、中
7902、宛 7107 、陕 7859等由本室选育 、收集与保存。无
芒中 4 、TAF46 、7Ai附加系 L1 、Z4分别由黑龙江省农
业科学院 、法国Cauderon博士 、Larkin等选育 、提供。
1.2 　方法
1.2.1　植物 DNA 的提取　　按 Sharp等报道的酚
氯仿法提取[ 12] 。
1.2.2　RAPD分析 　　按张增艳等[ 11] 方法进行 ,
25μ1反应体系中引物为 0.2μmol/L , Tag 聚合酶为
1U(华美生物公司),基因组 DNA为 20ng 。
1.2.3　RAPD特异片段回收和克隆　　RAPD扩增
产物用 DNA 快速纯化回收试剂盒回收 ,克隆到
pGEM-Teasy vector上(Promega ,USA),利用GIBCO/BRL
628 遗　　传　　学　　报　　　　　　　　　　　　　　　　　 　29卷
电激转化仪将连接片段转入大肠杆菌 JMl09细胞中 。
1.2.4　重组克隆分析与测序　　按微量碱裂解法
提取质粒;用 EcoRⅠ酶切分析重组质粒 ,并用原有
引物扩增重组质粒 、选取阳性克隆做探针 , 进行
Southern杂交 、验证插入片段是否特异。选插入片段
特异的克隆测序 。
1.2.5　SCAR-PCR分析　　25μ1反应体系中含 40ng
基因组 DNA ,1U Tag 聚合酶 ,0.2mmol/L 每种 dNTP ,
每一引物 0.2μmol/L , 10mmol/L Tris-HCl (pH9.0)、
50mmol/L KCl ,2.0mmol/L MgCl2 。PCR反应于 PE 480
PCR仪上进行 。扩增条件为:72℃5min;96℃ lmin;进
入94℃ lmin;64℃ lmin;72℃2min共 35个循环 ,然后
72℃延伸 5min。1.0%Agarose胶电泳分析。
1.2.6　Southern 杂交 　　参照 Sharp 等[ 12] 方法进
行 ,每份 DNA样品 12μg 。
2　结果
2.1　2Ai-2染色体特异 RAPD标记的筛选
初筛时 ,以中间偃麦草 、Z2和宛 7107作为测试
样品 ,从Operon公司出品的 16组引物包括 A 、B 、D 、
G 、K 、M 、N 、O 、Q 、S 、U 、V 、W 、X 、Y 、AC 组共 320 个引
物中 ,筛选到OPO05 、OPM04 、OPB14 、OPK06 、OPV09 5
个引物能在中间偃麦草和 Z2中扩出特异带 ,而小麦
亲本宛 7107无特异带。以上述 5个引物扩增含有
2Ai-2染色体的无芒中 4 ,附加系Z1 、Z2 、Z6 ,代换系
图 1　引物OPO05 的 PCR扩增结果
M:λDNA/ EcoRⅠ +Hind Ⅲ;1:中间偃麦草;2:无芒中 4;3:Zl;
4:Z2;5:Z6;6:Fl;7:ZD28;8:拟鹅冠草;9:二倍体长
穗偃麦草;10:宛 7107;11:陕 7859;12:中 7902;13:
中 8601;14:HW642;箭头示抗病特异带
Fig.1　PCR pattern amplified by the primer OPO05
M:λDNA/ EcoRⅠ +HindⅢ;1:Th.intermedium ;2:
Zhong 4 Awnless;3:Z1;4:Z2;5:Z6;6:F1;
7:ZD28;8:Ps.Strigosa;9:Th.elongatum ;
10:Wan 7107;11:Shan 7859;12:Zhong 7902;
13:Zhong 8601;14:HW 642;arrow indicates the
specifi c band of the 2Ai-2 chromosome
ZD28和 F1以及无 2Ai-2染色体的附加系 L1 、Z4 、感
病小麦亲本等 。结果表明 , 只有特异引物 OPO05
(5′-GGCGGTTGTC-3′)和 OPM04(5′-CCCAGTCACT-
3′)能在所有携2Ai-2染色体的抗病材料中重复地扩
增出特异带 ,而无 2Ai-2 染色体的材料无特异带。
