全 文 ：40 草 业 科 学 23卷 8期
8 /2006 PRAT ACULT URA L SCIENCE Vol. 23 , No. 8
利用微卫星分子标记研究我国 16份
披碱草遗传多样性
孙建萍1 , 2 , 袁庆华1
(1. 中国农业科学院畜牧研究所 ,北京 100094;2. 上海市农业科学院生物技术中心 ,上海 201106)
摘要:利用微卫星(Micro sa te llite)分子标记对我国 16 份披碱草 E lymus dahuricus 进行遗传多样性研究。研
究共筛选了 38 对引物 , 其中 18 对引物有扩增条带 , 占总数的 47. 4%,具有多态性并且扩增效果较好的引物
有 6对 , 占总数的 15. 8%。用筛选出的这 6 对引物对供试的 16 份材料进行微卫星分析 , 6 对引物共检测出
26 个等位基因 ,平均每对引物所产生的平均等位基因数为 4. 3个位点;利用微卫星分子标记数据 , 对其居群
遗传分化进行研究 ,结果表明:披碱草 77. 36%的遗传变异出现在居群内 ,因此 , 披碱草的遗传多样性主要存
在于居群内;对 16份披碱草进行聚类分析 ,构建了亲缘关系树状图 , 16 份供试材料大致分为 5 类。
关键词:微卫星;分子标记;披碱草
中图分类号:S543+. 903. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-0629(2006)08-0040-05
形态性状和生化标记的有限性已经远远不能
满足人们从基因水平上来分析植物遗传多样性的
需要[ 1] ,近年来 ,快速发展起来的各种分子标记技
术———限制性片段长度多态性(rest riction f rag-
ment leng th po lymo rphism , RFLP)、随机扩增多
态性 DNA ( random amplif ied po lymo rphism
DNA , RAPD)、序列标定位点(sequence-tagged
sites , S TS)、扩增片段长度多态性 (amplif ied
f ragment length polymorphic , AFLP)和微卫星
DNA(simple sequence repeat o r micro satellite ,
SSR)等已经广泛用于植物的遗传多样性的研究 ,
尤其是在小麦 、水稻等作物的研究[ 2] 。
微卫星 ,又称简单重复序列 ,是指由 1 ～ 6个
碱基组成的基序串联重复而成的短片段 。在所有
检测过的真核生物中都散布着大量的微卫星 。微
卫星是进化最快的 DNA 序列 ,微卫星中重复单
位的数目是高度变异的。微卫星标记在研究牧草
居群基因组的亲缘 、基因漂流 、遗传多样性及其种
质资源保护上具有很大的潜力[ 2 , 3] 。对已发表牧草
DNA序列进行大规模调查 ,科学家发现每 50 kb
就可以找到 1个二核甘酸和三核甘酸的微卫星。
其中 ,二核甘酸(A T)n频率最高 。动物中普遍存
在的 A T /TG 重复只找到 1个。在三核甘酸微卫
星中(TA T)n较多。对大豆的(A T)n和(TA T)n
微卫星进行了 PCR扩增 ,表明它们有很高的长度
多态性 ,并且以共显性孟德尔方式遗传[ 4] 。因而
证明在牧草中微卫星可作为基因组图谱 、连锁研
究 、群体研究及品种鉴定的优秀遗传标记[ 5] 。而
且 ,微卫星标记比同工酶标记更适合于牧草居群
遗传多样性的研究。从番茄中已经克隆并鉴定了
1个能与(GACA)n杂交的位点 ,对该位点的 PCR
扩增显示了丰富的长度多态性[ 6] 。
从分子水平对我国 16 份披碱草 E lymus
dahuricus的遗传多样性进行研究 ,以了解其遗传
多样性状况及亲缘关系 ,为育种者进行选择亲本
和披碱草种质资源的开发利用提供理论依据 。
1 材料与方法
1. 1 供试材料 16 份材料均由中国农业科学
院畜牧研究所牧草种质资源研究室提供(见表
1),在中国农业科学院畜牧研究所试验地进行
田间试验 ,随机区组试验设计 ,每份材料设 3 次
重复 ,共计 48个小区 ,小区面积 2 m ×1. 5 m 。
株距 30 cm ,行距 40 cm ,每小区 5行 ,每行 5株。
收稿日期:2005-07-07
