全 文 ：中国农学通报 2012,28(31):146-152
Chinese Agricultural Science Bulletin
基金项目：林业公益性行业科研专项“麻疯树基因工程与抗寒育种研究”(200904038)。
第一作者简介：张振华，男，1985年出生，河南林州人，硕士研究生，主要从事植物基因工程研究。通信地址：410004湖南省长沙市韶山南路498号中
南林业科技大学生物环境科学与技术研究所，E-mail：vipveny@163.com。
通讯作者：陈介南，男，1961年出生，湖南安化人，教授，主要从事生物能源与生物环境研究。通信地址：410004湖南省长沙市韶山南路498号中南林
业科技大学生物环境科学与技术研究所，Tel：0731-85623075，E-mail：chenj@besti.org。
收稿日期：2011-11-02，修回日期：2012-08-11。
胡萝卜与黄粉虫抗冻融合基因在拟南芥中的
表达与抗冻性分析
张振华 1，陈介南 1，卢孟柱 2，章怀云 1，刘伯斌 1
（1中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所，长沙 410004;2中国林业科学研究院林业研究所，北京 100091）
摘 要：抗冻蛋白(antifreeze protein, AFP)是一类能控制冰晶生长和抑制冰晶之间发生重结晶的蛋白质，
能在低温结冰条件下保护生物体不受伤害。抗冻蛋白具有2种明显不同的抗冻活性——热滞(thermal
hysteresis, TH)活性和重结晶抑制(recrystallizationinhibition, RI)活性。鱼类和昆虫抗冻蛋白的特征是高
TH低RI活性，而植物抗冻蛋白的特征是低 TH高RI活性。为了获得高 TH、高RI活性的抗冻蛋白
(antifreeze protein, AFP)，克隆得到胡萝卜抗冻蛋白基因(DcAFP)和黄粉虫抗冻蛋白基因(TmAFP)cDNA
全序列。通过重叠延伸PCR，将2个基因前后串联构建融合基因Dc-TmAFP和Tm-DcAFP，并构建了植
物表达载体，通过农杆菌介导转化模式植物拟南芥，成功获得4个基因的转基因拟南芥植株。对转基因
拟南芥植株进行抗冻试验处理，并进行了存活率统计和叶片黄化率统计分析。分析结果表明，不同功能
的抗冻蛋白对植物的抗冻性有不同的帮助，热滞效应高效的黄粉虫抗冻蛋白对植物降低冰点方面效果
大，而在植物遭受较长时间冻害时，抑制重结晶效应高效的胡萝卜抗冻蛋白对植物质外体中流体保持稳
定性作用较大，从而提高植物的耐冻能力。
关键词：抗冻蛋白；融合基因；抗冻性
中图分类号：Q946 文献标志码：A 论文编号：2011-3160
Expression and Antifreeze Feature Analysis of the Daucus carota and Tentbrio molitor
Fusion Antifreeze Protein Gene in Arabidopsis thaliana
Zhang Zhenhua1, Chen Jienan1, Lu Mengzhu2, Zhang Huaiyun1, Liu Bobin1
(1Institute of Biological and Environmental Science & Technology,
Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004;
2Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091)
Abstract: Antifreeze proteins (AFPs) are a family of proteins capable of protecting organisms from damage in
freezing or sub-freezing conditions by controlling the growth of ice and inhibiting the recrystallization between
ice granules, which are termed thermal hysteresis (TH) activity and recrystallization inhibition (RI) activity
