全 文 ：偃麦草冬季非质体蛋白抗冻活性的研究
收稿日期：2008-03-03
作者简介：李岩（1982-），女，山东人，硕士研究生，研究方向
为草坪逆境生理与品种选育。E-mail: luckyone_yan@yahoo. com. cn
*通讯作者 E-mail: daidiche@yahoo. com. cn
李 岩，龚束芳，杨 涛，车代弟*
（东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）
摘 要：以黑龙江省野生偃麦草为试验材料，提取冬季偃麦草根茎的非质体蛋白，通过对蛋白质进行 SDS-
PAGE分析，发现冬季偃麦草非质体蛋白有 6条清晰的条带，分子质量为 68.0、46.0、39.0、34.0、28.0、23.0 ku的
蛋白均有可修饰冰晶形态抗冻蛋白存在，其中分子质量为 68.0、46.0、28.0、23.0 ku的蛋白具有较高的抗冻活性，
34.0 ku的蛋白具有较弱的抗冻活性，39.0 ku蛋白基本不具抗冻活性；冬季偃麦草非质体蛋白浓度越高，抗冻活性
越强。
关键词：麦草；非质体蛋白；抗冻蛋白；冰晶修饰
中图分类号：Q813.4；S816.5+3 文献标识码：A
低温是影响植物生长的一种逆境因素，也是
限制植物分布的关键因子。为适应生态环境，植
物会发生一系列生理变化来适应低温胁迫，产生
对低温的抗性。
抗冻蛋白（Ａntifreeze Protein, AFP）是一类能够
保护生物有机体免受结冰引起伤害的蛋白质。最
早在极地鱼类中发现，目前在鱼类、昆虫、植物、
细菌和真菌体内发现了多种抗冻蛋白。植物经过
冷驯化后，抗冻蛋白在许多组织器官中积累下来，
所以推测它对植物抗冻机制有着重要的作用。
AFPs保护有机体免受结冰引起的伤害，具有
3个基本特征：冰晶形态效应、热滞效应（Ｔhermal
Hysteresis, TH）、重结晶抑制效应（Recrystallization
Inhibition）[1-2]。AFPs对冰晶形态具有明显的修饰效
果，许多研究证明，抗冻蛋白对冰晶的修饰可改
变冰晶的形状，形状各异，大小也差别较大，但
基本上可分为两大类：六棱双金字塔（Ｈexagonal
Bipyramid）和六棱盘（Ｈexagonal Plate）或六棱柱
（Ｈexagonal Column）[3]，抗冻蛋白对冰晶形态的修
饰作用，已经成为检验蛋白质是否具有抗冻活性
的一项重要指标[4-5]。
偃麦草（Elytrigia repens L）是禾本科小麦族偃
麦草属多年生根茎型草本，为黑龙江省广泛分布
的野生的草种类型，具有极强的抗逆能力，抗寒性
尤为突出。本试验以哈尔滨地区野生偃麦草为材
料，利用相差显微镜观察冰晶生长习性，研究冬季
偃麦草非质体蛋白对冰晶的修饰能力，为抗冻蛋白
的鉴定探索一种便捷方法，也为植物抗冻机制的研
究提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1．1 材料
偃麦草（Ｅlytrigia repens L）取自东北农业大学
园艺设施中心圃地。取材时间为冬季（1月中旬）。
1．2 方法
1．2.1 非质体蛋白的提取
提取偃麦草的根茎去除枯黄和干死部分，非质
体蛋白质的提取参照文献[6]方法。
1．2.2 蛋白含量的测定
Bradford法测定蛋白质浓度，用牛血清蛋白作
标准曲线。
1．2.3 蛋白质 SDS-PAGE凝胶电泳的分析
SDS-PAGE凝胶按照文献[7]的方法配制。分离
胶浓度为 18％，浓缩胶浓度为 5％，采用天为时代
公司的低分子质量标准蛋白作为标准，其分子质量
为 14.4～116.0 ku，考马斯亮蓝 R－250染色。
1．2.4 冰晶修饰能力的观察
用相差显微镜和摄像装置观察冰晶生长习性，
并记录溶液冰晶形态。
第 ３9卷 第 11期 东 北 农 业 大 学 学 报 39(11): 28~31
２００8年 11月 Journal of Northeast Agricultural University Nov. 2008
文章编号 １００５－９３６９（２００8）11－0028－04
