全 文 ：偃麦草根茎蛋白质对冰晶修饰能力的观察
收稿日期：2006-09-28
基金项目：黑龙江省科技攻关项目（GC04B115）
作者简介：龚束芳（1971-），女，浙江人，博士研究生，副教授，
研究方向为草坪逆境生理与品种选育。
*通讯作者E-mail:rxliang@neau.edu.cn
龚束芳，杨 涛，陶洪波，沈能展*
（东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）
摘 要：以黑龙江省野生偃麦草为试验材料，选取冬季、春季和夏季的偃麦草根茎，提取全蛋白和非质体蛋
白，通过对3个时期蛋白质进行SDS-PAGE分析，发现全蛋白中有冬春季节特有的两条蛋白多肽，分子量分别是
52ku和26ku，其中52ku在非质体蛋白电泳谱中出现。同时在相差显微镜下观察到冬季非质体蛋白提取液具有
将冰晶生长修饰为六角形的能力，说明偃麦草非质体蛋白内含有抗冻蛋白，而52ku蛋白可能为抗冻蛋白。
关键词：偃麦草；抗冻蛋白；冰晶修饰
中图分类号：Q511，S543 文献标识码：A
一个世纪以来，揭示生物抗冻机理一直是科学
家努力追求的目标之一。抗冻蛋白（Antifreeze
protein,AFP）是一类能够保护生物有机体免受结冰
引起伤害的蛋白质，具有3个基本特征[1]：冰晶形
态效应、热滞效应、重结晶抑制效应。抗冻蛋白自
20世纪60年代末被发现以来，引起了许多实验室
的研究兴趣。目前人类已经从鱼类、昆虫、植物
等许多物种中发现了抗冻蛋白的存在。
AFPs对冰晶形态具有明显的修饰效果，AFPs
通过特异地吸附于冰晶表面，阻止冰晶生长，最
终导致AFPs的热滞（Thermalhysteresis,TH）活性和
重结晶抑制（Recrystalizationinhibition）活性[2]现象
的发生。许多研究证明，抗冻蛋白对冰晶的修饰
可改变冰晶的形状，形状各异，大小也差别较大，
但基本上可分为两大类：六棱双金字塔（Hexagonal
bipyramid）和六棱盘（Hexagonalplate）或六棱柱
（Hexagonalcolumn）[3]。抗冻蛋白对冰晶形态的修饰
作用，已经成为检验蛋白质是否具有抗冻活性的
一项重要指标[4-5]。
偃麦草（Elytrigiarepens）又称速生草、伏冰草，
是禾本科小麦族偃麦草属多年生根茎型草本，为
黑龙江省广泛分布的野生的草种类型，具有极强
的抗逆能力，抗寒性尤为突出，正常年份绿色期
可达240d左右[6]。
本试验以哈尔滨地区野生偃麦草为材料，利用
相差显微镜观察冰晶生长习性，比较鉴定不同时期
偃麦草蛋白质对冰晶修饰能力，为抗冻蛋白的鉴定
探索一种便捷手段，也为植物抗冻机制的研究提供
一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
偃麦草取自东北农业大学园艺设施中心圃地。
取材时间分别为夏季（8月中旬）；冬季（1月中旬）
和春季（4月初）。
1.2 方法
1.2.1 非质体蛋白的提取
收集3个时期偃麦草的根茎去除枯黄和干死部
分，非质体蛋白质提取参照Hon等[7]的方法。
1.2.2 全蛋白的提取
参照文献[8]方法提取偃麦草全蛋白。
1.2.3 蛋白含量的测定
Bradford法测定蛋白质浓度。用牛血清蛋白作
标准曲线。
1.2.4 蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳的分析
SDS-PAGE凝胶按照文献[8]的方法配制。分
离胶浓度为 18%，浓缩胶浓度为 5%，采用“天
为时代”的低分子量标准蛋白作为标准，其分子
量范围为 14.4~94.0ku，考马斯亮蓝 R-250染
色，紫外凝胶成像分析系统进行胶片的拍照与
第38卷 第6期 东 北 农 业 大 学 学 报 38(6):753~756
2007年 12月 JournalofNortheastAgriculturalUniversity Dec.2007