respectively. In comparison with the characteristic of high TH and low RI of fish AFPs and insect AFPs,
antifreeze proteins of plants was low TH and high RI activity. In order to obtain antifreeze proteins with high
TH and high RI activity, the complete cDNA of antifreeze protein genes (DcAFP and TmAFP) were cloned from
Daucus carota and Tentbrio molitor. The two fusion antifreeze protein genes, Dc-TmAFP and Tm-DcAFP,
were constructed series before and after by overlap extension PCR. The four genes were successfully
transferred into Arabidopsis thaliana via Agrobacterium tumefaciens, and then the transgenic plants were cold
张振华等：胡萝卜与黄粉虫抗冻融合基因在拟南芥中的表达与抗冻性分析
0 引言
抗冻蛋白(antifreeze protein，AFP)是一种具有阻
止体液内冰核的形成与生长、维持体液的非冰冻状态
的高效抗冻物质，最早是由美国加利福尼亚大学的
DeVries等[1]在 20世纪 60年代从极区海鱼的血清中发
现的。它能以非依数的形式（冰晶的熔点温度与其生
长点温度不具有相同的变化）降低水溶液的冰点而对
熔点影响甚微[2]，从而产生冰点和融点的差值，这个值
即为热滞值，它的高低可以用来衡量抗冻蛋白抗冻活
性的强弱[3]。抗冻蛋白的主要特征是产生热滞效应和
重结晶抑制效应，耐寒生物如大多数昆虫和鱼类的抗
冻蛋白主要通过热滞效应来保护机体免受冻害，而对
于可以忍受胞间结冰的耐冻生物如大多数越冬植物和
少数昆虫的抗冻蛋白则主要通过重结晶抑制效应来降
低生物有机体因结冰引起的伤害。
目前已经在鱼类、昆虫、植物、细菌和真菌体内发
现多种抗冻蛋白[4-5]，在自然选择和平行进化作用下,这
些蛋白质结构呈现多样性[6]。昆虫抗冻蛋白的热滞效
应值一般为 3~6℃，相对于鱼类抗冻蛋白的 0.7~1.5℃
和植物抗冻蛋白的0.2~0.5℃，昆虫抗冻蛋白具有极高
的热滞活性[7]。植物抗冻蛋白降低冰点的能力没有鱼
类和昆虫的抗冻蛋白强，但是在抑制冰晶重结晶方面
植物抗冻蛋白却是最强的，比后者高出约10~100倍[8]。
自 20世纪 80年代，鱼类的抗冻蛋白结构被研究清楚
以后，人们先后将其转入烟草、油菜、玉米和番茄等作
物 [9-10]，试图提高这些作物的抗寒性，但结果却离人们
的期望相差较远。Wallis等[11]将一段融合有植物血球
凝集素(PHA)信号肽的合成抗冻蛋白在马铃薯中表
达，降低了转基因植物叶片的电解率，第一次证明了植
物的抗寒表型与抗冻蛋白表达的相关性。Hansen等[12]
直接通过显微镜观察黄粉虫抗冻蛋白热滞效应，测得
热滞值为 7，而通过差示扫描量热仪测得黄粉虫抗冻
蛋白热滞效应值为10，充分说明黄粉虫抗冻蛋白热滞
效应的高效性。Huang等[13]将赤翅甲抗冻蛋白基因成
功导入拟南芥中并在转基因株系细胞提取物中检测到
具有热滞活性的抗冻蛋白的表达。Worrall等[14]将从冷
驯化的胡萝卜中克隆到得抗冻蛋白基因并转入烟草
中，得到的转基因烟草提取物可以抑制冰晶生长，而且
转基因植株的抗冻性明显高于对照系。
鉴于抗冻蛋白的 2个特性，根据 NCBI登录号
AJ131340和AF159114分别设计引物克隆到胡萝卜抗
冻蛋白基因和黄粉虫抗冻蛋白基因，通过重叠延伸
PCR，将2个基因前后串联起来构建成融合基因，并构
建了植物表达载体，通过农杆菌介导转化拟南芥进行
抗冻性研究，旨在探讨由植物抗冻蛋白基因和昆虫抗
冻蛋白基因的融合基因在植物体中的表达情况，为植
物抗寒抗冻提供新的思路和新的理论支持。
1 材料和方法
1.1 材料和试剂
