全 文 ：分子植物育种，2009年，第 7卷，第 1期，第 169-176页
Molecular Plant Breeding, 2009, Vol.7, No.1, 169-176
新基因、新种质、新品种
New Gene & Germplasm
毛偃麦草 Na+/H+逆向转运蛋白的分子克隆及生物信息学分析
关宁 李聪 * 王涌鑫 苗丽宏
中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草遗传育种研究室,北京, 100193
*通讯作者, licong0520@sina.com
摘 要 根据小麦和长穗偃麦草的液泡膜 Na+/H+逆转运蛋白基因(TaNHX1、TeNHX1)全长序列设计引物，通
过 RT-PCR直接扩增的方法从毛偃麦草(Elytrigia trichophora L.)中克隆到了 Na+/H+逆转运蛋白基因，命名为
EtNHX1 (Accession numeber: EU876834)。EtNHX1最大开放阅读框为 1 641 bp，编码含有 546个氨基酸残
基、分子量为 59.8 kD的蛋白，预测等电点 8.0。EtNHX1含有 39个碱性氨基酸，37个酸性氨基酸，256个疏水
氨基酸及 128个极性氨基酸。二级结构预测表明该蛋白含约 47%的 α-螺旋、20%的延伸链、4.5%的 β-转角
和 28%的不规则卷曲。亲疏水性分析显示，EtNHX1含有 12个连续的疏水片断，其中 10个可能构成跨膜螺
旋。序列分析显示，EtNHX1与小麦(Triticum aestivum L.)、中间偃麦草(Thinopyrum intermedium L.)、长穗偃麦草
(Elytrigia elongate L.)、水稻(Oryza sativa L.)、角果碱蓬(Suaeda corniculata L.)、小盐芥(Thellungiella halophila L.)
等植物的液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白高度同源，序列相似性分别为 98%、98%、96%、85%、68%和 67%。序列
比对结果以及进化树分析均表明 EtNHX1应为定位于毛偃麦草液胞膜上的 Na+/H+逆向转运蛋白。
关键词 毛偃麦草, Na+/H+逆向转运蛋白,生物信息学
Molecular Cloning and Bioinformatics Analysis of a Vacuolar Na+/H+ An-
tiporter Gene in Elytrigia trichophora
Guan Ning Li Cong * Wang Yongxin Miao Lihong
Forage Plants Genetics and Breeding Laboratory, Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, 100193
* Corresponding author, licong0520@sina.com
Abstract The cDNA of Na+/H+ antiporter gene from Elytrigia trichophora named EtNHX1 (Accession numeber:
EU876834) was isolated by RT-PCR, with primers designed according to the sequence of TaNHX1 and TeNHX1.
The largest open reading frame of EtNHX1 gene has 1 641 bp in length and encoded a polypeptide of 546 amino
acid residues. The estimated molecular weight and isoelectric points of the putative protein were 59.8 kD and 8.0,
respectively. Components of amino acids encoded by EtNHX1 contained 39 basic amino acids, 37 acidic amino
acid, 256 hydrophobic amino acids and 128 polar amino acids. The predicted secondary structure composition
for the protein has about 47% alpha helixes, 20% extended strand, 4.5% beta turn and 28% random coil. Hy-
drophobicity/hydrophilic analysis indicated that the EtNHX1 had 12 hydrophobic segments containing 10 potential
transmembrane segments. Sequencing analysis showed that EtNHX1 had high identity with TaNHX1, TiNHX1,
TeNHX1, OsNHX1, ScNHX1, ThNHX1, and had about 98%, 98%, 96%, 85%, 68%, and 67% similarity respectively.
Blast result and the phylogenetic tree analysis showed that EtNHX1 was Na+/H+ antiporter located on vacuolar of
Elytrigia trichophora.
