全 文 ：华北农学报 · 2010, 25(2):106-111
收稿日期:2009-11-10
基金项目:“十一五 ”科技支撑计划项目(2008BADB3B02);内蒙古自治区重大科技项目(20071923)
作者简介:李景环(1972-),女 ,内蒙古赤峰人 ,讲师 ,博士 ,主要从事植物分子生物学的教学与科研工作和牧草育种的科研工作。
通讯作者:云锦凤(1941-),女 ,内蒙古呼和浩特人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事牧草遗传育种的教学与科研工作。
加拿大披碱草 ×老芒麦杂种加倍一代群体的聚类分析
李景环 1, 2 ,云锦凤 1 ,王慈航2 ,杨　敏2 ,张　丽 2
(1.内蒙古农业大学 生态环境学院 ,内蒙古呼和浩特　010019;2.内蒙古师范大学生命科学与技术学院 ,内蒙古 呼和浩特　 010022)
　　摘要:通过 EST同工酶和 RAPD标记 , 对加拿大披碱草与老芒麦加倍一代的 70个单株进行了聚类分析.结果表
明 , 用 EST标记的单株之间的相似系数在 0.4和 1.0之间;RAPD标记 ,单株之间的相似系数在 0.286 0和 0.991 8之
间;加倍一代群体分为三类:分别为偏向母本加拿大披碱草的 、偏向父本老芒麦的和变异较大的类群;对加倍一代群
体的 70个单株进行抽样研究时 ,应从这三个类群中按比例抽取样本 ,以便科学全面地对其进行研究。
关键词:加拿大披碱草;老芒麦;加倍一代;分子标记;聚类分析
中图分类号:S543.9　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2010)02-0106-06
ClusterAnalysisofC1Ⅱ PopulationofE.canadensisandE.sibiricus
LIJing-huan1, 2 , YUNJin-feng1 , WANGCi-hang2 , YANGMin2 , ZHANGLi2
(1.ColegeofEcologyEnvironment, InnerMongoliaAgriculturalUniversity, Huhhot　010019, China;
2.ColegeofLifeScienceandTechnology, InnerMongoliaNormalUniversity, Huhhot　010022, China)
Abstract:Clusteranalysisof70individualsinC1ⅡofE.canadensisiandandE.sibiricuswasdonethroughESTandmolecularmarkers.Theresultsshowedthatthegeneticsimilaritycoeficientof70 individualsvariedfrom0.4 to
1 byEST, andthegeneticsimilaritycoeficientvariedfrom0.286 0to0.991 8byRAPD.AccodingRAPDandEST
markers, C1Ⅱpopulationcanbeclassifiedintothreegroups:onetendedtomaternalE.canadensisi, theothertendedtopaternalE.sibiricus, andanotherwasgreatvariabilities.Samplingon70individulsinC1Ⅱpopulation, wecannotSam-
pleatrandom, butproportionalsamplingmustbeused, whichwasbeneficialtostudyC1Ⅱscientificalyandentirely.Keywords:E.canadensisi;E.sibiricus;C1Ⅱ;Molecularmarkers;Clusteranalysis
　　近年来 ,遗传标记(Geneticmarkers)作为一种
新的分类方法在生物分类学中得到应用 [ 1-6] 。因为
大量的生化标记和分子标记结合聚类分析方法对物
种进行分类 ,能较为真实地表现品种的综合性状 ,聚
类的结果比较稳定 ,为育种取材提供客观依据 。
通常用 RAPD标记[ 1-5] 、同工酶谱(其中以过氧
化物酶和酯酶应用最广)、作物蛋白 SDS(聚丙烯酰胺
