全 文 ：收稿日期:2009-08-27
基金项目:“十一五”科技支撑项目(2008BADB3B02);内蒙古自治区重大科技项目(20071923)
作者简介:李景环(1972-),女 ,内蒙古赤峰人 ,讲师 ,博士 ,主要从事植物分子生物学的教学与科研工作和牧草育种科研工作。
通讯作者:云锦凤(1941-),女 ,内蒙古土默特左旗人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事牧草育种的科研与教学工作。
加拿大披碱草与老芒麦及其杂种后代同工酶
和 RAPD遗传分析
李景环1 , 2 ,云锦凤1 ,吕天池2 ,周碧柳2
(1.内蒙古农业大学 生态环境学院 ,内蒙古 呼和浩特　010019;2.内蒙古师范大学生命科学与技术学院 ,内蒙古呼和浩特　010022)
　　摘要:对加拿大披碱草 、老芒麦 、杂种 F1 、C0 Ⅰ 、C1Ⅰ 、C0Ⅱ和 C1Ⅱ7种材料进行了同工酶和 RAPD的分析 ,旨在通过
分子标记方法探讨供试材料的亲缘关系。结果表明:在不同的生育期 , EST同工酶酶谱具有较高的多态性 ,酶谱差异
较大 ,在分蘖期杂种的 EST酶谱偏向母本加拿大披碱草 ,根据该生育时期的酶谱特征可以鉴定杂种后代的的真实性 ,
其他生育时期 , EST酶带偏向父本老芒麦 , 而且没有明显的差异 。SOD酶谱的差异只是体现在表达量的多少上 , 并没
有出现特异性的条带。 RAPD分析表明 ,加拿大披碱草与老芒麦的遗传一致度为 0.72 , 遗传距离为 0.328 5 , 在 7 种材
料中亲缘关系最远;杂种后代与母本加拿大披碱草的遗传距离较近 , 而与父本老芒麦的亲缘关系相对较远;因此用
RAPD分析材料的遗传关系更为合适。
关键词:加拿大披碱草;老芒麦;杂交后代;遗传分析
中图分类号:S543.9　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2009)06-0038-08
Genetic Analysis on Isozymes and RAPD of E .canadensis ,
E.sibiricus and Their Hybrids
LI Jing-huan1, 2 ,YUN Jin-feng1 , LU Tian-chi2 ,ZHOU Bi-liu2
(1.College of Ecology Environment , Inner Mongolia Agricultural University ,Huhhot　010019 ,China;
2.College of Life Science and Technology , Inner Mongolia Normal University ,Huhhot　010022 ,China)
Abstract:Genetic analysis on isozymes and RAPD of E.canadensis , E .sibiricus ,F1 ,C0 Ⅰ , C1 Ⅰ ,C0 Ⅱand C1 Ⅱ
were done.The results showed that the polymorphism of EST isozymes were much more than that of SOD during the four
breeding periods.At tillering stage , the results of esterase isozymes also showed that true hybrid could be identificate , and
zymogram characteristics of esterase isozymes tended to that of female parent E.canadensis.At other three breeding peri-
ods , zymogram characteristics of esterase isozymes tended to that of male parent and there were little differences .Differ-
ences of SOD isozyme only lied in expression level , and there were no specific band.Analysis on RAPD showed that ge-
netic identity and genetic distance of E.canadensis and E.sibiricus were 0.72 and 0.328 5 .Their genetic relationship
was most furthest among 7 materials.And genetic relationship between hybrids and parents showed that hybrids tended to
female parent E.canadensis.But that was very far to male E.sibiricus.It was much appropriate that RAPD was used to
analyze genetic relationship.