2 结果与分析
2．1 偃麦草冬季根茎非质体蛋白的 SDS-PAGE分
析及活性检测
将偃麦草冬季非质体蛋白进行 SDS-PAGE 分
析，调节蛋白质的含量浓度 2.0 mg·mL-1。电泳胶
板经考马斯亮蓝 R-250染色后，用紫外凝胶成像
分析系统进行胶片拍照。对冬季分离效果好且丰度
较高的蛋白条带进行了回收，回收的条带进行冰晶
观察（见图 １）。
116.0 ku
66.2 ku
45.0 ku
35.0 ku
25.0 ku
18.4 ku
14.4 ku
68.0 ku
46.0 ku
39.0 ku
34.0 ku
28.0 ku
23.0 ku
A B
WA-冬季非质体蛋白；M-标准蛋白；A-偃麦草非质体蛋白的SDS-PAGE；B-回收条带的蛋白冰晶
WA-Apoplastic protein from winter; M-Protein marker;
A-SDS-PAGE gel analysis of proteins from Elytrigia repens L rhizome; B-Antifreeze activity of different polypeptides from apoplastic protein
图 1 SDS-PAGE分离纯化的冬季偃麦草非质体蛋白的冰晶形态
Fig. 1 Antifreeze activity of apoplastic from SDS-PAGE gel analysis of proteins in winter
偃麦草冬季根茎的非质体蛋白经过 SDS-PAGE
分析，发现冬季的蛋白有 6 条清晰的条带，分子
质量分别为 68.0、46.0、39.0、34.0、28.0、23.0 ku
（图 1-A）。
Griffith对抗冻蛋白修饰冰晶形态的研究表明[4]，
在 ddH2O或没有抗冻活性的溶液中，冰晶沿 a－轴
基面片层叠加生长，形成圆形的冰晶；在低浓度
抗冻蛋白溶液中，抗冻蛋白主要抑制冰晶沿 a－轴
生长，c－轴生长的结果使冰晶呈六棱柱，显微镜
下观察到的冰晶俯视图是六角形；在较高浓度抗
冻蛋白溶液中，抗冻蛋白结合到冰晶棱柱面，抑
制冰晶在 c－轴的生长，冰晶主要沿基面 a－轴生
长，形成双金字塔形冰晶；在高浓度抗冻蛋白溶
液中，冰晶沿 c－轴和 a－轴的生长都受到抑制，形
成针形冰晶。
为进一步了解偃麦草非质体冬季各条带蛋白
质是否具有抗冻作用，分离并回收了 1~6条清晰
带。 偃麦草非质体蛋白各分子质量的蛋白多肽冰
晶形态可见（图 1-B），除分子质量为 39 ku 的蛋
白多肽冰晶形态都为圆形和椭圆形外，其他 68、
46、34、28、23 ku 蛋白带中都观察到 3 种单体
冰晶形态。其中 68、46、28、23 ku 的蛋白具有
较高的抗冻活性，34 ku 的蛋白具有较弱的抗冻
活性，39 ku 蛋白基本不具抗冻活性。说明根茎
能够在零下低温存活，是偃麦草越冬的主体，所
以根茎中的非质体蛋白应该在偃麦草越冬中起主
要作用。
2．2 偃麦草冬季不同浓度非质体蛋白质冰晶形态
及抗冻活性分析
偃麦草经过冷诱导后，非质体内积累了大量的
具有抗冻活性的蛋白，在显微镜下观察的冰晶形状
主要是六角形和针状。研究蛋白浓度和抗冻能力的
关系，用提超纯水溶解冻干保存的偃麦草非质体蛋
白质粗品，调整浓度 1.0、2.0、3.0 mg·mL-1，在 20
倍物镜下进行冰晶形态观察。
Hon 等对冬季抗冻蛋白浓度与冰晶形态关系
进行了研究，高浓度蛋白显示的冰晶修饰活性强，
可将冰晶修饰为双金字塔形和针状，低浓度蛋白
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李 岩等：偃麦草冬季非质体蛋白抗冻活性的研究第 11期 ·29·
可将冰晶修饰为六角形，中浓度蛋白可将冰晶修饰
为柱状[6]。
从图 2可以看到，偃麦草 3种浓度的蛋白都具
有抗冻活性，抗冻活性随冰晶的形态亦不同。偃麦
草非质体蛋白修饰冰晶的类型较少，冰晶形态共有
4 种类型，低温时，柱状和针状冰晶起主要作用
（图 2-F、I）。蛋白浓度越高，越多的冰晶修饰为