从图 1可看出 ,在携 2Ai-2染色体的所有抗病材料
中 ,OPO05能扩增出大小为 650bp左右的特异带 ,无
2Ai-2染色体的材料则无此特异带 。OPM04在上述
含 2Ai-2染色体的抗性材料中扩增出 1400bp左右的
特异带 , 无 2Ai-2 染色体的材料则无此特异带(图
2)。说明OPO05650和 OPM041400为 2Ai-2染色体特异
的 RAPD标记 。
图 2　引物 OPM04的 PCR扩增结果
标注同图 1
Fig.2　PCR pattern amplified by the primer OPM04
Meaning of the lane and arrow is the same as
that in Fig.1
2.2　RAPD标记的基因组归属
张增艳等[ 11] 根据基因组原位杂交分析证明 ,
Z1 、Z2所附加的一对中间偃麦草染色体 2Ai-2为 St-
E中间插入易位染色体。为明确上述 RAPD标记片
段与St 、E基因组及其他近缘植物基因组关系 ,利用
OPO05 、OPM04特异引物 ,PCR扩增中间偃麦草 、拟
鹅冠草 、二倍体长穗偃麦草 、簇毛麦 、黑麦 、大麦 、粗
山羊草 、普通小麦 CS及 Z2等基因组 DNA。结果表
明 ,特异 RAPD标记片段 OPO05650和 OPM041400仅对
应于中间偃麦草 、2Ai-2染色体和 St基因组(图 3 ,图
4),说明OPO05650和 OPM041400位于中间偃麦草 2Ai-2
染色体的St基因组区域 。
2.3　RAPD特异标记片段的克隆及其分析
对源自中间偃麦草 、附加系 Z2 的 OPO0650和
OPM041400特异片段进行回收 、克隆 ,再对白色重组克
隆进行 EcoRⅠ酶切分析和原有引物的 PCR扩增分
析 ,选取插入片段大小符合要求的克隆做探针 ,对中
6297期　　　　　张增艳等:中间偃麦草染色体 2Ai-2 特异 PCR新标记的建立和 St基因组特异序列的克隆
图 3　引物 OPO05 扩增近缘植物的结果
M:λDNA/ EcoRⅠ +HindⅢ;1:中间偃麦草;2:无芒中
4;3:Z2;4:拟鹅冠草;5:长穗偃麦草;6:簇毛麦;
7:黑麦;8:大麦;9:粗山草;10:CS;箭头示抗病特异带
Fig.3　Result of Triticeae plants amplified by OPO05
M:λDNA/ EcoRⅠ +HindⅢ;1:Th.intermedium ;2:Zhong 4
Awnless;3:Z2;4:Ps.strigosa;5:Th.elongatum;6:H.vi llosa;
7:Se.cereale;8:Barley;9:Ae.squarrosa;10:CS;arrow in-
dicates the specifi c band of 2Ai-2 chromosome
图4　引物 OPM04 扩增近缘植物的结果
标注同图 3
Fig.4　Result of Triticeae plants amplifi ed by OPM04
Meaning of the numeral and arrow is the same as that in Fig.3
间偃麦草 、无芒中 4 、Z1 、Z2 、Z6及感病小麦对照等
PCR扩增转印膜进行Southern分析 。结果表明 ,克
隆 TiO05-5(图 5)和 TiM04-2(图 6)中插入片段 ,仅与
2Ai-2染色体 PCR产物杂交出一条相应大小的特异
带 ,在无 2Ai-2材料中没有杂交带 ,说明 TiO05-5和
TiM04-2中插入片段来自中间偃麦草染色体 2Ai-2。
图5　TiO05-5 做探针的 PCR-Southern结果
1:中间偃麦草;2:无芒中 4;3:Z1;4:Z2;5:Z6;
6:F1;7:ZD28;8:宛 7107;9:中 7902;
10:陕 7859;11:L1;12:HW642
Fig.5　Result of PCR-Southern blot with probe TiO05-5