Key words:E .canadensis;E.sibiricus;Hybrids;Genetic analysis
　　我国生态建设和畜牧业发展急需耐寒 、耐旱 、产
量高的优质牧草品种 ,远缘杂交育种是从根本上改
良牧草的有效手段。加拿大披碱草(Elymus canaden-
sis)是禾本科披碱草属多年生草本植物 ,产于北美 ,
茎秆直立 ,疏丛型 ,叶宽大;适应性强 ,抗旱 、抗寒 、耐
盐碱 、抗风沙 , 适口性好 ,是优良的牧草。老芒麦
(Elymus sibiricus)别名:西伯利亚披碱草 、叶老芒麦 ,
是禾本科披碱草属多年生疏丛型禾草。根系发达 ,
呈须状 ,茎秆直立 。主要分布于西伯利亚 、远东以及
蒙古 、日本等国 。在中国东北 、华北 、西北和西藏高
原等地都有分布 ,抗寒力强 ,能耐湿 ,抗旱力稍差 ,土
壤适应性较广 ,分蘖力强。适口性好 ,草食家畜喜
华北农学报·2009 , 24(6):38-45
食。最宜调制干草。因此加拿大披碱草与老芒麦是
适合作为远缘杂交的原始材料 ,加拿大披碱草与老
芒麦杂交已获得 F1植株 ,并且通过育性恢复手段获
得了 F1 加倍当代株系 Ⅰ(C0 Ⅰ)、F1 加倍一代株系Ⅰ
(C1Ⅰ)、F1加倍当代株系Ⅱ(C0Ⅱ)以及 F1加倍一代
株系 Ⅱ(C1 Ⅱ)。
本试验利用酯酶同工酶(EST),超氧化物歧化
酶(SOD)同工酶和 RAPD标记对以上材料进行遗传
分析 。以便能有目的选择优良单株作为育种材料 ,
为培育优质的牧草新品种奠定基础 。
1　材料和方法
1.1　试验地概况
试验地设在内蒙古农业大学牧草试验站。该站
地处内蒙古呼和浩特市 ,位于东经 111°42′,北纬 40°
49′,海拔 1 063 m ,属典型大陆性气候 ,年平均降水
400 mm 左右 ,无霜期 140 d。试验地属暗栗钙土 ,砂
壤质 ,肥力条件中等 ,土壤 PH 值 7.5 左右 ,具备灌
溉条件。
1.2　试验材料及方法
1.2.1　供试材料的准备　材料为加拿大披碱草 、老
芒麦 、杂交后代 F1 、C0 Ⅰ 、C1 Ⅰ 、C0 Ⅱ 、C1 Ⅱ。2005年
3月将供试材料播种于内蒙古农业大学生态环境学
院温室花盆中 ,2005年 5月将材料分株栽种在内蒙
古农业大学牧草试验站 ,株距和行距都为 60 cm ,每
穴 1株(表 1)。
表 1　材料的基本情况
Tab.1　 Basic status of materials
材料
Material
来源
Origin
染色体数
Chromosome No. 基本特征Biological trait
加拿大披碱草(母本)Elymus canadensis 北美 2n=28 高产 ,叶量大 , 抗寒 ,抗虫 , 抗病
老芒麦(父本)Elymus sibiricu 中国 2n=28 结实率高 , 抗寒抗旱 ,草质好
F1 2n=28 高度不育 , 生长势好
C0Ⅰ 2n=56 有一定的育性 ,茎叶量丰富
C1Ⅰ 生长速度快 , 产草量高 ,生长势好
C0Ⅱ 有一定的育性 , 生长缓慢
C1Ⅱ 生长速度快 , 产草量高 ,生长势好
1.2.2　同工酶的测试和分析　分别在返青期 ,孕穗
期 ,抽穗期和开花期剪取 7种材料的叶片提取酶液 。
分析 EST , SOD 同工酶的遗传与变异 ,加拿大披碱
草 、老芒麦 、杂种 F1 、C0 Ⅰ 、C1 Ⅰ 、C0 Ⅱ植株群体的样
本来自于 10个单株 ,C1 Ⅱ群体的样本为 70个单株 。
取各个生育期的材料 1 g ,加 4 mL Tris-甘氨酸电极
缓冲液(pH8.3)、4 mL 40%甘油 ,将上述每种材料的
单株样品分别在冰浴下迅速研磨成匀浆 , 移至 10
mL 离心管 ,10 000 r/min冷冻离心 20 min ,取上清液
置-20℃冰箱内保存放置。
采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法[ 7-12] ,胶版