1.1.1 材料 胡萝卜种子购于河南南阳种子公司；黄粉
虫幼虫购于北京海淀花鸟鱼虫宠物市场。
1.1.2 试剂 总RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；限
制性内切酶及DNA连接酶购自NEB公司；DNA凝胶
回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自 AxyGen公司；
pMD18-T Simple载体、Taq DNA聚合酶购自 TaKaRa
公司；其他试剂购自国内有关公司或厂家；PCR引物
由北京奥科生物公司合成。
1.2 方法
1.2.1 胡萝卜总RNA的提取 胡萝卜种子发芽培养 12
天后，放入 4℃低温诱导 72 h，液氮速冻保存。采用
QIAGEN公司Rneasy Plant Mini kit提取总RNA，具体
步骤参见说明书。
1.2.2 黄粉虫总RNA的提取 黄粉虫抗冻蛋白表达受
时序和环境双重调控。取 4℃低温诱导 1周的黄粉虫
幼虫液氮速冻保存。采用QIAGEN公司Rneasy Mini
kit提取总RNA，具体步骤参见说明书。
1.2.3 胡萝卜和黄粉虫抗冻蛋白基因的cDNA克隆 胡
萝卜和黄粉虫抗冻蛋白基因的cDNA的第一链合成采
用 invitrogen 公 司 的 SuperScript Ⅱ Reverse
Transcriptase试剂盒，具体步骤参见说明书。根据
NCBI登录号为AJ131340和AF159114，分别设计胡萝
卜抗和黄粉虫抗冻蛋白基因的引物，并在5’端和3’端
treated. The frost-resistance of the transgenic plants was studied and analyzed. The results from statistical
analysis of mortality and blade etiolation rate indicated that the AFPs had different functions which improved
the cold resistance in many different ways. Hyperactive thermal hysteresis protein (THP) like TmAFP was a
great help to depress the freezing point. However, when plant suffered from freeze injury a little longer,
hyperactive ice re-crystallization inhibition protein (IRIP) like DcAFP kept stabilization of the fluid in the
apoplast.
Key words: antifreeze protein; thermal hysteresis; cold resistance
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加入EcoRⅠ和SacⅠ酶切位点，见表1（下划线表示酶
切位点）。
以胡萝卜和黄粉虫cDNA第一链为模板按下列体
系分别进行PCR反应：取1.0 μL模板，加入2.5 μL 10×
Buffer (15 mmol/L Mg2+)，1.0 μL 10 mmol/L dNTP，Taq
DNA 聚合酶 1.0 U，特异引物 DcafpF/DcafpR 和
TmafpF/TmafpR各 1.0 μL，引物浓度为 10 mmol/L，加
适量水至 25 μL，先于 94℃预变性 5 min，后以 94℃
45 s、58℃ 45 s、72℃（60 s和30 s）进行33个循环，最后
72℃总延伸10 min。PCR反应完成后，在1%琼脂糖凝
胶上电泳检查扩增片段的特异性和大小。按照
AxyGen凝胶纯化试剂盒操作指南纯化目的片段，将
此片段按照操作说明与pMD18-T simple载体连接，连
接产物转化 E. coli DH5α感受态细胞。最后在含有
Amp抗生素的LB平板上筛选出阳性菌株，提取质粒
分别命名为pMD-Dcafp和pMD-Tmafp，并测序。
1.2.4 融合基因Dc-TmAFP和Tm-DcAFP的克隆 依据
重叠延伸PCR原理，设计中间引物见表2。