针状（具有最高的抗冻活性等级），显示的抗冻活性
逐步增强。就是说蛋白的抗冻活性 3.0 mg·mL-1>
2.0 mg·mL-1>1.0 mg·mL-1。
冬季 3种浓度的非质体蛋白都具有抗冻活性，
共有 4种类型，主要以高抗冻活性的蛋白的柱状与
针状冰晶居多，应该在偃麦草越冬中起主要作用。
其中，含有柱状与针状冰晶的量越多，蛋白的抗冻
能力越强，同时，针状比柱状冰晶抗冻活性高，所
以含有等量的针状冰晶比含有柱状冰晶的蛋白抗冻
活性更高。偃麦草非质体蛋白的浓度越大，显示的
抗冻活性越强。所以，非质体蛋白有较高的抗冻活
性，且与浓度成正比关系。蛋白的抗冻活性水平是
由蛋白种类与蛋白浓度共同决定。
3 讨 论
抗冻生物避免冰冻伤害必须满足两个条件：
① 冰必须在胞外形成；② 冰晶的大小及形状要
受到控制 [8-9]。因此非质体中蛋白质对冰晶的修饰
作用尤为重要，即 AFP对冰晶的影响和植物非质
体有重要的生物学意义，它能控制冰晶的生长，并
在抗冻机制中产生关键作用。
黑龙江省普遍生长的乡土草种偃麦草在初冬时
节，-5 ℃的冻土温度下分蘖依然在进行，黑龙江
省冬季极端低温对其返青无任何不良影响，具有极
强的抗冻能力[6]。本试验中发现冬季非质体蛋白含
有大量的有抗冻活性的条带，分子质量分别为 68、
46、34、28、23 ku。同时，非质体蛋白浓度和抗
冻活性成正比关系。
由于 AFPs具有特殊的性质，它一经发现就引
起了人们的兴趣。 但由于比较复杂的技术，对于
抗冻蛋白的研究还未能在许多植物研究中普及，抗
冻蛋白的鉴定、分离和纯化以及近一步的了解所需
的技术手段还远未能达到理想的效果。但抗冻蛋白
作为完整生理活性中的一部分，对 AFPs的了解和
应用无疑为提高植物抗冻性提供新的途径。
[ 参 考 文 献 ]
[ 1 ] 尹明安, 崔鸿文, 樊代明, 等. 抗冻蛋白及其在植物抗冻基因工
程中的应用[J]. 西北植物学报, 2001, 21(1): 8-13.
[ ２ ] Raymond J A, De Vries A L. Adsorption inhibition as a mechanism
of freezing resistance in polar fishes[J]. Proc Natl Acad Sci USA,
1977, 74(6): 2589-2593.
[ ３ ] Wilson P W, Gould M, DeVries A L. Hexagonal shaped ice spi-
cules in frozen antifreeze protein solutions [J]. Cryobiology, 2002,
44(3): 240-250.
[ ４ ] Griffith M, Extraction and isolation of antifreeze proteins from winter
Rye (Secale cereale L.) leaves[J]. Plant Physiol, 1994, 104: 971-980.
[ ５ ] Graether S P, Kuiper M J, Gagne S M, et al. β-helix structure and
ice binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an
insect[J]. Nature, 2000, 406: 325-328.
[ ６ ] Hon W C, Griffith M, Mlynarz A, et al. Antifreeze proteins in win-
ter rye are similar to pathogenesis-related proteins[J]. Plant Physiol,
1995, 109: 879-889.
[ ７ ] 萨姆布鲁克 J, 拉塞尔 D W. 分子克隆实验指南[M]. 北京: 科学
出版社, 2002.
[ ８ ] 刘俊杰, 李前忠. 抗冻糖蛋白溶液中冰晶生长速率的研究[J]. 生
物物理学报, 2001, 17(4): 1-4.
