全 文 ：＊通讯作者 , zhaog07@yah oo.com
收稿日期:2009-02-12;修回日期:2009-04-10
基金项目:甘肃省自然基金;农业行业专项(nyhyzx07-022);科
技支撑项目(2008BADB3B07)资助
作者简介:刘美(1981-),女 , 山东菏泽人 ,在读硕士研究生 , 研
究方向为牧草分子遗传育种 , E-mail:smg 0903@hotmai l.com.
文章编号:1673-5021(2009)05-0107-05
早熟禾 ISSR反应体系的优化
刘　美 ,赵桂琴＊ ,刘　欢 ,张婷婷 ,尹国丽
(甘肃农业大学草业学院 , 甘肃　兰州　730070)
　　摘要:以早熟禾基因组 DNA 为模板 , 利用正交设计 , 对影响 ISS R反应体系的主要因素(Mg2 +、dNTP、Taq 酶)
从 4 个水平上进行筛选和优化 , 建立了适合早熟禾的最佳 ISSR 反应体系:25μl 反应体系中 1.25U Taq 酶 、1.5
mmo l/ L Mg 2+ , 10×PCR Buffe r 2.5μl、0.4 mmo l/ L dNTP、1μl引物 、1μl DNA 模板。扩增程序为:94℃预变性 3min;
94℃变性 30s , 56.4℃退火 30s , 72℃延伸 1min , 循环 35 次;72℃延伸 7min , 4℃保存。在此反应体系下 , 可以得到重
复性好 、稳定且多态性高的条带。
关键词:早熟禾;ISSR;正交优化
中图分类号:Q943.2　　　文献标识码:A
　　早熟禾(Poa L.)广泛分布于我国温带和寒冷
地区 ,它具有较强的耐寒性 、抗旱性 ,而且营养丰
富 、绿期长 ,受到广泛关注 ,成为北方天然草地的
优良牧草和建植草坪的主要草种之一 。其中早熟
禾的野生种 ,经过自然的长期选择 ,具有抗旱 、耐
热等有利基因 ,是重要的遗传资源 。因此 ,分析早
熟禾的野生种和栽培种的遗传多样性及亲缘关
系 ,对于有利基因的开发和拓展我国早熟禾种质
资源具有重要意义 。目前 ,早熟禾的研究主要集
中在引种适应性 、生理特性 、转基因技术等方
面[ 1 ～ 2] ,也有用 RAPD 标记对早熟禾的研究[ 3] 。
ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)是一种基于聚
合酶链式反应的高容量遗传标记技术 ,它是利用包
含重复序列并在 3 或 5 端锚定单寡聚核苷酸的引
物对基因组 DNA 进行 PCR扩增 ,它能够检测到基
因组中多个位点的差异 ,并得到大量的可揭示 DNA
片段多态性的信息。随着分子生物学的发展 ,分子
标记技术已被广泛应用到牧草中 ,而且 Jonsson 等
的研究认为 , 在进行植物遗传多样性和系统发育的
研究时 , 可优先考虑使用 ISS R[ 4] 。但目前尚未见
早熟禾 ISSR反应体系构建及相关研究报道 。本试
验利用正交设计的方法 ,以 16 份早熟禾为供试材
料 ,建立适合早熟禾的 ISS R反应体系 ,并探索优化
条件 ,为进一步研究早熟禾的遗传多样性研究奠定
基础。
1　材料与方法
1.1　试验材料
来自国内外的早熟禾供试材料共 16 份
(表 1),均采用穴盘育苗的方法培育幼苗 , 苗期
剪取叶片 ,提取 DNA ,作为优化 ISSR反应体系
的模板 。
1 .2　主要实验仪器与试剂
主要仪器有 PCR扩增仪 、恒压恒流电泳仪 、水平
电泳槽 、垂直电泳槽(北京六一仪器)、各型号微量移
液器(Eppendorf公司)及各种吸头 、高压灭菌锅。主
要试剂有 Mg2+(25mmol/ L)、dNTP(10mmol/ L)、Taq
DNA聚合酶以及 10×PCR Buf fer ,均购自 Takara 公
司 ,标准分子量(MarkerⅤ)由天根公司提供。
参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)提供的 ISSR引
物序列设计 ,初步筛选 UBC856(ACACACACACA-
CACACYA)为此次试验的引物 ,并由上海生工合成。
1.3　植物基因组 DNA提取与检测
取新鲜叶片 0.5g , 采用改进的 CTA B法提取
基因组 DNA[ 5] ,用 0.8%琼脂糖凝胶对 DNA 质量
进行电泳检测 ,紫外分析装置拍照。 TE 稀释后用
紫外分光光度计测定 ,得到 OD值 ,计算浓度。最后
将样品稀释为 10ng/μL ,放在-20 ℃下备用 。
1.4　ISSR反应体系的优化
针对 Mg2+ 、dN TP 、Taq酶浓度 3种因素 ,选用
L16(43)正交表[ 6] ,设计的 PCR各反应成分的因素
水平及正交试验表见表 2和表 3 。
—107—
第 31 卷　第 5 期　　　　　　　　　　中　国　草　地　学　报　　　　　　　　　　2009 年 9 月
　　Vo l.31　No.5　　　　　　　　　　Chinese Journal o f Grassland 　　　　　　　　　 Sept.2009　　
表 1　供试材料
Table 1　Experimental materials
序号
No.