凝胶电泳法)图谱来做聚类分析 。这些分子标记都有
一个共同点 ,即具有相对的稳定性 ,这是利用它们从
分子水平上进行生物聚类分析的前提和基础。在育
种工作中 ,对于一个分离程度较大的育种群体来讲 ,
应用聚类分析的方法辅助选择具有重要指导意义。
本试验以 RAPD和 EST(酯酶同工酶)两种遗传
标记方法 ,对加拿大披碱草 ×老芒麦的杂种 C1Ⅱ群
体进行聚类分析 ,旨在寻求更为科学的抽样研究策
略 ,同时为选择优良单株提供依据 ,为培育牧草新品
种奠定基础 。
1　材料和方法
1.1　试验地概况
试验地设在内蒙古农业大学牧草试验站 。该站
地处内蒙古呼和浩特市 , 位于东经 111゜42′, 北纬
40゜ 49′,海拔 1 063 m,属典型大陆性气候 ,年平均降
水 400 mm左右 ,无霜期 140 d。试验地属暗栗钙
土 ,砂壤质 ,肥力条件中等 ,土壤 pH值 7.5左右 ,具
备灌溉条件。
1.2　试验方法
1.2.1　供试材料的准备 　材料为加拿大披碱草
(母本)、老芒麦(父本)和加倍 1代株系 Ⅱ(C1Ⅱ)
群体 , 2005年 3月将供试材料播种于内蒙古农业大
学生态环境学院温室花盆中 , 2005年 5月将材料分
株栽种在内蒙古农业大学牧草试验站 ,株距和行距
都为 60 cm,每穴 1株。
1.2.2　同工酶的测试和分析　材料为加拿大披碱
2期 李景环等:加拿大披碱草 ×老芒麦杂种加倍一代群体的聚类分析 107　
草(母本)、老芒麦(父本)、C1Ⅱ群体(C1Ⅱ有 70个
单株),取分蘖期或幼苗期叶片 1 g,加拿大披碱草
(母本)和老芒麦(父本)植株群体的样本来自于 10
个单株 , C1 Ⅱ群体的样本为 70个单株 。加 4 mL
Tris-甘氨酸电极缓冲液(pH8.3)、4 mL40%甘油 ,
将上述每种材料的单株样品分别在冰浴下迅速研磨
成匀浆 ,移至 10mL离心管 , 10 000 r/min冷冻离心
20 min,取上清液置 -20℃冰箱内保存放置 。
采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法[ 7-12] ,胶板
厚 1.5 mm,浓缩胶浓度 4%, pH6.7, 分离胶浓度
7.5%(pH8.9),电极缓冲液为 Tris-甘氨酸(pH8.3)
每样槽进样量 60 μL(加拿大披碱草和老芒麦材料
取单株酶液等量混合 ,形成混合酶液 ,再从混合酶液
中取 60 μL, C1Ⅱ 70个单株的酶液 ,单独点样),在
4℃冰箱中电泳 ,初始电压 80 V,当前沿指示剂到达
分离胶时稳压 250 V,直至电泳结束 。
酯酶同工酶(EST)采用醋酸萘酯 -坚牢蓝 RR盐
染色法。染色后的胶板用 7%冰醋酸固定 ,在凝胶成像
系统下照相 ,按迁移率 Rf值(Rf=酶带迁移距离 /前沿
指示剂距离),酶带染色深浅 ,标定每条酶带位置。
1.2.3　DNA的提取与检测
1.2.3.1　DNA的提取
a.取供试材料(在温室里的)新鲜嫩叶片 0.5
g,先用自来水洗掉杂质 ,然后用双蒸水冲洗 3次 ,再
用无菌滤纸吸干叶片上的水分 ,剪成 2 ～ 3 cm的小
段并用保鲜膜包好 ,放在 -78℃冰箱备用 。
b.上述处理好的叶片样品按编号放入 -20℃预
冷的研钵中 ,加液氮研磨成粉末 ,转入 10mL离心管
中(以下均为 5mL的离心管),迅速加入 3 mL65℃
预热的 CTAB提取液 , 65℃温浴 90min。
c.加等体积的氯仿 异戊醇(24 1)充分混匀 ,
4℃ 12 000r/mim离心 10 min。
d.取上清 , 再加入等体积的氯仿 异戊醇
(24 1)充分混匀 , 4℃ 12 000 r/min离心 10 min。
e.取上清 ,加 2 /3体积 -20℃异丙醇 ,混匀 , 4℃
12 000 r/min离心 10 min。
f.得沉淀加 1.5 mL65℃预热的 CTAB提取液 ,
65℃温浴 30min。
g.加等体积的氯仿 异戊醇(24 1)充分混匀 ,
4℃ 12 000r/min离心 10 min。
h.取上清 ,加 2/3体积 -20℃异丙醇 ,混匀 ,
-20℃沉淀 2h;4℃ 12 000r/min离心 10min,沉淀
用 70%乙醇洗涤 2次 ,干燥;将沉淀用 100μLTE回
溶 ,加 RNase3 μL, 37℃放置 1 h, 4℃冰箱保
存 [ 13, 14] 。
1.2.3.2　DNA检测　将上述提取到的加拿大披碱