厚 1.5 mm ,浓缩胶浓度 4%, pH 6.7 ,分离胶浓度
7.5%,pH8.9 ,电极缓冲液为 Tris-甘氨酸(pH8.3),每
样槽进样量 60 μL(材料取单株酶液等量混合 ,形成
混合酶液 ,再从混合酶液中取 60 μL),在 4℃冰箱中
电泳 ,初始电压 80 V ,当前沿指示剂走出浓缩胶时
稳压 250 V ,直至电泳结束。
酯酶同工酶(EST)采用醋酸萘酯-坚牢蓝 RR盐
染色法 , 染色后的胶板用 7%的冰醋酸固定。SOD
同工酶采用醋酸 NBT 溶液染色法[ 13-17] 。在凝胶成
像系统下照相记录谱带 。按迁移率 Rf值(Rf=酶带
迁移距离/前沿指示剂距离),酶带染色深浅 ,标定每
条酶带位置。
1.2.3　RAPD分子标记法
1.2.3.1　DNA 的提取与检测　DNA 的提取:①材
料为加拿大披碱草 、老芒麦 、杂种 F1 、C0 Ⅰ 、C1 Ⅰ 、C0
Ⅱ的各 10个单株和 C1 Ⅱ的所有植株(70个单株)。
取供试材料新鲜嫩叶片 0.5 g ,先用自来水洗掉杂
质 ,然后用双蒸水冲洗 3次 ,再用无菌滤纸吸干叶片
上的水分 ,剪成2 ～ 3 cm的小段并用保鲜膜包好 ,放
在-78℃冰箱备用 。②上述处理好的叶片样品按编
号放入-20℃预冷的研钵中 ,加液氮研磨成粉末 ,转
入 10 mL离心管中(以下均为 5 mL 的离心管),迅速
加入 3 mL 65℃预热的 CTAB 提取液 , 65℃温浴 90
min 。③加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)充分混匀 ,
4℃12 000 r/min离心 10 min 。 ④取上清 ,再加入等
体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)充分混匀 , 4℃ 12 000
r/min离心 10 min。⑤取上清 ,加 2/3 体积 -20℃异
丙醇 ,混匀 ,4℃12 000 r/min离心10 min。⑥得沉淀
加 1.5 mL 65℃预热的 CTAB 提取液 , 65℃温浴 30
min 。⑦加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)充分混匀 ,
4℃12 000 r/min离心 10 min。 ⑧取上清 ,加 2/3体
积-20℃异丙醇 ,混匀 , -20℃沉淀 2 h;4℃ 12 000
r/min离心 10 min ,沉淀用 70%乙醇洗涤 2次 ,干燥;
将沉淀用100μL TE回溶 ,加 RNase 3μL ,37℃放置1
h ,4℃冰箱保存[ 18 ,19] 。
6期 李景环等:加拿大披碱草与老芒麦及其杂种后代同工酶和 RAPD遗传分析 39　
DNA检测:将上述提取到的加拿大披碱草 、老
芒麦 、杂种 F1 、C0 Ⅰ 、C1 Ⅰ 、C0 Ⅱ和 C1 Ⅱ的每一份
DNA分别等量混合 ,取 DNA 混合液各一份 ,进行琼
脂糖凝胶电泳 ,稳压 80 V , 以 1 kb Plus ladder 为
Marker ,利用天能凝胶成像系统检测是否提取到目
的DNA ,照相 ,并用紫外分光光度仪确定其浓度。
1.2.3.2　PCR反应条件与反应体系　参照Williams
等[ 18 ,19]方法 ,进行 PCR试验 。
聚合酶链式反应(PCR)的条件设置为:94℃预
变性 3 min ,94℃变性 1 min , 37℃退火 1 min , 72℃延
伸 1.5 min , 40 次循环 , 最后 72℃延伸 5 min , 4℃
保存 。
反应体系 12 μL:20 ng/μL 的基因组 DNA 1 μL
(混合样), 10×PCR Buffer 1.5 μL(已包含 Mg2+ ,其
原浓度为 15 mmol), 0.2 μmol/μL 引物 0.5 μL , 5