Ａ Ｂ Ｃ
Ｄ Ｅ Ｆ
Ｇ H I
1.0 mg·mL-1
1.0 mg·mL-1
1.0 mg·mL-1
图 2 偃麦草不同浓度非质体蛋白对冰晶修饰的比较
Fig. 2 Comparison of morphology of ice crystal between
apoplastic protein with different concentrations of
Elytrzgia repens L
·30· 东 北 农 业 大 学 学 报 第 ３9卷
Research on antifreeze activity of apoplastic protein from
Elytrigia repens L in winter
LI Yan， GONG Sufang， YANG Tao， CHE Daidi
（College of Horticulture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)
Abstract: In winter, rhizome of the wild Elytrigia repens L of Heilongjiang Province was selected to extract
the apoplastic protein. Analysis on SDS-PAGE of protein showed that apoplastic protein of Elytrigia repens L had
total 6 limpid bands, proteins with molecular weight of 68.0, 46.0, 34.0, 28.0, 23.0 ku had antifreeze proteins that
can modify ice crystal morphology, and 68, 46, 28, 23 ku proteins had high antifreeze activity; 34 ku protein had
weak antifreeze activity. However, it can not find any antifreeze activity in 39 ku protein; the higher concentrations
of proteins are, the higher antifreeze activities are.
Key words: Elytrigia repens L; apoplastic protein antifreeze-protein; ice crystal modifying
[ ９ ] 张绍志, 王葳, 陆光明, 等. 低温显微装置及其对细胞胞内冰晶
形成现象的观察[J]. 细胞生物学杂志, 2003, 25(4): 231-234.
[1０] Jia Z, Davies P L. Antifreeze proteins: an unusual receptor-lig and
interaction[J]. Trends Biochem Sci, 2002, 27(2): 101-106.
李 岩等：偃麦草冬季非质体蛋白抗冻活性的研究第 11期 ·31·
东北农业大学科技动态
我校开展高教强省建设学习讨论活动
按照省教育厅《关于学习贯彻<黑龙江省高等教育强省建设规划>集中开展高教强省建设大讨论活动的通知》
（黑教高[2008]177号）的部署和要求，为进一步推进我校高教强省建设大讨论活动，校党委书记徐梅、校长李庆
章、校党委副书记胡国良、副校长秦智伟、刘荣、郑秋鹛先后为全校干部教师作了专题辅导报告。全校副处级以
上干部、各级重点学科带头人（负责人）、全体正高级职称人员、各学院系主任、全校教工党支部支部书记、党政
机关副科级以上（含副科级）干部、全体辅导员参加了报告会。
徐梅书记在《解放思想、认清形势、深化改革、加快发展》报告中指出，解放思想、提高认识，这是我校参与
“高教强省”建设的根本前提；认清形势、准确定位，是我校参与“高教强省”建设的重要基础；深化改革、破解难
题，是我校参与“高教强省”建设的必经之路；抢抓机遇、加快发展，是我校参与“高教强省”建设的最终目的。徐
梅书记详细论述了高教强省为什么首先要提解放思想、“第三次思想解放”给我们带来了哪些启示、“高教强省”建
设需要从哪几方面进行思想解放，强调要认清国家“三农”工作的新形势、认清我省高等教育和农业发展形势、准
确把握在历史新阶段我校发展形势。
李庆章校长在《深入实现“产学研”结合，为“高教强省”作更大贡献》报告中从大学职能的嬗变与现代大学的职
能，高教强省的内涵、特征与评价指标，东北农业大学在高教强省建设中的主要优势，东北农业大学服务高教强
省建设的初步构想等四个方面阐述了我校在“高教强省”中的地位与作用。他指出，为高教强省建设服务是我校义
不容辞的历史使命，在服务高教强省建设和我省经济社会发展中获取支持、提升实力、赢得位置，也是东北农业
大学今后谋求自身发展的必由之路。能否抓住高教强省建设这一难得机遇，乘势而上，关系到我校的长远发展，
关系到我校在全省高教系统的位置和地位。希望全校师生员工振奋精神、真抓实干，坚持走“内涵发展”之路，努
力实现“产学研”结合，为我省高教强省建设作出更大贡献。
辅导报告后，各处室、学院结合自身的工作特点，开展内部大讨论。结合前一阶段大讨论活动提出的问题，
进一步找准制约我校发展的主要问题，积极探索出切实可行的解决办法。
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