文章编号 1005-9369（2007）06-0753-04
图 1 3个时期偃麦草全蛋白（A）偃麦草非质体蛋白（B）
Fig.1 Theprotein(A)andtheapoplasticprotein(B)fromthreetimesofElytrigiarepens
分析。
1.2.5 冰晶修饰能力的观察
用相差显微镜和摄像装置观察冰晶生长习性，
并记录溶液冰晶形态。
2 结果与分析
2.1 偃麦草根茎蛋白质SDS-PAGE图谱
将偃麦草夏季、冬季、春季的全蛋白和非质
体蛋白进行SDS-PAGE分析，调节各时期同类蛋
白质的含量至相同浓度，以便于观察三者间蛋白
质条带间存在的差异。电泳胶板经考马斯亮蓝
R-250染色后，用紫外凝胶成像分析系统进行胶
片拍照。结果见图1。
由图1A偃麦草根茎夏季与冬季和春季的全蛋
白相比较，发现春季和冬季偃麦草根茎蛋白图谱十
分相近，冬季根茎蛋白明显比夏季多出两条，一条
分子量约26ku的蛋白肽带，一条分子量约52ku
的蛋白肽带。从图 1B非质体蛋白（0.2mg·mL-1）
SDS-PAGE电泳条带比较来看，箭头所示的分子量
约52ku的蛋白在冬季根茎中条带清晰，而在夏季
根茎中表现不明显，26ku的蛋白质浓度可能含量
过低，没能在冬季根茎非质体蛋白中染出明显条
带，但在全蛋白中是冬季明显比夏季多出来的，也
应该在越冬中起一定作用。因此推测，分子量约
52ku和26ku的蛋白可能在偃麦草根茎越冬和抗
冻中起重要作用的抗冻蛋白。
1-夏季；2-冬季；3-春季；4-标准蛋白
1-Summer;2-Winter;3-Spring;4-ProteinMarker
2.2 偃麦草根茎非质体蛋白质对冰晶修饰能力的
观测
Grifith[4]对抗冻蛋白修饰冰晶形态的研究表
明，在ddH2O或没有抗冻活性的溶液中，冰晶沿
a-轴基面片层叠加生长，形成圆形的冰晶；在低
浓度抗冻蛋白溶液中，抗冻蛋白主要抑制冰晶沿
a-轴生长，c-轴生长的结果使冰晶呈六棱柱，显
微镜下观察到的冰晶俯视图是六角形；在较高浓
度抗冻蛋白溶液中，抗冻蛋白结合到冰晶棱柱面，
抑制冰晶在c-轴的生长，冰晶主要沿基面a-轴生
长，形成双金字塔形冰晶；在高浓度抗冻蛋白溶
液中，冰晶沿c-轴和a-轴的生长都受到抑制，形
成针形冰晶。
抗冻生物避免冰冻伤害必须满足两个条件：
①冰必须在胞外形成；②冰晶的大小及形状要受
到控制[9-10]，因此非质体中蛋白质对冰晶的修饰作
用尤为重要。在本实验中观察到冬季和春季的偃
麦草根茎非质体蛋白提取液中存在抗冻活性物质，
在显微镜下观察到大量的六角形冰晶形成（见图2
A，B）；夏季根茎和叶片中未检测出抗冻活性物
质，冰晶无明显颗粒状，小冰晶呈圆形和椭圆形
增长（见图2C）。
本实验还观察到，被修饰成六角形的冰晶随着
温度的继续降低，冰晶将向四周放射状生成，形成
枝状冰晶（见图3）。这一点与刘俊杰等[11]研究含抗
冻糖蛋白溶液中的冰晶自由生长习性相似。说明在
偃麦草非质体蛋白中，具有修饰冰晶活性的蛋白质
可能是含有糖基的抗冻糖蛋白。
·754· 东 北 农 业 大 学 学 报 第38卷
为确定偃麦草冬春季节非质体蛋白质对冰晶的
修饰效应，我们对蛋白质提取缓冲液和超纯水形成
冰晶的习性进行了观察，蛋白质提取缓冲液形成的
单体冰晶成圆形（见图4A），超纯水形成的冰晶未
观察到单体冰晶形成，但冰晶形成的边缘明显呈圆
形，与偃麦草冬春季节非质体蛋白对冰晶生长习性
的影响有显著差异。因此确定，偃麦草冬春季节非
质体内含有具抗冻活性的蛋白质，夏季材料中不含
或只有含量过低的抗冻活性蛋白质，以致不能表现
出对冰晶的修饰作用。
4 讨 论
自然界中许多生物可以在较冷的环境中生存，
现代研究发现，使生物产生抗冻能力的原因之一
是它们的体内存在一种抗冻活性物质，即蛋白质
多肽链，影响冰晶的生长习性，当它们存在于水
溶液中时，不仅能够改变冰晶的生长点温度，使