U/μL Taq 酶 0.1 μL , 10 mmol/L dNTPS 1 μL , ddH2O
7.9 μL。RAPD反应在 Biometrer 热循环仪上进行 。
每次 PCR做一个阴性对照(不加模板)。PCR做重
复试验。
电泳及照相:PCR产物在 1.2%的琼脂糖凝胶
上电泳 , 以 1 kb Plus ladder 为Marker ,稳压 80 V ,然
后在天能凝胶成像系统下照相 。
1.2.4　同工酶电泳和 RAPD结果的分析方法　同
工酶电泳的电泳结果通过分析电泳条带的区别 ,来
分析不同生育期内同工酶的表达情况。
RAPD电泳结果用 20个随机引物进行 PCR扩
增 ,引物为上海 Sangon 生产的 S5 、S48 、S52 、S67 、
S126 、S127 、S131 、S133 、S134 、S138 、S140 、S141 、S156 、
S318 、S442 、S447 、S456 、S459 、S484 、S489 ,电泳结果采
用加拿大 Alberta 大学的 Popgen32分析软件计算遗
传一致度和遗传距离 。分析杂种后代和双亲的亲缘
关系 。构建聚类树。
2　结果与分析
2.1　不同生育期酯酶同工酶(EST)的遗传分析
由图 1 ～ 4和表 2可知 ,在不同的生育期 , EST
的表达不同 ,而且差异很大 ,可见 EST 的表达是受
生长发育调控的 。
在春季分蘖期 EST 酶谱较多 ,共有7条酶带 ,亲
本加拿大披碱草和老芒麦有 2条相同的基带(Rf为
0.1和 0.8),加拿大披碱草有4条特征带(Rf为 0.2 ,
0.3 ,0.5和 0.88),老芒麦有 2条特征带(Rf为 0.02
和0.72)。F1共有 7条酶带 ,其中有2条来自父本老
芒麦的特征带(Rf为 0.02和 0.72),同时还丢失了 1
条来自母本的带(Rf为 0.3),剩余的条带来自于双
亲 ,这证明 F1 是真正的杂种 ,而且偏向于母本 。C0
Ⅰ和 C1Ⅱ与 F1 基本相同 ,只是 C0 Ⅰ比 F1 少了 1条
Rf为 0.72的酶带 ,C1Ⅱ比 F1 少了 1条 Rf为 0.02的
酶带;C1 Ⅰ和 C0 Ⅱ比F1 少了3条酶带(Rf=0.2 ,0.5 ,
0.72),剩下的酶带与 F1的相同;由此可知这些杂种
后代都来自于双亲加拿大披碱草和老芒麦 。
1.加拿大披碱草;2.老芒麦;3.F1;4.C0I;
5.C1I;6.C0II;7.C1II ,下同。
1.E.canadensisi;2.E .Sibiricus;3.F1;4.C0I;
5.C1I;6.C0II;7.C1II.The same belowed.
图 1　返青期的 EST图谱
Fig.1　Map of EST in regreen
图 2　孕穗期的 EST图谱
Fig.2　Map of EST in booting
图 3　抽穗期的 EST图谱
Fig.3　Map of EST in heading
图 4　开花期的 EST图谱
Fig.4　Map of EST in flowering
孕穗期的酶带有所减少 ,一共只有 4条 ,而且分
40　 华　北　农　学　报 24卷
布较分散 ,双亲共有 1条共同的酶带(Rf 为 0.8),加
拿大披碱草和老芒麦各只有 1条特征带(Rf为分别
0.88 ,0.72);F1 、C0 Ⅰ 、C0 Ⅱ、C1 Ⅰ各有 3条酶带 ,而且
都是来自双亲的酶带;C1 Ⅱ除了上述酶带外 ,比其他
6个群体多出 1条 Rf为 0.5的酶带。因此在这个时
期可以利用 EST 来鉴定杂种。
　　抽穗期也只有 4 条酶带 ,双亲共有的基带为 1
条(Rf =0.8), 加拿大披碱草有 1 条特征带(Rf=
0.88),老芒麦有 1 条特征带(Rf=0.72);F1、C0 Ⅰ 、
C0Ⅱ 、C1 Ⅱ都只剩下 2条酶带(Rf=0.72 , 0.8);C1 Ⅰ
有3条酶带 ,比 F1、C0 Ⅰ 、C0 Ⅱ、C1 Ⅱ多出 1条 Rf为
0.5的酶带。此生育期杂种后代的酶谱与父本老芒