品种名
Specifi c name
拉丁名
Lat in name
来源
Source
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Tianzhu冷地早熟禾
Barzan草地早熟禾
Mammoth草地早熟禾
Sida 草地早熟禾
扁秆早熟禾
Ikone 草地早熟禾
Sh andan草地早熟禾
Storpy 草地早熟禾
Park草地早熟禾
Sunan草地早熟禾
Merit 草地早熟禾
Prize 草地早熟禾
Blue chip草地早熟禾
Midnigh t草地早熟禾
Tianzhu草地早熟禾
Baron草地早熟禾
Poa crymop i la Keng.
Poa pratensi s L.
Poa pratensi s L.
Poa pratensi s L.
Poa pratensi s L.var.anceps Gaud.cx Griseb.
Poa pratensi s L.
Poa pratensi s L.
Poa pratensi s L.
Poa pratensi s L.
Poa pratensi s L.
Poa pratensi s L.
Poa pratensi s L.
Poa pratensi s L.
Poa pratensi s L.
Poa pratensi s L.
Poa pratensi s L.
甘肃天祝
美国
美国
美国
甘肃天祝
美国
甘肃山丹
美国
美国
甘肃肃南
美国
美国
美国
美国
甘肃天祝
美国
表 2　ISSR体系的因素水平
Table 2　Factors and levels of ISSR system
水平
Level
因素
Factor
Mg2+
(mmol/ L)
dN TP
(mmol/ L)
T aqDNA polymerase
(U/ 25μL)
1 1.00 0.2 0.50
2
3
4
1.25
1.50
1.75
0.4
0.6
0.8
0.75
1.00
1.25
表 3　ISSR各因子正交试验设计
Table 3　Orthogonal design[ L16(43)] for ISSR system
编号
No.
dNTP
(mmol/ L)
TaqDNA polymerase
(U/ 25μL)
Mg2 +
(mm ol/ L)
1 0.2 0.50 1.00
2 0.2 0.75 1.25
3 0.2 0.20 1.50
4 0.2 1.25 1.75
5 0.4 0.50 1.25
6 0.4 0.75 1.00
7 0.4 0.20 1.75
8 0.4 1.25 1.50
9 0.6 0.50 1.50
10 0.6 0.75 1.75
11 0.6 0.20 1.00
12 0.6 1.25 1.25
13 0.8 0.50 1.75
14 0.8 0.75 1.50
15 0.8 0.20 1.25
16 0.8 1.25 1.00
　　按表3设计的 16个处理组合 ,每个处理重复 2次
进行加样。反应体系总体积为 25μl ,引物为 UBC856 ,
除上述四个变化因素外 ,每管中包括 10×PCR Buff-
er 2.5μl ,模板 DNA 1μl。PCR扩增在 Biometra Ther-
mocycler扩增仪上进行 , 反应程序为:94℃预变性
3min ;94℃变性 30s , 引物退火 30s ,72℃延伸 1min ,
循环 35 次;72℃延伸 7min , 4℃保存 。将扩增产物
进行 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(电压为
140V),电泳 1.5h ,银染检测后置于自动凝胶成像系
统上观察并拍照记录。
1.5 　退火温度的确定
在正交试验的最佳反应体系的基础上 ,对退火
温度进行梯度试验 ,设定退火温度 50 ～ 60℃,由扩增
仪自动生成 8 个温度梯度:即 51.0℃、51.7℃、
52.6℃、54.5℃、55.5℃、56.4℃、57.4℃、59.0℃。
反应程序同 PCR正交实验设计 ,筛选引物的最佳退
火温度。
2　结果分析
2.1 　基因组 DNA提取
提取高质量的早熟禾基因组 DNA 是 ISSR扩
增成功与否的关键 , 本试验采用了改进的 CTAB法
提取 DNA 。如图 1所示 ,在点样孔附近都呈现一条
亮带 ,且条带整齐明亮 ,说明 DNA 提取成功 。本实
验在提取过程中 ,尽量采用幼苗期嫩叶 ,以减少酚类
物质和其他杂质的含量 ,降低对 Taq酶活性的影响 。
—108—
中国草地学报　2009 年　第 31卷　第 5期
DNA 对剪切力极为敏感 ,在样品研磨的全过程均保
持冷冻状态 ,以防融化 ,造成内源 DNase 引起 DNA
降解 ,影响提取效果 。提取时各种操作均温和的进
行 ,避免剧烈振荡 。
1.Poa crymop i la , 2.Barz an , 3.Mammoth , 4.Sida , 5.Poa p ratensis L.var. ancep s , 6. Ikone , 7.Sh andan ,
8.S torpy , 9.Park , 10.Sunan , 11.Meri t , 12.Priz e , 13.Blu e chip , 14.Midnight , 15.Tianzhu , 16.Baron.