基金项目:国家科技部基础研究专项基金(2003-2005)
作者简介:孙建萍(1979-),女,山东费县人 ,硕士。
通讯作者:袁庆华 E m ail:yu anqing hua@hotm ail. com
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TaqDNA 聚合酶为上海 Promega 产品 , dN TP 和
Microsatellite 引物分别购自北京三泰兴隆科技
有限公司和北京赛百盛基因技术有限公司 ,其余
试剂均为进口分装或国产分析纯试剂。
表 1 16 份披碱草概况
编号 采集地点 生境
1 山西五台山台怀镇清水河水边 河滩
2 北京百花山 山道路边
3 北京灵山草甸阳坡 草甸阳坡
4 北京灵山草甸阴坡 草甸阴坡
5 北京龙门涧 沟底灌丛地
6 北京雾灵山公路边 路边灌丛
7 新疆吉阜康白杨沟 草甸割草场
8 新疆伊犁昭苏管理处 灌丛草地
9 甘肃古浪县十八堡 干旱山坡
10 山西沁源
11 青海海晏县西海镇
12 新疆昌吉呼图壁红叶水库 山地草原
13 甘肃古浪县黄羊川乡大台村 山地草原
14 内蒙古锡盟
15 青海大通宝库生态保护区
16 青海湟源 海拔 2 900 m
1. 2 微卫星分析
1. 2. 1 DNA基因组的提取 每份材料随机选取
10个单株进行单株 DNA 提取 ,采用 Sun改进的
方法[ 7] 。利用紫外分光光度计测定浓度 , 0. 8%琼
脂糖检测 DNA 质量(如图 1)。
图 1 披碱草基因组 DNA
1. 2. 2 PCR反应 Microsatellite 分析采用的 PCR
反应体系为20μL ,其中含10×PCRbuffer ,1 U Taq
酶 ,1 mmol /L dNTP ,1. 2μmol/L 引物 ,0.5 mmol /L
MgCl2 ,100 ng模板 DNA 。PCR反应程序为:94 ℃
5 min;94 ℃1 min , 64 ℃→52 ℃1.5 min(每 3个
循环降低 2 ℃), 72 ℃1 min;94 ℃1 min , 52 ℃
1 min , 72 ℃ 1 min , 共 27 个循环;72 ℃延伸
10 min;最后 4 ℃保存。反应在 PTC - 100TM扩增
仪(MJ公司)上进行 ,扩增产物在 8%的聚丙烯酰
胺(PAGE)凝胶上电泳 ,恒定电压 300 V ,电泳 5 ～
6 h ,按文献[ 7]银染后观察记录并照相 ,选择扩增
效果较好的 6对微卫星引物(表 2)进行统计分析 。
表 2 6 对呈多态性披碱草微卫星引物
引物编号 引物序列(5’ →3’ ) 核心重复 理想等位基因
EAGA51
TCC AC T GTG CTA C TT CTA GCT
AAC TGA ATG AAT GTG TGC AGT
(AG)15 206
EAGA74
AGG TTG TAT CTG C TG ATA CGA TC
TGC AAG TCG AGC TGT CAC T AG
(CT)14(A TC T)5(CT)3 153
EAGA22a
GAA ATG CAA GCG TAT GGT GAA G
AGG GCC GGA AGG TCC ATA T
(AGCT)3TAG 3T 3G(AAGGG)2A3 128
EAGA101
GAT GAT GTC AAT A TG CTG CAA T
AGG CCA GAC TT A TGA ACA CTA T T
(TC)22 159
EAGA103
GAC TGC TAA ACT AAC AAC AAA ACT
ATC TCA CAC TGG CTC ATG TC
(GA)21 122
EAGA104
AGC CAG ACA CAA GTG AC T ATG
ATC TCA GGT CCA TAG ATA GTA TCT
(AG)4(GA)14 143
1. 2. 3数据统计分析 根据 Nei[ 8] 因多样度法计
算遗传分化度(GS T),其关系式为 GST =DS T /H T ,
其中 H T =H S +DST , H T 为总居群基因多样度 ,
HS 为居群内基因多样性 ,DS T为各居群间基因多
样度;遗传多样性分析采用国际上通用的多态性