麦的相同 ,因此该生育期不能用 EST 鉴定杂种 。
开花期酶带也是 4条 ,与孕穗期的酶带相同 ,在
这个时期也可以利用 EST 来鉴定杂种 。
在4个生育期中只有 Rf=0.8 的酶带一直存
在。但是在不同的生育期出现了差异表达 ,在分蘖
期 ,杂种后代的 EST酶谱偏向加拿大披碱草 ,即 EST
的遗传继承了母本的特征;在孕穗期 、开花期 EST
酶谱很少 ,但是含概了双亲的所有酶带;抽穗期杂种
后代的 EST 酶谱基本与老芒麦的相同。所以利用
EST 酶谱鉴定加拿大披碱草与老芒麦的杂种的最佳
生育期是春季分蘖期 ,孕穗期 、开花期也可以 。
图 5　分蘖期的 SOD 图谱
Fig.5　Map of SOD in tiller
2.2　不同生育期 SOD同工酶的遗传分析
由图 5 ～ 8和表 3可知 ,在 4个生育期中SOD
的表达的酶带数量上没有差异 ,只是在抽穗期老芒
麦的 SOD酶带多了 1条(Rf=0.44),其他条带都相
同。从条带的的亮度上看 ,前 3个生育期双亲第 1
条酶带的亮度稍亮些 ,说明 SOD的浓度较大 ,表达
的量多 ,到了开花期 C0 Ⅱ和 C1 Ⅱ的第 1条酶带较
亮。由此看来 ,SOD表达的差异只是体现在表达量
的多少上 。
图 6　孕穗期的 SOD图谱
Fig.6　Map of SOD in booting
图 7　抽穗期的 SOD图谱
Fig.7　Map of SOD in heading
图 8　开花期的 SOD图谱
Fig.8　Map of SOD in flowering
表 2　加拿大披碱草和老芒麦及其杂种后代不同生育期 EST同工酶酶带位置(RF)
Tab.2　EST isozyme PAGE maps of parents and its hybrids
材料
Material
酶带顺序(Rf值)Isozyme band No.
0.02 0.10 0.20 0.30 0.50 0.72 0.80 0.88
分蘖期 Tiller 加拿大披碱草 0 1 1 1 1 0 1 1
老芒麦 1 1 0 0 0 1 1 0
F1 1 1 1 0 1 1 1 1
C0Ⅰ 1 1 1 0 1 0 1 1
C1Ⅰ 0 1 1 0 0 0 1 1
C0Ⅱ 0 1 1 0 0 0 1 1
C1Ⅱ 0 1 1 0 1 1 1 1
孕穗期 Booting 加拿大披碱草 0 0 0 0 0 0 1 1
老芒麦 0 0 0 0 0 1 1 0
F1 0 0 0 0 0 1 1 1
C0Ⅰ 0 0 0 0 0 1 1 1
C1Ⅰ 0 0 0 0 0 1 1 1
6期 李景环等:加拿大披碱草与老芒麦及其杂种后代同工酶和 RAPD遗传分析 41　
续表
材料
Material
酶带顺序(Rf值)Isozyme band No.
0.02 0.10 0.20 0.30 0.50 0.72 0.80 0.88
C0Ⅱ 0 0 0 0 0 1 1 1
C1Ⅱ 0 0 0 0 1 1 1 1
抽穗期 Heading 加拿大披碱草 0 0 0 0 0 0 1 1
老芒麦 0 0 0 0 0 1 1 0
F1 0 0 0 0 0 1 1 0
C0Ⅰ 0 0 0 0 0 1 1 0
C1Ⅰ 0 0 0 0 1 1 1 0
C0Ⅱ 0 0 0 0 0 1 1 0
C1Ⅱ 0 0 0 0 0 1 1 0
开花期 Flowering 加拿大披碱草 0 0 0 0 0 0 1 1
老芒麦 0 0 0 0 0 1 1 0
F1 0 0 0 0 0 1 1 1
C0Ⅰ 0 0 0 0 0 1 1 1
C1Ⅰ 0 0 0 0 0 1 1 1
C0Ⅱ 0 0 0 0 0 1 1 1
C1Ⅱ 0 0 0 0 1 1 1 1
　注:1代表有;0代表无。表 3同。
　Note:Number 1 and 2 mean yes and no representatively.The same as Tab.3.