溶液出现过冷现象，还能影响冰晶的生长速率和
生长习性。
黑龙江省普遍生长的乡土草种偃麦草在初冬时
节，零下5℃的冻土温度下分蘖依然在进行，黑龙
江省冬季极端低温对其返青无任何不良影响，具有
极强的抗冻能力[6]。本实验发现冬季和春季比夏季
根茎中明显多出两条差异蛋白肽条带，分子量分别
为52ku和26ku，冬季和春季非质体蛋白中均检
测出52ku蛋白，同时观察到偃麦草冬季和春季非
质体蛋白中具有可修饰冰晶的能力，因此，分子量
为52ku的蛋白多肽可能是产生修饰冰晶能力的抗
冻蛋白。
由于AFPs具有特殊的性质，它一经发现就引
起了人们的兴趣。但由于比较复杂的技术原因，对
于抗冻蛋白的研究还未能在许多植物研究中普及，
抗冻蛋白的鉴定、分离和纯化以及近一步的了解所
需的技术手段还远未能达到理想的效果。但是，抗
冻蛋白作为完整生理活性中的一部分，对它的了解
和应用无疑将为提高植物抗冻性提供新的途径。
A B
图 2 偃麦草春季（A）冬季（B）和夏季（C）根茎非质体蛋白
Fig.2 Theapoplasticproteinfromspring(A),winter(B)andsummer(C)
A B C
图 3 偃麦草根茎非质体蛋白形成六角形冰晶（A）与过冷时枝状冰晶的形成（B，C）
Fig.3 Theapoplasticproteinappearedhexagonalicecrystal(A)andbranchicecrystalinover-cold(B,C)
A B C
图 4 蛋白质提取液（A）和纯水（B）形成冰晶的形态
Fig.4 Theformoficecrystalfromextractedprotein(A)
anddeionizedwater(B)
龚束芳等：偃麦草根茎蛋白质对冰晶修饰能力的观察 ·755·第6期
Observationontheactivityoftheproteinfromtherhizome
Elytrigiarepenstomodifytheicecrystal
GONGShufang,YANGTao,TAOHongbo,SHENNengzhan
(ColegeofHorticulture,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)
Abstract:Inwinter,springandsummer,selectedrhizomeofthewildElytrigiarepensofHeilongjiang
Provincetoextracttheproteinandtheapoplasticprotein.ThroughassayingSDS-PAGEofthreetimesprotein,we
foundtherehadtwospecificpeptideinproteinfromwinter,theirmolecularweightwere52kuand26ku,the52
kuhadbeenfoundintheapoplasticproteinelectrophoresis.Withthephase-contrastphotomicroscope,we
observedthattheapoplasticproteinfromwinterhadtheabilitytomodifythegrowthoficecrystalwhichappeared
hexagonalinshape,thismeanstheproteinof52kuislikelytheantifreeze-protein.
Keywords:Elytrigiarepens;antifreeze-proteins;icecrystalmodifying
[ 参 考 文 献 ]
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·756· 东 北 农 业 大 学 学 报 第38卷