信息 量 (Polymorphism Informat ion Content ,
PIC)的计算方法 ,其中每对微卫星引物检测 1个
位点 ,视每条多态性带为 1个等位基因 ,有此带时
赋值为“1” ,无此带赋值为“0” ,用 SPSS11. 5软件
进行聚类分析。
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2 结果与分析
2. 1 微卫星引物的筛选和扩增条带的特征
分析 共筛选了 38对引物 ,其中有 18对引物有
扩增条带 ,占总数的 47. 4%,具有多态性并且扩
增效果较好的引物有 6对 ,占总数的 15. 8%。用
这 6对引物对供试的 16份材料进行微卫星分析 ,
共检测出 26个等位基因 ,平均每对引物所产生的
平均等位基因数为 4. 3 个位点 ,引物 EAGA101
在 16份供试材料中的扩增检测(见图 2)。
图 2 位点 EAGA101 在供试材料中的扩增检测
2. 2 披碱草居群遗传分化 由表 3看出 ,披碱
草 77. 36%的遗传变异出现在居群内 ,即居群间
的遗传分化为 22. 64%,因此 ,披碱草的遗传多样
性主要存在于居群内 。
表 3 披碱草 16个居群在不同多态位点上遗传
多样性的构成和遗传分化
位 点 总居群基因多样度
居群内基
因多样度
基因分
化系数
EAGA51 0. 364 2 0. 282 7 0. 223 8
EAGA74 0. 343 3 0. 270 3 0. 212 6
EAGA22a 0. 284 9 0. 226 9 0. 203 6
EAGA101 0. 273 1 0. 204 3 0. 251 9
EAGA103 0. 382 5 0. 294 4 0. 230 3
EAGA104 0. 422 4 0. 322 7 0. 236 0
平均值 0. 345 1 0. 266 9 0. 226 4
2. 3 多态信息含量的分析 各位点在各供试
材料中的多态信息含量见表 4 。多态信息含量式
表示微卫星位点变异程度高低的一个指标 ,当
PIC>0. 5时该位点为高度多态性;当 0. 25
理的信息;当 PIC<0. 25时 ,为低度多态性位点 ,
标记提供信息的能力较差。由表 4可知:各材料
的平均多态信息含量分布范围除了 3 号材料的为
0. 493 8之外 ,其余材料的平均 PIC 均大于 0. 5 ,
具有高度多态性 。6个位点所有 PIC均大于 0. 5 ,
表明 6对引物可以为这 16 份材料提供理想的信
息 。6个位点中 , 0. 6
材料的平均 PIC 值为 0. 617 8 ,充分说明各材料和
各位点间均存在显著差异。
2. 4 微卫星分子标记的聚类分析 分析结果
显示:披碱草的遗传多样性水平较高;构建了 16
份披碱草属材料的亲缘关系树状图(见图 3)显
示 ,当遗传距离为 15时 ,划分为 2大类 ,其中第 2
大类主要来自北京周边 ,山西五台山的材料也和
来自北京的材料聚为一类 ,说明它们从基因水平
上具有较近的亲缘关系;当遗传距离继续缩小为
8时 ,第 1大类又化分为 3小类 ,其中第 1 类主要
来自我国的西北地区 ,第 2类主要来自新疆 ,也包
含了 2份北京和山西的材料 ,这也说明从遗传物
质本身 ,它们具有较近的亲缘关系 ,第 3类主要来
自青海 ,结合田间观察的结果 ,来自青海的材料在
内地生育期明显提前 ,植株矮小 、产量和质量都不
高 ,这与青海特有的生境是密不可分的。
图 3 微卫星聚类分析
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表 4 各位点各材料的多态信息含量
编号 位 点
EAGA51 EAGA22a EAGA103 EAGA104 EAGA101 EAGA74
平均值
1 0. 624 9 0. 562 5 0. 557 1 0. 769 2 0. 857 1 0. 789 5 0. 660 1
2 0. 571 4 0. 294 1 0. 563 6 0. 740 7 0. 803 3 0. 740 2 0. 585 6
3 0. 714 3 0. 270 3 0. 413 4 0. 606 1 0. 714 3 0. 294 1 0. 493 8