表 3　加拿大披碱草和老芒麦及其杂种后代不同生育期 SOD同工酶酶带位置(RF)
Tab.3　SOD isozyme PAGE maps of parents and its hybrids
材料Material 酶带顺序(Rf 值)Isozyme band No.
0.44 0.50 0.64 0.72
分蘖期 Tiller 加拿大披碱草 0 1 1 1
老芒麦 0 1 1 1
F1 0 1 1 1
C0Ⅰ 0 1 1 1
C1Ⅰ 0 1 1 1
C0Ⅱ 0 1 1 1
C1Ⅱ 0 1 1 1
孕穗期 Booting 加拿大披碱草 0 1 1 1
老芒麦 0 1 1 1
F1 0 1 1 1
C0Ⅰ 0 1 1 1
C1Ⅰ 0 1 1 1
C0Ⅱ 0 1 1 1
C1Ⅱ 0 1 1 1
抽穗期 Heading 加拿大披碱草 0 1 1 1
老芒麦 1 1 1 1
F1 0 1 1 1
C0Ⅰ 0 1 1 1
C1Ⅰ 0 1 1 1
C0Ⅱ 0 1 1 1
C1Ⅱ 0 1 1 1
开花期 Flowering 加拿大披碱草 0 1 1 1
老芒麦 0 1 1 1
F1 0 1 1 1
C0Ⅰ 0 1 1 1
C1Ⅰ 0 1 1 1
C0Ⅱ 0 1 1 1
C1Ⅱ 0 1 1 1
2.3　加拿大披碱草与老芒麦及其杂种后代 RAPD
分析
在40个引物中筛选出 20个引物 ,引物 、扩增的
条带 、基因位点多态性位点百分率见表 4。遗传距
离见表5 。
由表 4可知 ,20个引物共扩增出 1 485条带 ,基
因位点为 257个 ,多态性位点的百分率为 17.24%。
由此看来 ,种间的多态性并不是很高 ,说明亲本与后
代之间基因的同源性很高。由电泳图可知除了C1 Ⅱ
群体内的多态性较高外 ,其他种内基因位点的一致
性很高 ,每个单株的图谱基本一样 。
由表5可知 ,加拿大披碱草与老芒麦的遗传一致
42　 华　北　农　学　报 24卷
度为0.72 ,遗传距离为0.328 5 ,是7个群体中亲缘关系
最远的一对。杂种后代与双亲的亲缘关系表现为与母
本加拿大披碱草较近 ,而与父本老芒麦的亲缘关系相
对较远。由图 9可知 7个群体中 ,杂种后代先聚到一
起 ,然后才和亲本聚为一类 ,说明后代之间的关系较
近。后代与母本的亲缘关系比与父本的近。
表 4　引物及其序列和扩增结果
Tab.4　List of primer labels , primer sequences and amplification results
引物
Primer
序列(5′-3′)
Sequence
总扩增带数
Total loci
多态性扩增带数
Polymorphism loci
多态位点百分率/ %
Polymorphism percentage
S5 TCCGCTCTGG 104　　　 17 16.34
S48 GTGTGCCCCA 82　　　 14 17.07
S52 CACCGTATCC 84　　　 13 15.48
S67 GTCCCGACGA 68　　　 13 19.11
S126 GGGAATTCGG 82　　　 13 15.85
S127 CCGATATCCC 82　　　 16 19.51
VS131 TTGGTACCCC 82　　　 10 12.19
S133 GGCTGCAGAA 63　　　 11 17.46
S134 TGCTGCAGGT 48　　　 9 36.21
S138 TTCCCGGGTT 69　　　 15 21.73
S140 GGTCTAGAGG 66　　　 11 16.67
S141 CCCAAGGTCC 73　　　 15 20.54
S156 GGTGACTGTG 74　　　 12 17.57
S318 GACTAGGTGG 58　　　 13 22.41
S442 ACGTAGCGTC 67　　　 10 14.92
S447 CAGCACTGAC 84　　　 15 17.86
S456 TCGGCGGTTC 53　　　 13 24.53
S459 GGTGCACGTT 78　　　 13 16.67