表1 引物信息
引物名
DcafpF
DcafpR
TmafpF
TmafpR
引物序列
5-GAATTCATGAATATTGAATCATCTTTCTGCCCT-3
5-GAGCTCCTAGCATTCTGGCAATGGAGC-3
5-GAATTCATGGCATTCAAAACGTGTGGTTTTTCA-3
5-GAGCTCTTAATGTCCGGGACATCCTGTTGAATG-3
酶切位点
EcoRⅠ
SacⅠ
EcoRⅠ
SacⅠ
表2 引物信息
引物名
MidPriA
MidPriB
MidPriC
MidPriD
引物序列
5’-AAAACCACACGTTTTGAATGCCATGCATTCTGGCAATGGAGCACCACAC-3’
5’-TGTGGTGCTCCATTGCCAGAATGCATGGCATTCAAAACGTGTGGTTTTTC-3’
5’-GCAGAAAGATGATTCAATATTCATATGTCCGGGACATCCTGTTGAATG-3’
5’-CATTCAACAGGATGTCCCGGACATATGAATATTGAATCATCTTTCTGCCC-3’
1 2 3
1：融合基因Dc-TmAFP基因PCR扩增条带；2：融合基因Tm-DcAFP基
因PCR扩增条带；M：D2000 DNA Marker
图1 Dc-TmAFP和Tm-DcAFP融合基因PCR电泳图
以 pMD-Dcafp为模板，引物对分别为 DcafpF/
MidPriA和MidPriD/DcafpR，延伸时间为 80 s，其他条
件同上进行PCR反应，后凝胶回收得到融合基因的前
提模板，命名为MidDcafp1和MidDcafp2。
以 pMD-Tmafp为模板，引物对分别为MidPriB/
TmafpR和TmafpF/MidPriC，延伸时间为 40 s，其他条
件同上进行PCR反应，后凝胶回收得到融合基因的前
提模板，命名为MidTmafp1和MidTmafp2。
以MidDcafp1和MidTmafp1为模板，加入 2.5 μL
10×Buffer (15 mmol/L Mg2+)，1.0 μL 10 mmol/L dNTP，
Taq DNA聚合酶1.0 U，加适量水至24 μL，先于94℃预
变性 8 min，延伸 20 min 后加入引物对 DcafpF/
TmafpR，再进行预变性 5 min，后以 94℃ 45 s、58℃
45 s、72℃ 2 min进行 33个循环，最后 72℃总延伸
10 min。PCR反应后凝胶纯化回收目的片段，连接
pMD18-T simple载体，并于Amp平板上筛选阳性菌
株，提取质粒，命名为pMD-Dc-Tmafp，测序。
以 MidTmafp2 和 MidDcafp2 为模板，引物对
TmafpF/DcafpR，反应步骤同上，提取质粒命名为
pMD-Tm-Dcafp，测序。
1.2.5 表达载体的构建及转化拟南芥 用XmaⅠ和Sac
Ⅰ 分 别 双 酶 切 质 粒 pMD-Dcafp、pMD-Tmafp、
pMD-Dc-Tmafp、pMD-Tm-Dcafp和表达载体 pBI121，
然后将前4者双酶切后的小片段和pBI121双酶切之后
的大片段连接获得如图1所示的4个植物表达载体，分
别命名为 pBI-Dcafp、pBI-Tmafp、pBI-Dc-Tmafp、和
pBI-Tm-Dcafp。并将此4个质粒和pBI121质粒通过电
击法导入农杆菌 GV3101菌株的感受态细胞，并经
PCR鉴定，筛选出转化子。通过花絮侵染法转化拟南
芥，利用卡那霉素筛选获得阳性植株。
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张振华等：胡萝卜与黄粉虫抗冻融合基因在拟南芥中的表达与抗冻性分析
1.2.6 Realtime PCR检测转基因植株 提取阳性植株
RNA，并定量为80 ng/μL，将同一基因型的不同株系等
体积混合，作为群体模板。用引物设计软件ABI Primer
express 3.0设计定量PCR引物，引物序列见表3。
DcAFP和Dc-TmAFP基因使用DcRTF/DcRTR引
物对，TmAFP和Tm-DcAFP基因使用TmRTF/TmRTR
引物对，使用微管蛋白Tublin作为内参，引物用TUBF/
TUBR引物对。
1.2.7 转基因植株萌芽期-10℃低温试验分析 选取T2
代种子经75%酒精和0.1%升汞灭菌后，均匀平铺在含