4 0. 526 3 0. 401 1 0. 484 6 0. 624 6 0. 625 0 0. 652 2 0. 535 6
5 0. 909 1 0. 714 3 0. 622 5 0. 909 1 0. 526 3 0. 832 9 0. 719 0
6 0. 786 9 0. 588 2 0. 676 2 0. 801 1 0. 952 4 0. 808 3 0. 735 5
7 0. 714 8 0. 624 7 0. 588 7 0. 769 2 0. 740 7 0. 810 8 0. 708 2
8 0. 810 8 0. 614 4 0. 481 9 0. 554 9 0. 769 2 0. 837 3 0. 678 1
9 0. 714 3 0. 526 3 0. 540 5 0. 502 1 0. 555 0 0. 714 3 0. 592 1
10 0. 654 7 0. 634 7 0. 585 7 0. 555 4 0. 588 2 0. 606 1 0. 554 1
11 0. 952 4 0. 625 6 0. 510 0 0. 437 5 0. 801 3 0. 401 0 0. 621 3
12 0. 789 5 0. 588 2 0. 554 6 0. 591 3 0. 712 4 0. 789 5 0. 670 9
13 0. 625 0 0. 666 7 0. 539 0 0. 416 7 0. 869 6 0. 740 7 0. 609 6
14 0. 869 6 0. 769 2 0. 468 8 0. 833 4 0. 654 9 0. 586 7 0. 697 1
15 0. 909 3 0. 619 5 0. 544 8 0. 476 2 0. 413 8 0. 434 8 0. 533 1
16 0. 802 1 0. 666 7 0. 534 8 0. 411 9 0. 769 2 0. 740 7 0. 637 6
总体均值 0. 748 5 0. 572 9 0. 541 6 0. 625 0 0. 709 5 0. 673 7 0. 627 0
3 讨论
微卫星标记在研究牧草居群基因组的亲缘关
系 、基因漂流 、遗传多样性及其种质资源保护上具
有很大的潜力[ 2] 。
微卫星位点两侧的序列是独特的 ,因此根据
两侧序列设计 1对引物进行 PCR扩增 ,然后通过
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物 ,可以精
确检测特定位点微卫星的长度多态性 ,微卫星分
子标记的优点:1)微卫星高度丰富且均匀分布;
2)具有丰富的多态性;3)共显性;4)不受环境 、季
节和发育期的影响;5)允许就单一位点给出相关
的解释和遗传分析;6)利用已发表文章中给出的
引物序列很容易在其他实验室开展试验 。微卫星
标记已经成功地应用于人类染色体 、老鼠以及其
他的哺乳动物和蚊连锁图谱的研究中。近几年
来 ,对已经发表的 DNA 序列进行调查并揭示了
牧草微卫星位点具有丰富多态性 ,而且 ,微卫星标
记在牧草上的应用不断增加 ,而且从中获得了丰
富的遗传信息 。虽然具有这么多优点 ,但是对所
研究物种的微卫星位点进行克隆和序列分析 ,费
时费力且代价昂贵。
赵勇等[ 9] 利用 16对水稻功能基因的 SSR标
记对来源于 5个国家的 23 份水稻种质资源的遗
传多样性进行了研究 ,共检测出 78个等位基因变
异 ,每对引物可以检测出 2 ～ 10个等位基因变异 ,
平均为 5. 2个。张志清等[ 10] 采用 SSR对四川省
近 50年以来推广面积达 6. 67万 hm2 以上的 40
个主栽小麦品种的遗传多样性进行了研究 。结果
发现 ,在小麦全基因组 42条染色体臂上的 46个
SSR位点上有 30个具有多态性 ,共检测出 110个
等位变异 ,每个 SSR位点能检测出 1 ～ 8个 ,平均
为 2. 4个。SSR标记揭示四川主栽小麦品种具有
较高的遗传多样性 ,许占友[ 11] 等将 SSR标记和农
艺性状间进行比较 ,探索利用 SSR标记鉴定大豆
种质的可行性。结果显示 ,农艺性状的聚类分析
和 SSR分子标记的聚类分析吻合率很低 , 利用
SSR对大豆种质进行鉴定是可行的。李新海