1:Th.intermedium;2:Zhong 4 Awnless;3:Z1;
4:Z2;5:Z6;6:F1;7:ZD28;8:Wan 7107;9:Zhong 7902;
10:Shan 7859;11:L1;12:HW642
图 6　TiM04-2做探针的 PCR-Southern 结果
标注同图 5
Fig.6　Result of PCR-Southern blot with probe TiM04-2 Meaning of
the numeral is the same as that in Fig.5
2.4　SCAR标记的建立与分析
将 TiO05-5全部测序 、TiM04-2 二端测序 ,结果
表明 ,TiO05-5插入片段的核苷酸序列实际长 652bp ,
序列如下。
630 遗　　传　　学　　报　　　　　　　　　　　　　　　　　 　29卷
　　将TiO05-5序列在GenBank进行同源序列比较 ,
发现该序列为新序列 ,已送交 GenBank注册 、登录 。
序列分析表明 ,TiM04-2两端序列也为新序列 。
根据 TiO05-5插入片段的核苷酸序列 、 TiM04-2
插入片段的两端序列 ,利用Oligo6.4软件 ,分别重新
设 计 一 对 引 物。 SC-O5U 序 列 为 5′-
GTGAAAGCGTAACCTTCGATGACG-3′, 位于 TiO05-5
序列 的 111 ～ 135bp 处 , SC-O5L 序 列 为 5′-
AGATGCTCCACCAGCCCTGCTC-3′位于 TiO05-5 序列
的527 ～ 549bp 处 , 扩增产物大小应为 430bp。SC-
M4U 序列为 5′-TGGGCCAGGTCTTTCAGGTGACG -3′
位于 TiM04-2序列的 101 ～ 123bp处 ,SC-M4L序列为
5′-GCCCTGCCATTGATCCCAAGCTG -3′位于 TiM04-2
序列下游 ,其扩增产物大小应在1000 ～ 1100bp。
利用特异引物对 SC-O5(U+L)对中间偃麦草 ,
无芒中4 ,附加系 Z1 、Z2 、Z6 ,代换系 ZD28和小麦亲
本等进行 PCR扩增。结果表明 , SC-O5(U+L)能在
携2Ai-2染色体的抗病材料中扩增出 430bp左右的
特异带 ,无 2Ai-2染色体的小麦亲本则无扩增产物
(图 7),说明设计的 SC-O5引物对与 2Ai-2染色体序
列特异结合 ,RAPD标记OPO05650成功地转化为 2Ai-
2染色体特异的 SCAR标记SC-O5。
图7　特异引物对 SC-O5的 PCR扩增结果
M:λDNA/Hind Ⅲ+EcoR Ⅰ ;1:中间偃麦草;2:无芒中 4;3:Z1;
4:Z2;5:Z6;6:F1;7:ZD28;8:宛 7107;9:陕 7859;10:中 7902
Fig.7　PCR pattern amplif ied by the primer pair SC-O5
M:λDNA/ Hind Ⅲ+EcoR Ⅰ ;1:Th.intermedium;2:Zhong 4
Awnless;3:Z1;4:Z2;5:Z6;6:F1;7:ZD28;
8:Wan 7107;9:Shan 7859;10:Zhong 7902
SC-M4(U+L)引物对能在携 2Ai-2染色体的抗
病材料中扩增出 1050bp左右的特异带 ,无 2Ai-2 染
色体的材料则无扩增产物(图 8),说明设计的SC-M4
引物对与 2Ai-2 染色体序列特异结合 , RAPD标记
OPM041400成功地转化为 2Ai-2 染色体特异的 SCAR
标记 SC-M4。
图 8　特异引物对 SC-M4的 PCR扩增结果
标注同图 7
Fig.8　PCR pattern amplif ied by primer pair SC-M4
Meaning of the numeral is the
same as that in Fig.7
以中间偃麦草 、拟鹅冠草 、长穗偃麦草 、簇毛麦 、