S484 AGTGCGCTGA 92　　　 14 15.22
S489 GGCTAACCGA 76　　　 10 13.16
Total 20 1 485　　　 257 17.24
表 5　双亲及杂交后代遗传一致度和遗传距离的计算结果
Tab.5　Measures of genetic identity and genetic distance
popID 1 2 3 4 5 6 7
1 ＊＊＊＊ 0.720 0 0.752 9 0.754 3 0.794 8 0.772 8 0.776 4
2 0.328 5 ＊＊＊＊ 0.746 7 0.747 9 0.784 3 0.722 1 0.774 9
3 0.284 5 0.292 0 ＊＊＊＊ 0.842 5 0.772 2 0.783 8 0.844 5
4 0.285 4 0.290 4 0.171 4 ＊＊＊＊ 0.810 3 0.801 8 0.868 9
5 0.241 3 0.243 0 0.258 5 0.210 3 ＊＊＊＊ 0.792 5 0.857 2
6 0.257 7 0.325 5 0.252 6 0.220 9 0.232 5 ＊＊＊＊ 0.784 4
7 0.251 1 0.255 1 0.169 0 0.140 5 0.154 0 0.242 8 ＊＊＊＊
　注:1.加拿大披碱草 ;2.老芒麦;3.杂种 F1;4.C0Ⅰ ;5.C1Ⅰ;6.C0Ⅱ;7.C1Ⅱ;左下角遗传距离 ,右上角遗传一致度。
　Note:Numbers from 1 to 7 are E .canadensisi , E .sibiricus , F1 , C0Ⅰ , C1Ⅰ , C0Ⅱand C1Ⅱ representatively.Numbers under star are genetic distance and that
up star are genetic identity.
　　由电泳图可以看出(图 9 ～ 15),老芒麦扩增的
条带比加拿大披碱草扩增的条带数要丰富的多 ,在
杂种后代的条带中 ,除了新增的特异条带外(S5 、
S52 、S67 、S126 、S127 、S133 、S141 、S156 、S318 、S459 、
S484),还出现了互补双亲的条带(除了 S134外 ,在
所有的引物中都均有分布)。在引物 S5 下 F1 出现
了分子量为 200 bp 左右和接近 500 bp的 2条特异
带 ,C0 Ⅰ出现了分子量为 200 bp左右的一条带 。S52
的产物中 ,F1和C1Ⅰ出现了分子量为 600 bp左右的
条带 。S67的产物中 ,F1和 C0 Ⅰ出现了分子量为约
1 000 ～ 1 600 bp 的 2 条带 。S126 的产物中 F1 和
C0Ⅰ出现了分子量约为 1000 bp和500 bp的2条带 。
S127的产物中 ,F1 和C0 Ⅰ出现了分子量约为 2 000 ,
200 ,100 kb的特异条带。S133的产物中 F1 和 C0 Ⅰ
出现了分子量接近 700 bp和接近 400 bp 的特异条
带。S141的产物中 ,F1和 C0 Ⅰ和 C1 Ⅰ出现了900 bp
的一条带 C0 Ⅰ还出现了 1 000 bp 多一点的条带 ,
C1 Ⅰ还出现了 1 700 bp左右的条带。S156的产物
中 ,C0Ⅰ出现了接近400 bp一条特异带 ,C1Ⅰ出现了
接近400 bp和接近 1 000 bp的2条带。S318的产物
中 ,出现了接近 400 bp和接近 500 bp的 2条特异条
带。S459的产物中 ,F1出现了接近 500 bp的特异条
带。S484的产物中 ,F1出现了 600 bp左右的特异条
带。在 C1 Ⅱ中 ,由于样本容量大 ,再加上该群体本
身是性状分离程度大的一代 ,基因丰富 ,含概了以上
所有的特异性的条带。这些特异性条带的出现 ,可
6期 李景环等:加拿大披碱草与老芒麦及其杂种后代同工酶和 RAPD遗传分析 43　
能与杂种后代的杂种优势和育性有一定的关系。
图 9　7 个群体的 RAPD聚类图