等[ 12] 利用 SSR标记对 21个玉米自交系进行杂交
优势群划分研究 ,筛选出 43对多态性引物 ,检测
到 127个等位基因变异 , SSR标记的平均多态性
信息(PIC , 0. 511)。本研究中 ,6 对引物共检测出
26个等位基因 ,平均每对引物所产生的平均等位
基因数为 4. 3个位点 ,结合前人的研究 , RFLP 在
植物上的多态性较低;RAPD 的多态性虽高于
RFLP ,但是稳定性较差;而 SSR 、AFLP 则表现出
较高的多态性和稳定性 。
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披碱草不仅是优良的牧草 ,而且还具有麦类
作物所缺乏的高产 、优质 、抗病 、抗虫和抗逆等优
良基因 ,是改良和育成新品种的巨大基因库[ 13] 。
利用分子标记开展多基因聚合育种是未来育种的
前途所在 ,借助水稻等模式牧草的分子标记研究
成果 ,有助于尽快获得禾草的大量标记和高密度
图谱 。同时 ,不能忽视形态学 、遗传学等基础性研
究工作 。而且要积极获取国外研究的最新信息 ,
及时将国外研究的先进成果与技术应用于我国披
碱草种质资源的研究中 ,逐步缩小与国际先进水
平的差距 ,在披碱草属牧草种质资源的保种及其
应用方面 ,应进一步健全中期库和长期库的管理 ,
对其进行分子标记 、分子克隆 ,创建基因平台 ,为
种质创新打下坚实的基础 ,同时为核心种质的建
立创造条件 ,加强披碱草遗传资源的利用 ,对经过
鉴定可在生产中直接利用的种质材料及时扩繁种
子 ,积极在生产中推广利用。
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Study of the genetic diversity of sixteen accessions of Elymus dahuricus with
microsatell ite molecular markers
SUN Jian-ping1 , 2 , YUAN Qing-hua1
(1. Institute of Animal Husbandry , Chinese Academy of Ag ricultural Sciences , Beijing 100094 , China;
2. The Bio-Tech Center o f Shanghai Ag ricultural Sciences Academy , Shanghai 201106 , China)
Abstract:Gene tic diversity of 16 accessions we re studied at microsatellite level. Thirty-eight primer
pairs w ere used for polymorphic selection ,w ith six (15. 8%) primer pai rs produced po lymo rphic prod-
ucts. A to tal o f tw enty-six bands amplified f rom six primer pairs w ere selected for microsatellite anal-
y sis. Primer s consistent ly indicated that 77. 36% of the variation existed w ithin the g roups o f the 16
accessions of Elymus dahuricus;By cluster analy sis w ith sum of squares for micro satel li te show ed
that 16 accessions can be divided into 5 g roups w ith different characteristics ,which could af fo rd refer-
ence in deeper research o f E. dahuricus.
Key words:microsatellite;mo lecular markers;E lymus dahuricus