黑麦 、大麦 、粗山羊草 、普通小麦 CS 、无芒中 4 、Z2 、
ZD28 、Z4 、L1为模板 ,分别利用特异引物对 SC-O5(U
+L)和 SC-M4(U+L)进行 PCR扩增。结果表明 ,
SC-O5(U+L)仅能在拟鹅冠草 、含有 St基因组的中
间偃麦草和携 2Ai-2(具 St基因组成分)的抗病材料
中扩增出一条约 430bp特异带 ,而无 2Ai-2的其他材
料无扩增产物 ,说明 SC-O5430确为中间偃麦草染色
体 2Ai-2的特异性 PCR标记 ,且对应于该染色体 St
基因组区域(图 9)。SC-M4(U+L)能在拟鹅冠草 、含
有St基因组的中间偃麦草和携 2Ai-2的抗病材料中
扩增一条约1050bp特异带 ,而无2Ai-2的其他材料无
扩增产物 ,说明 SC-M41050也确是中间偃麦草 2Ai-2的
特异性 PCR标记 ,对应于其 St基因组区域(图略)。
图 9　引物 SC-O5扩增小麦近缘植物的结果
M:λDNA/ EcoRⅠ+HindⅢ;　1:中间偃麦草;2:无芒中 4;
3:Z2;4:ZD28;5:拟鹅冠草;6:长穗偃麦草;7:簇毛麦;
8:黑麦;9:大麦;10:粗山羊草;11:CS , 12:Z4;13:L1
Fig.9　Result of Triticeae plants amplified by SC-O5 ,
M:λDNA/ EcoRⅠ +HindⅢ;
1:Th.intermedium;2:Zhong 4 Awnless;3:Z2;
4:ZD 28;5:Ps.strigosa;6:Th.elongatum;
7:H.villosa;8:Se.cereale;9:Barley;
10:Ae.squarrosa;11:CS;12:Z4;13:L1
6317期　　　　　张增艳等:中间偃麦草染色体 2Ai-2 特异 PCR新标记的建立和 St基因组特异序列的克隆
2.5　克隆与鉴定 St基因组特异序列
以引物对 SC-O5(U+L)和 SC-M4(U+L)扩增中
间偃麦草基因组 DNA ,分离 、克隆上述扩增片段
TiSCO5和TiSCM4。用克隆的上述片段做探针 ,与中
间偃麦草 、拟鹅冠草 、长穗偃麦草 、簇毛麦 、黑麦 、大
麦 、粗山羊草 、普通小麦 CS 、Z2 等基因组 DNA 的
EcoRⅠ 、Hind Ⅲ 、Dra Ⅰ 、EcoRⅤ限制酶切产物进行
Southern杂交。结果表明 ,以 TiSCO5为探针的杂交
中 ,4种酶切的中间偃麦草和拟鹅冠草分别有 2 ～ 7
条杂交带 ,St基因组含量少的 Z2有 1 ～ 2条带 ,其他
基因组无杂交带 ,说明 TiSCO5是中间偃麦草中 St
基因组特异的寡拷贝序列(图略)。以 TiSCM4为探
针的杂交结果表明 ,4 种酶切的中间偃麦草和拟鹅
冠草能产生很强的杂交带 12 ～ 15条或弥散状 ,St基
因组含量少的 Z2有 1 ～ 4条带 ,其他基因组无杂交
带 ,说明 TiSCM4是 St基因组特异性很强的多拷贝
重复序列(图 10)。
图 10　TiSCM4 做探针与小麦近缘植物基因组
DNA酶切片段的 Southern杂交图谱
1 , 11:中间偃麦草;2, 12:Z2;3 , 13:L1;4,
14:拟鹅冠草;5, 15:长穗偃麦草;6 , 16:簇毛麦:
7, 17:黑麦;8 , 18:大麦;9 , 19:粗山羊草;
10 , 20:CS;1～ 10:EcoRⅠ酶切;11～ 20:HindⅢ酶切
Fig.10　Southern hybridization pattern of Triticeae s
genomic DNA digested by EcoRⅠ
andHindⅢ with the probe TiSCM4
1, 11:Th.intermedium;2 ,12:Z2;3 , 13:L1;4 ,14:
Ps.strigosa;5 , 15:Th.elongatum;6 ,16:H.villosa;
7, 17:Se.cereale;8, 18:Barley;9 , 19:Ae.squarrosa;