图 1　16 个早熟禾基因组 DNA 电泳图
F ig.1　Electropho resis of g enomic DNA f rom 16 accessions o f Poa
2.2　ISSR反应体系的优化
2.2.1　Mg 2+ 、dNTP 、Taq 酶浓度的筛选
按表 3设计的 16 个处理进行 PCR反应后 ,将
扩增产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,结果如
图 2。在 16个处理组合中 ,由于 dN TP 、Mg2+ 、Taq
酶三因素浓度组合的不同 ,扩增结果存在着明显的
差异。第 7 、8组合扩增出的谱带不仅清晰 ,且多态
性好 ,主带较明显 。第 1 、3 、5 、10 、12 组合扩增的谱
带较强 ,但背景弥散 ,尤其是组合 3 、5 ,由于背景弥
散 ,造成条带无法区分 ,这可能是 Taq 酶偏高所致;
第 4组合扩增出的谱带比较清晰 ,但多态性不高;其
他组合只能扩增出较弱的谱带或几乎扩增不出条
带 。最佳组合应选择特异性谱带多态性高 、谱带清
晰 、且谱带较稳定的组合 ,故选择组合 8为最佳处理
条件 , 即 25μl 反应体系中含 dNTP 0.4mmo l/L 、
Mg2+ 1.5 mmo l/L 、引物 1μl 、模板 DNA 1μl和 Taq
酶 1.25U 。
1～ 16为表 3的处理组合编号 , M 为 MarkerⅤ
1～ 16 are the codes of orthoronical design in table 3 , M is MarkerⅤ
图 2　正交设计 ISS R反应体系的扩增
Fig.2　The result of ISSR-PCR by or thoronical de sign
2.3　引物退火温度的筛选
根据正交试验设计结果 ,选择 8号处理组合 ,对
引物进行退火温度梯度筛选 。由图 3可见 ,退火温
度影响 PCR特异性及产量。温度高 ,特异性强 ,温
度低 ,产量高 ,但过高或过低都可能造成引物不能与
模板牢固结合 ,而且非特异性也会增加。在 51.0℃
～ 59.0℃都能扩增出条带 , 但温度为 51.0℃～
55.5℃时 ,由于温度低 ,有些主带不明显 ,背景较模糊;
—109—
刘　美　赵桂琴　刘　欢　张婷婷　尹国丽　　早熟禾 ISSR反应体系的优化
1～ 8 对应温度分别为 51.0℃, 51.7℃, 52.6℃, 54.5℃,
55.5℃, 56.4℃, 57.4℃, 59.0℃,引物为 UBC856;M 为 M arkerⅤ
Lane 1～ 8:51.0℃, 51.7℃, 52.6℃, 54.5℃,
55.5℃, 56.4℃, 57.4℃, 59.0℃;Primer:UBC856;M :M ark erⅤ
图 3　不同退火温度对扩增结果的影响
Fig.3　The effect of different annealing temperatures on ISSRamplification
当温度在 56.4℃时 ,引物与模板的特异性增强 ,谱带
清晰亮度高且多态性较高;当退火温度为 57.4℃和
59.0℃时 ,扩增条带减少 ,背景逐渐模糊。因此最佳
的退火温度为 56.4℃。由于 ISSR引物较长 ,可适当
提高退火温度 ,以提高反应的稳定性和重复性。
2.4　优化反应体系的验证
经过对试验条件和程序的优化 ,建立了适合
早熟禾的重复性好 、反应稳定的 ISSR反应体系。
即在 25μl反应体系中含 dN TP 0.4mmol/ L 、Mg2 +
1.5mmol/L 、引物 1μl、模板 DNA 1μl 和 Taq 酶
1.25U 。PCR扩增程序:94℃预变性 3min;94℃变
性 30s , 56.4℃退火 30s , 72 ℃延伸 1min ,循环 35
次;72 ℃延伸 7min , 4 ℃保存 。用引物 UBC856 对
16份早熟禾材料进行扩增 ,结果见图 4。从图中
可以看出 ,在此优化体系下 , ISSR标记位点清晰 ,
多态性高 。
1～ 16同表 1的材料编号 , M 为 MarkerⅤ
1～ 16 same as in tab le 1 , M is MarkerⅤ
图 4　16 份早熟禾材料 DNA 进行 ISS R扩增结果
Fig.4　ISSR amplification results of 16 Poa accessions
3　讨论
ISSR步骤多 、流程长 , 从引物的筛选到 PCR
反应条件的优化 , 每一步骤及条件都至关重要 , 是