草 、老芒麦和 C1Ⅱ群体的每一份 DNA样品 ,进行琼
脂糖凝胶电泳 , 稳压 80 V, 以 1 kbplusladder为
marker,利用天能凝胶成像系统检测是否提取到目
的 DNA,照相 ,并用紫外分光光度仪确定其浓度 。
1.2.4　PCR反应条件与反应体系　参照 Wiliams
等[ 13, 14]方法 ,进行 PCR试验。
聚合酶链式反应(PCR)的条件设置为:94℃预变
性 3 min, 94℃变性 1 min, 37℃退火 1 min, 72℃延伸
1.5 min, 40次循环 ,最后 72℃延伸 5min, 4℃保存。
反应体系 12 μL:20 ng/μL的基因组 DNA1
μL, 10×PCRBufer1.5 μL(已包含 Mg2 +,其原浓度
为 15 mmol/L), 0.2 μmol/μL引物 0.5 μL, 5U/μL
Taq酶 0.1 μL, 10 mmol/LdNTPS 1 μL, d.dH2O7.9
μL。PCR反应在 Biometrer热循环仪上进行。每次
PCR做一个阴性对照(不加模板)。并且进行 PCR重
复试验。
电泳及照相:PCR产物在 1.2%的琼脂糖凝胶
上电泳 , 以 1kbplusladder为 Marker,稳压 80V,然
后在天能凝胶成像系统下照相 。
1.2.5　EST电泳和 RAPD结果的分析方法 　EST
电泳的电泳结果采用相似系数法 ,用 SPSS软件进行
聚类分析 。
本研究选上海 Sangon的 20个随机引物进行
PCR扩增 , 引物为 S5、S48、 S52、S67、S126、S127、
S131、S133、 S134、 S138、 S140、 S141、 S156、 S318、
S442、S447、S456、S459、S484、S489。
电泳结果用 Popgen32分析软件计算遗传一致
度和遗传距离 。分析 C1Ⅱ群体内 70个单株(分别
编号为 1、… 70)和双亲(加拿大披碱草为 71号 ,老
芒麦编号为 72)的亲缘关系 。构建聚类树 。
2　结果与分析
2.1　EST同工酶的聚类结果分析
EST同工酶聚类结果表明(图 1 ～ 10), C1Ⅱ群
体内的不同个体基本聚为 3类:第 1类偏向母本类 ,
包括单株 69、70、64、66、67、62、24、25、22, 30、27、28、
20、26、19、57、56、51、54、 55、52、 47、 48、40、43、 45、
61、23、11、16 、2、9、10、7、8、5、6、3、4、37、38、36、33、
34、18、31、32、29、44;第 2类属于偏向父本类 ,包括
单株 46、35、68、14、15、12、13、1、58、63、59、60、39;第
3类是属于变异较大的一类 ,包括单株 21、65、17、
49、50、41、42。这表明 C1 Ⅱ群体中不同个体间在
EST的表达方面存在一定程度的差异。
108　 华　北　农　学　报 25卷
2.2　RAPD聚类分析
RAPD聚类分析结果表明(图 11 ～ 19),加拿大
披碱草和老芒麦及 C1 Ⅱ的不同个体也基本聚为三
类:偏向母本类 ,包括单株 21、66、67、49、50、46、35、
44、61、43、45、40、48、47、55、53、52、54、57、6、5、36、2、
4、22、34、23、11、18、19、29、30、10、37、38、17、20、26、
图 1　C1Ⅱ群体单株 1 ～ 8 EST图
Fig.1　ESTisozymePAGEmapsfrom 1to8
图 2　C1Ⅱ 群体单株 9 ～ 16 EST图
Fig.2　ESTisozymePAGEmapsfrom 9 to16
图 3　C1Ⅱ 群体单株 17 ～ 25 EST图
Fig.3　ESTisozymePAGEmapsfrom 17to25
图 4　C1Ⅱ 群体单株 26 ～ 34 EST图
Fig.4　ESTisozymePAGEmapsfrom 26to34
图 5　C
1
Ⅱ 群体单株 35 ～ 43EST图Fig.5　ESTisozymePAGEmapsfrom 35 to43
图 6　C1Ⅱ 群体单株 44 ～ 52EST图Fig.6　ESTisozymePAGEmapsfrom 44 to52
图 7　C1Ⅱ 群体单株 53 ～ 59EST图Fig.7　ESTisozymePAGEmapsfrom 53 to59