有卡那霉素抗生素的MS培养基上，在4℃处理3天后，
转移至 23℃、16 h光照和 21℃、8 h黑暗条件下培养。
大约 10天后，待抗性植株长至 5~7片叶子时，进
行-10℃的 7 h低温处理。处理结束后，转移至 23℃、
16 h光照和21℃、8 h黑暗条件下恢复培养。5天后，调
查植株受冻害情况。对比观察转基因与野生型植株，
统计转基因植株的存活数，以及转基因植株受冻害后
黄化叶片数。统计分析采用 spss 10.0软件，进行方差
分析和LSD法多重比较。
2 结果与分析
2.1 PCR扩增胡萝卜和黄粉虫抗冻蛋白融合基因
cDNA片段
将胡萝卜和黄粉虫抗冻基因作为模板，通过重叠
延伸 PCR，扩增出融合基因Dc-TmAFP和Tm-DcAFP
的cDNA片段，大小为1335 bp（图1）。
2.2 植物表达载体的构建
经 XmaⅠ和 SacⅠ双酶切 pBI121、pBI-Dcafp、
pBI-Tmafp、pBI-Dc-Tmafp和 pBI-Tm-Dcafp酶切鉴定
结果正确（图2）。
2.3 阳性植株Real-time PCR定量分析
随机挑取长有5~7片叶子的各个基因型的不同株
系抗性植株各3株提取RNA，反转录成 cDNA，并将同
一基因型的 cDNA样品等量混合起来作为模板进行
Real-time PCR。经Real-time PCR结果分析，同野生型
植株相比，4个基因型都得到相对较高的表达（图3）。
2.4 转基因植株萌芽期-10℃低温试验
2.4.1 低温冻害后转基因植株存活率统计分析 将长有
5~7片叶子的转基因植株，进行-10℃低温处理试验。
经-10℃的低温处理7 h，转移至23℃、16 h光照和21℃、
8 h黑暗条件下恢复培养 5天后，调查植株受冻害情
况，以整株植株叶片是否萎焉死亡为标准判定植株的
存活与否（图4）。
经5天恢复后，根据评判标准统计植株的存活数，
并计算平均存活率。野生型(WT)植株平均存活率为
0，转 DcAFP基因的植株平均存活率为 86.387%，转
TmAFP 基因的植株平均存活率为 86.079%，转
Dc-TmAFP 基因的植株平均存活率为 85.923%，转
Tm-DcAFP基因的植株平均存活率为 78.993%，由此
得出基因型耐冻性由大到小排列为：DcAFP>TmAFP>
1 2 3 4 5 6
1：重组质粒pBI121-Dc-TmAFP由Xma I/Sac I双酶切；
2：重组质粒pBI121-Tm-DcAFP由Xma I/Sac I双酶切；
3：重组质粒pBI121-TmAFP由Xma I/Sac I双酶切；
4：重组质粒pBI121-DcAFP由Xma I/Sac I双酶；
5：质粒pBI121由Xma I/Sac I双酶切；
6：D2000 DNA Marker
图2 植物表达载体酶切电泳图
4805.093
1
3960.884
1225.2171454.21810
1000
2000
3000
4000
5000
6000
DcAFP WTDc-TmAFP WTTm-DcAFP WTTmAFP WT
样本
相
对
表
达
量
图3 转基因植株相对表达量
引物名
DcRTF
DcRTR
TmRTF
TmRTR
TUBF
TUBR
引物序列
5 CTCAGGGAACAGACTAGAAGGTG3
5 TTAGCCAACTCACTCGACAGAC3
5 ATGCACTGGGGGTTCTGATT 3
5 TGTTGCGGCTTCAAAACAGT3
5 GATTTGTCCCTCGCGCTGT3
5 TCGGTATAATGACCCTTGGCC3
表3 引物信息
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(I)无性系
Dc
Tm
DT
TD
WT
(J)无性系
Tm
DT
TD
WT
Dc
DT
TD
WT
Dc
Tm
TD
WT
Dc
Tm
DT
WT
Dc
Tm
DT
TD
均数之差(I-J)
0.3080
0.4648
7.3943*
86.3873*
-0.3080
0.1567
7.0863*
86.0793*
-0.4648
-0.1567
6.9295*
85.9226*
-7.3943*
-7.0863*
-6.9295*
78.9930*
-86.3873*
-86.0793*
-85.9226*
-78.9930*
标准误
2.26640
2.26640