Fig.9　RAPD Classific figure of 7 population
图 10　加拿大披碱草引物 S5 扩增图谱
Fig.10　PCR amplification results of S5 on E.canadensis
图 11　老芒麦引物 S5扩增图谱
Fig.11　PCR amplification results of S5 on E.sibiricus
图 12　F1引物 S48 扩增图谱
Fig.12　PCR amplification results of S48 on F1
图 13　C1Ⅰ引物 S127 扩增图谱
Fig.13　PCR amplification results of S127 on C1Ⅰ
图 14　C0Ⅱ引物 S127 扩增图谱
Fig.14　PCR amplification results of S127 on C0Ⅱ
图 15　C1Ⅱ引物 S127 扩增图谱
Fig.15　PCR amplification results of S127 on C1Ⅱ
3　讨论
3.1　同工酶的表达与生育期的关系
从本试验的结果看 ,EST 的表达 ,在不同的生育
期酶谱的差异很大 ,这一点既体现在同种内 ,也体现
在亲本和杂交后代之间 ,而且无规律可寻。用 EST
谱带特征可以鉴定杂种 ,但是要选择合适的生育期 ,
否则很难鉴定。而 SOD的谱带的特征在所有生育
期都一样 ,只是表达的量有多有少 。不能用来鉴定
杂交种的真实性。
3.2　RAPD标记在育种中的应用
RAPD技术是基于聚合酶链式反应原理 ,通过
运用不同核苷酸序列的随机引物(通常为 10 个碱
基)对基因组进行扩增 ,对扩增产物进行电泳 ,寻找
多态性标记。这类标记通常是显性遗传 ,由于它在
技术上简单 ,也无需对基因组序列有多少了解 ,只要
合成一套随机引物就可用于作物物种 ,因而应用最
为广泛 。张立异等经过大量引物筛选 ,应用 RAPD
技术证实节节麦和野燕麦的六倍体与八倍体杂种的
真实性。利用 RAPD技术证实显性效应是水稻杂种
优势形成的遗传基础 。RAPD分子标记作为一种快
速简捷 、有效的检测手段 ,已被广泛应用于植物种子
纯度及杂交后代的鉴定和杂种优势 的预测
上[ 20-23] 。
4　结论
EST 同工酶在 4个生育期中共表达 8条酶带 ,
无规律的分布在各个生育期 ,具有较高的多态性 ,在
分蘖期杂种的 EST 酶谱偏向母本 ,在该生育期内可
以用酶谱的特征来鉴定杂种的真实性 。而在另外的
44　 华　北　农　学　报 24卷
3个生育期中 ,酶谱的特征偏向父本 ,光从谱带的特
征上都不能很好地鉴定杂种。SOD的表达的酶带数
量上没有差异。只是在抽穗期老芒麦的 SOD酶带
多了 1条(Rf=0.44),其他条带都相同 ,差别在于酶
的浓度大小。
在 RAPD分析表明 ,加拿大披碱草与老芒麦的
遗传一致度为 0.72 ,遗传距离为 0.328 5 ,是 7 个群
体中亲缘关系最远的 。杂种后代之间的遗传距离相
对较近这些可为加拿大披碱草与老芒麦的遗传改良
提供科学依据和理论指导 。
老芒麦扩增的条带比加拿大披碱草 RAPD扩增
的条带数要丰富的多 ,在杂种后代的条带中 ,除了新
增的特异条带外(S5 、S52 、S67 、S126 、S127 、S133 、
S141 、S156 、S318 、S459 、S484),还出现了互补双亲的
条带(除了 S134外 ,在所有的引物中都均有分布)。
这些特异性条带的出现 ,可能与杂种后代的杂种优
势和育性有一定的关系。由于 RAPD所用的随机引
物是 10 bp的寡聚核苷酸 ,同时 ,扩增反应还受到模
板DNA用量 、dNTP 、Mg2+及 Taq 酶浓度等诸多因素
的影响 ,因而 RAPD技术较其他分子标记(如 RFLP)
稳定性差 ,限制了它更广泛的应用。要想得到很好
的试验结果 ,必须对 RAPD的 PCR反应体系和条件
进行筛选与优化 。
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