10, 20:CS;1～ 10:EcoRⅠ digestion;11～ 20:HindⅢ digestion
3　讨论
目前用于遗传育种研究的主要分子标记 ,包括
RFLP 、RAPD 、SSR 、AFLP 和特异性 PCR标记。AFLP
标记操作复杂 、技术要求高 、成本高。SSR标记具有
较高的种属特异性 ,限制了其在外源染色质的鉴定。
RFLP标记是遗传育种研究中应用最早 、最广泛的分
子标记之一 , 但 RFLP 标记技术复杂 、实验周期较
长 、且对 DNA 样品的质和量要求高。因此 ,为适应
田间育种大量筛选的需求 ,应将 RFLP 标记转换为
特异性 PCR-STS标记 。但并非每个 RFLP 标记都能
转换为 STS 标记[ 13] 。RAPD 分析因简单 、快速 、对
DNA的质和量要求不高 、引物无种属界限等特点 ,
广泛应用于遗传研究上 。但 RAPD标记的稳定性和
重复性差 ,将 RAPD标记转换为稳定的特异性 PCR-
SCAR标记非常必要。
本文从 320个 RAPD引物中 ,筛选出 2个特异
引物 ,分别能与 2Ai-2染色体 St基因组区域 DNA序
列结合 、扩增出特异片段;而无 2Ai-2染色体的附加
系 Z4 、L1及小麦亲本等均无上述特异扩增片段 。因
此特异片段OPO05650和OPM041400可作为 2Ai-2染色
体特异的 RAPD 标记。将上述特异 RAPD片段克
隆 、测序 ,根据序列和计算机软件 ,重新设计特异引
物对 ,将 RAPD标记转换为SCAR标记。
在 SCAR标记转换中 ,选取测序的重组克隆非
常重要。只有选取插入片段符合要求 、能产生特异
PCR-Southern杂交带的克隆测序 , 再根据这样序列
设计引物 ,方能转换为特异 SCAR标记。引物设计
也是转换成功的关键因素之一。本文利用软件设计
的 SCAR特异引物 、位于 RAPD特异序列内部 、不包
含原 RAPD 引物序列 ,用它们扩增的片段小于原
RAPD特异片段。但SCAR标记特异性 、稳定性大大
提高 ,是良好的特异性 PCR 标记 。在利用 RAPD 、
SCAR标记检测时发现 , RAPD扩增时要求模板的浓
度和试剂较严;而 SCAR标记对 DNA浓度和试剂要
求不高 、稳定性好 ,扩增产物与检测样品为正相关的
有无关系 ,易于分辨 ,更利于辅助选择育种 。
用 RAPD技术能否从某一特定基因组中扩增出
该基因组特异片段 ,主要取决于此片段两端有无与
特定引物相结合的核苷酸位点[ 14, 15] 。本文筛选的中
间偃麦草 2Ai-2染色体特异的 RAPD引物OPO05和
OPM04 ,分别能与 2Ai-2染色体 St基困组区域的不
同 DNA 序列结合扩增出特异片段。而由 RAPD特
异序列设计的引物对 SC-O5(U+L)和 SC-M4(U+L)
虽然不包含原 RAPD引物序列 ,但仍能与中间偃麦
草染色体 2Ai-2上St基因组 DNA序列特异结合 ,与
中间偃麦草其他染色体 、其他小麦近缘基因组不能
结合扩增 ,说明设计 SCAR引物所根据的中间偃麦
632 遗　　传　　学　　报　　　　　　　　　　　　　　　　　 　29卷
草 RAPD特异序列是中间偃麦草染色体 2Ai-2上 St
基因组区域的特异序列。
鉴定并克隆某基因组特异序列 ,对于物种起源
与进化研究和检测外源染色质非常重要[ 15] 。本文
利用 2个特异 PCR-SCAR引物对扩增中间偃麦草 ,
将其特异片段分离 、克隆 ,做为探针进行 Southern杂
交分析 ,结果表明 ,TiSCO5是中间偃麦草中 St 基因
组特异的寡拷贝序列 ,TiSCM4是中间偃麦草中 St基
因组特异性很强的多拷贝重复序列 ,这两个序列均
是未见报道的新序列 ,是跟踪检测 St基因组遗传物
质的新探针。
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(责任编辑:张艳)
6337期　　　　　张增艳等:中间偃麦草染色体 2Ai-2 特异 PCR新标记的建立和 St基因组特异序列的克隆