2.26640
2.26640
2.26640
2.26640
2.26640
2.26640
2.26640
2.26640
2.26640
2.26640
2.26640
2.26640
2.26640
2.26640
2.26640
2.26640
2.26640
2.26640
方差相等概率
0.895
0.842
0.009
0.000
0.895
0.946
0.011
0.000
0.842
0.946
0.012
0.000
0.009
0.011
0.012
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
均值95%可信区间
下限
-4.7419
-4.5851
2.3444
81.3375
-5.3579
-4.8931
2.0364
81.0295
-5.5146
-5.2066
1.8797
80.8727
-12.4442
-12.1361
-11.9794
73.9432
-91.4372
-91.1292
-90.9724
-84.0429
上限
5.3579
5.5146
12.4442
91.4372
4.7419
5.2066
12.1361
91.1292
4.5851
4.8931
11.9794
90.9724
-2.3444
-2.0364
-1.8797
84.0429
-81.3375
-81.0295
-80.8727
-73.9432
表4 转基因植株和野生型冷冻存活率多重比较结果
注：*代表0.05水平上的显著性差异。
A：萎焉死亡评判标准；B：野生型植株；C：转Dc-TmAFP基因植株；D：转Tm-DcAFP基因植株；E：转TmAFP基因植株；F：转DcAFP基因植株
图4 拟南芥-10℃的低温处理后5天恢复图
Dc-TmAFP>Tm-DCAFP>WT。
表4为不同转基因型株系和野生型植株冷冻存活
率LSD法多重比较的结果。考察所得结果可以看出
转基因型DcAFP、TmAFP、Dc-TmAFP、Tm-DcAFP的
株系的存活率显著高于 WT；DcAFP 基因型同
Tm-DcAFP基因型及WT差异显著，同TmAFP基因型
和 Dc-TmAFP 基因型无差异；TmAFP 基因型同
Tm-DcAFP基因型及WT差异显著，同Dc-TmAFP基
因型无差异；Dc-TmAFP基因型同Tm-DcAFP基因型
及WT差异显著；Tm-DcAFP基因型同WT差异显著。
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张振华等：胡萝卜与黄粉虫抗冻融合基因在拟南芥中的表达与抗冻性分析
通过存活率统计基因型耐冻性从高到低顺序为：
DcAFP & TmAFP & Dc-TmAFP>Tm-DCAFP>WT。
2.4.2 低温冻害后有叶片黄化的转基因植株黄化率统
计分析 经-10℃的低温处理7 h，转移至23℃、16 h光照
和 21℃、8 h黑暗条件下恢复培养 5天后，调查存活植
株受冻害程度，以植株是否有叶片黄化为标准计数
（图5）。
统计结果并计算黄化率。转DcAFP基因叶片黄
化的黄化率为 57.97%，转TmAFP基因叶片黄化的黄
化率为 41.966%，转Dc-TmAFP基因叶片黄化的黄化
率为 86.369%，转Tm-DcAFP基因叶片黄化的黄化率
为54.622%，由此得出各基因型抗冻性由大到小排列：
TmAFP>Tm-DCAFP>DcAFP>Dc-TmAFP。
表5为不同转基因型株系叶片黄化率LSD法多重
比较的结果。考察所得结果可以看出DcAFP基因型
同 TmAFP基因型及Dc-TmAFP基因型差异显著，同
Tm-DcAFP基因型无差异；TmAFP基因型同DcAFP基
箭头所示为判定黄化的叶片
图5 叶片是否黄化评判标准图
表5 叶片黄化的转基因植株黄化率多重比较结果
(I)无性系
Dc
Tm
DT
TD
(J)无性系
Tm
DT
TD
Dc
DT
TD
Dc
Tm
TD
Dc
Tm
DT
均数之差(I-J)
0.16004*
-0.28399*
0.03348
-0.16004*
-0.44403*
-0.12656*
0.28399*
0.44403*
0.31747*
-0.03348
0.12656*
-0.31747*
标准误
0.02698
0.02698
0.02698
0.02698
0.02698
0.02698