图 8　C1Ⅱ 群体单株 60 ～ 66EST图Fig.8　ESTisozymePAGEmapsfrom 60 to66
J.加拿大披碱草;L.老芒麦。
J.E.canadensisi;L.E.sibiricus
图 9　C1Ⅱ 群体单株 67 ～ 70和双亲 EST图
Fig.9　ESTisozymemapsfrom 67 to70, JandL
2期 李景环等:加拿大披碱草 ×老芒麦杂种加倍一代群体的聚类分析 109　
27、28、69、70、65、51、64、56;偏向父本类 ,包括单株
58、59、60、62、68、14、15、12、13、1、39;变异较大的一
类 ,包括单株 7、24、33、35、31、8、9、41、42、16、32、3、
25。这一结果与 EST的聚类结果基本一致。
图 10　加拿大披碱草 、老芒麦和 C
1
Ⅱ群体的 70个
单株的 EST聚类图
Fig.10　ESTclassificfigureof
E.Canadensis, E.sibiricusandC1Ⅱ
图 11　加拿大披碱草 、老芒麦和 C1Ⅱ
群体的 70个单株的 RAPD聚类图
Fig.11　RAPDclassificfigureofE.Canadensis,
E.sibiricusandC1Ⅱ
110　 华　北　农　学　报 25卷
图 12　C1Ⅱ引物 S5扩增图谱
Fig.12　PCRamplificationresultsofS5onC1Ⅱ
图 13　C1Ⅱ引物 S52扩增图谱
Fig.13　PCRamplificationresultsofS52 onC1Ⅱ
图 14　C1Ⅱ引物 S126扩增图谱
Fig.14　PCRamplificationresultsofS126 onC1Ⅱ
图 15　C1Ⅱ引物 S127扩增图谱
Fig.15　PCRamplificationresultsofS127 onC1Ⅱ
图 16　C1Ⅱ引物 S140扩增图谱
Fig.16　PCRamplificationresultsofS140 onC1Ⅱ
3　讨论与结论
　　本研究通过同工酶和 RAPD标记 ,对 C1Ⅱ的 70
个单株进行了聚类分析 ,结果表明 ,用 EST标记的
图 17　C1Ⅱ引物 S141扩增图谱
Fig.17　PCRamplificationresultsofS141 onC1Ⅱ
图 18　C1Ⅱ引物 S489扩增图谱
Fig.18　PCRamplificationresultsofS489 onC1Ⅱ
图 19　C1Ⅱ引物 S131扩增图谱
Fig.19　PCRamplificationresultsofS131 onC
1
Ⅱ
单株之间的相似系数在 0.4和 1.0之间;RAPD聚
类 ,单株之间的相似系数在 0.286 0和 0.991 8之
间 ,聚类结果发现 RAPD的聚类结果与 EST的聚类
结果相似 ,但是并不完全一致 ,鉴于 RAPD是 DNA
水平的标记 ,受环境的影响较小 ,所以本研究认为
RAPD技术分析各个材料之间的遗传关系较同工酶
分析的结果更为准确 、可靠。
利用 EST和 RAPD标记方法对加拿大披碱草
与老芒麦的 C1Ⅱ群体进行聚类分析表明 , C1Ⅱ群体
是一个分离很大的群体 , EST和 RAPD的聚类结果
基本一致 。即 C1Ⅱ群体内的植株基本聚为三类:偏
母本类 、偏父本类和变异较大的一类。
同工酶是蛋白质 ,同工酶的差异在一定程度上
反映了基因的差异 。但是它的表达要受生物生长发
育调控 ,在不同的生育期 ,不同的同工酶得到的聚类
结果可能不同 ,通过本研究的结果表明 ,如果是在生
物的居群分类方面 ,用同工酶标记法还有待进一步
的验证。而 RAPD标记法则能够用于生物的分类 。
对 C1Ⅱ群体的聚类结果表明 ,对 C1Ⅱ群体的
70个单株进行抽样时 ,并不能随机抽取 ,应从这三
2期 李景环等:加拿大披碱草 ×老芒麦杂种加倍一代群体的聚类分析 111　
个类群中按比例抽取样本 ,以便利于试验结果的准
确性。 C1Ⅱ群体会发生性状分离 ,如果随机取样 ,对
于较大的群体来讲 ,可能会造成较大的随机误差 ,导
致以偏概全 ,对以后的研究不利。但是聚类方法不
同可能会得到不同的结果 ,因此应采取多种方法进
行聚类分析 ,以便获取更准确的试验结果 。
在 C1Ⅱ群体中选择优良单株时 ,尽量选择双亲
的中间类型而且具有明显杂种优势的植株作为下一
代的育种材料。
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