一个多因素影响的综合体系 , DNA 不纯 、酶切不彻
底 、PCR扩增不稳定等都可能导致带型不稳定 、条
带不清晰 、多态性不高等结果 。因此 , 对 Mg2+ 、
dNTP 、Taq 酶影响因子进行优化和筛选是非常必要
的[ 7] 。
　　确定最佳 ISSR反应体系的条件有:(1)Mg2+ 、
dNTP 、TaqDNA 聚合酶之间的交互作用对扩增结
果能够产生显著影响 ,尤其以 Mg 2+的影响较为显
著[ 8] 。dNTP 会对 Mg 2+产生拮抗作用 , Mg2+浓度
影响 TaqDNA 聚合酶的活性 。一般最适dNTP 浓度
0.05 ～ 2.0mmol/L 、Mg2+浓度 0.2 ～ 2.5mmol/L[ 9] 。
本文经综合比较后 ,确定 dN TP 浓度为 0.4mmol/L ,
Mg2+浓度为 1.5mmol/L。(2)Taq 酶量过低 , PCR
反应的敏感性差 ,扩增的条带少 ,所能提供的信息也
少;酶量过高 ,则扩增反应的特异性降低 ,产生大量
的弥散片段 ,形成很亮的背景不利于条带的观察分
析[ 10] 。试验中设置 0.5U 、0.75U 、1.0U 、1.25U共 4
个 Taq酶梯度 ,结果表明在 25μl的反应体系中使用
—110—
中国草地学报　2009 年　第 31卷　第 5期
0.5U ～ 1.25U 均有扩增产物出现 ,但在 0.5U ～
0.75U时条带模糊 ,最终选择 1.25U为最佳 Taq酶
浓度。(3)不同的退火温度与引物产生错配的程度
不同 ,而且不同的退火温度对扩增片段大小也具有
选择性[ 11] 。因此 ,在试验中发现 , 退火温度能够明
显影响谱带样式 ,较高的退火温度会减少非特异性
条带的产生 ,首先初步选定能扩增出清晰条带的引
物 ,再逐个进行梯度退火试验 ,设置 8个温度梯度对
100个引物进行筛选 ,经过重复实验选出 9 个在 52
～ 57℃扩增条带较为稳定的引物用于下一步的研
究 ,它们分别是:818 、835 、825 、856 、857 、829 、834 、
889 、822。
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Optimization of ISSR Amplification System in Poa L.
LIU Mei ,ZHAO Gui-qin , LIU Huan , ZHANG Ting-ting , YIN G uo-li
(College of Pratacul tural Science , Gansu Agricultural Universi ty ,Lanzhou 730070 , China)
Abstract:Template DNA used for ISSR was extracted from Poa L.leaf tissue.The orthogonal design w as
applied to optimize ISSR amplification system at four levels of three factors (Taq DNA polymerase , Mg2 + ,
dNTP)respectively.An optimal reaction system w as established , 25μl reaction sy stem contained 1.25U Taq DNA
polymerase , 1.5 mmol·L-1 Mg2+ ,10×PCR Buf fer 2.5μl , 0.4mmol·L-1 dNTP , 1μl template DNA , 1μl prim-
er.Amplification program included pre-denaturation at 94℃for 7min;denaturation at 94℃ for 1min ;annealing at
56.4℃for 30s;extending at 72℃for 1min;af ter 35 cycles , the product w as extended at 72℃for 7min and kept at
4℃.Clear , steady and higher polymorphic bands w ere obtained through this optimized sy stem.
Key words:Poa L ;ISS R;Orthogonal optimization
—111—
刘　美　赵桂琴　刘　欢　张婷婷　尹国丽　　早熟禾 ISSR反应体系的优化