0.02698
0.02698
0.02698
0.02698
0.02698
0.02698
方差相等概率
0.000
0.000
0.250
0.000
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
0.250
0.002
0.000
均值95%可信区间
下限
0.0978
-0.3462
-0.0287
-0.2223
-0.5062
-0.1888
0.2218
0.3818
0.2553
-0.0957
0.0643
-0.3797
上限
0.2223
-0.2218
0.0957
-0.0978
-0.3818
-0.0643
0.3462
0.5062
0.3797
0.0287
0.1888
-0.2553
因型、Dc-TmAFP基因型、Tm-DcAFP基因型差异显
著；Dc-TmAFP基因型同DcAFP基因型、TmAFP基因
型、Tm-DcAFP基因型差异显著；Tm-DcAFP基因型同
TmAFP 基因型、Dc-TmAFP 基因型差异显著，同
DcAFP基因型无差异。通过黄化率统计排列各基因
型抗冻性从高到低顺序为：TmAFP>Tm-DCAFP&
DcAFP>Dc-TmAFP。
3 结论与讨论
抗冻蛋白的2个特性——热滞效应和抑制冰晶重
结晶效应，均能提高植物抗冻性。然而，哪个特性在提
高植物抗冻性方面起主要作用，或者 2个效应协同起
来是否能更好的提高植物的抗寒性等，均没有被探讨
过。本试验从胡萝卜和黄粉虫幼虫中克隆得到
DcAFP基因和TmAFP基因，并通过重叠延伸 PCR将
DcAFP基因与TmAFP基因融合，根据串联的先后顺
序分别构建了DcAFP-TmAFP和 TmAFP-DcAFP 2个
融合基因。利用基因工程技术将4个基因转入拟南芥
并进行抗冻性分析，探讨抗冻蛋白的 2个特性在提高
植物抗冻性方面的作用。
同野生型相比较，转融合基因 Dc-TmAFP 和
Tm-DcAFP的植株其耐冻性显著优于野生型对照，表
明依然存在抗冻活性。而存活率统计分析表明2个融
合基因耐冻性均未优于DcAFP和TmAFP 2个单基因，
可能是由于 2个单基因融合后，在蛋白翻译折叠过程
中其自然构象发生变化，影响冰晶结合位点而导致
的。叶片黄化率统计分析表明融合基因Tm-DcAFP黄
化率低于 DcAFP基因却无差异，且高于 TmAFP基
因。Huang等[13]认为赤翅甲抗冻蛋白基因在转基因拟
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南芥中表达对冷冻存活率无影响，但其分泌在非原生
质的流体中相比较于野生型对照能够明显降低冰点，
对植物在遭遇短暂冻害时起保护作用。本试验中存活
率的统计排列顺序同叶片黄化率统计排列顺序不一
致，亦可能是植物在遭遇冻害时，抗冻蛋白降低叶片的
流体冰点能力不同，致使结冰时间长短不一致，从而对
植物叶片的冻害造成差异。基于Hansen的研究结果
黄粉虫抗冻蛋白热滞效应的高效性，从而可以解释转
TmAFP基因的转基因植株叶片黄化率为最低。抗冻
蛋白抑制冰晶重结晶效应可能在植物遭受较长时间冻
害时，对植物非原生质中流体保持稳定性作用较大，从
而提高植物的耐冻能力。Sandve等[15]认为植物抗冻蛋
白抑制冰晶重结晶效应比昆虫和鱼类高 10~100倍，
Zhang等[16]对胡萝卜抗冻蛋白空间位点进行突变，研
究其空间结构变化对抗冻蛋白活性的影响发现其抗冻
活性同天冬酰胺富集的冰晶绑定位点有相关性。因而
胡萝卜抗冻蛋白具有较强的抑制冰晶重结晶的特性，
在遭受较长时间冻害时，转DcAFP基因的转基因植株
存活率为最高。
不同的抗冻蛋白热滞效应和抑制冰晶重结晶的作
用功能虽然有较大差别，却都可以提高植物的抗寒性，
但都还没有达到人们的预期目标，同时也存在一些问
题，比如目前在植物中导入抗冻蛋白基因，大多是在基
因前面加入强启动子使其组成型表达，这样可能引起
植物的代谢紊乱等负面效应，若通过冷诱导启动子启
动其表达则可以解决这个问题，能够使植物保持对环
境的低温敏感性，适应正常季节交替。然而，植物的抗
寒应答反应是一种复杂的自卫本能，往往需要一系列
相关基因的调控表达，仅靠转移单个基因而获得抗逆
性强的植物是有一定难度的，因此转入一系列基因是
必须的。
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