Keywords Elytrigia trichophora, Na+/H+ antiporter, Bioinformatics
基金项目：本研究由国家十一五科技支撑计划(2006BAD01A19)和中国农科院院所基金(ywf-td-03)资助
植物降低细胞内 Na+浓度的措施有降低 Na+的
吸收、Na+的外排和 Na+的区隔化，其中 Na+的外排和
区隔化主要由 Na+/H+逆向转运蛋白来调节，它通过
Na+外排和 Na+区隔化来维持植物细胞质的 Na+稳态
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和 Na+/ K+比相对稳定，是植物耐盐的关键因子(任仲
海等, 2002)。因此该蛋白的功能与植物耐盐性的关系
及其分子生物学的研究就成为近年来人们研究的热
点问题之一。Apse等(1999)利用拟南芥(Arabidopsis
thaliana) Na+/H+逆向转运蛋白 AtNHX1的过量表达
显著提高转基因拟南芥的耐盐性。Fukuda等(2004)
利用水稻(Oryza sativa L.)液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋
白基因 OsNHX1过量表达来提高转基因水稻的耐盐
性。近年来，陆续在小麦(Triticum aestivum L.)和棉花
(Gossypium hirsutum L.)等农作物(Wang et al., 2002;
Wu et al., 2004)及小盐芥(Thellungiella halophila L.)、
盐地碱蓬(Suaeda salsa)等耐盐植物(Taji et al., 2004;
Hamada et al., 2001)中分离出来 Na+/H+逆向转运蛋
白(NHX1)基因，这些液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白基
因对于改造农作物的耐盐性状有极其重要的作用,在
农业生产中的应用有着积极意义。本研究通过
RT-PCR法，从耐盐牧草种质资源—毛偃麦草(Elytrigia
trichophora, 2n=42)中分离 Na+/H+逆向转运蛋白基因，
进行生物信息学分析，为牧草转基因工作及培育优
良品种奠定理论基础。
1材料和方法
1.1材料与试剂
毛偃麦草耐盐种质材料 ZXY04P-491，由中国农
业科学院北京畜牧兽医研究所牧草资源研究室提
供。本实验所用大肠杆菌菌株为 DH5α，克隆载体为
pMD18-T (TaKaRa公司)。
TRIzol总 RNA提取试剂购自美国 Invitrogen公
司，M-MLV逆转录酶、Oligo (dT) 15 Primer及 DNA
片段回收试剂盒购自美国 Promega 公司，dNTP、Ri-
bonulease Inhibitor、DNaseⅠ和 Ex Taq为 TaKaRa公
司出品，各种限制性内切酶、2-Log DNA Ladder为美
国 NEB公司产品，其余常规药品均为进口或国产分
析纯级。
1.2植物材料
将毛偃麦草 ZXY04P-491种子用蒸馏水洗涤多
次后，浸种 1 d，播种于直径为 20 cm、深 3 cm的托盘
中，置于光照培养箱。培养条件：25℃，14 h光照，10 h
黑暗培养。15 d 后收获整株植物叶片用于提取总
RNA。毛偃麦草叶片总 RNA的提取按照 Invitrogen
公司的 TRIzol试剂说明书进行。2 μg的总 RNA用
于 cDNA第一链的合成，作为 RT-PCR的模板。
1.3 EtNHX1的 cDNA克隆
根据小麦 TaNHX1 (AY040245)以及长穗偃麦草
TeNHX1 (AF507044)全长序列中设计一对引物，引物
序列为：
P1：5-AAGCAGCTGAATCTCTCGTCCGGCCC
AGGCT-3；P2：5-GGGCTTCGACTTAACTACGGT
CTTCTGCCTCCGTCACAGT-3。
引物由 Invitrogen公司合成。采用 50 μL 反应
体系，含 PCR buffer 5 μL，0.2 mmol/L dNTP，上下游
引物各 0.4 μmol/L，模板 DNA 0.5 μg，Ex Taq 1 U。
PCR 扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，61℃ 30 s，
72℃ 3 min，3个循环；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 3min，
5个循环；94℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 3 min，30个循环；
72℃10min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。目
的条带经胶回收纯化后，连接到 pMD18-T载体上，
转化大肠杆菌 DH5α的感受态细胞，委托中国农业
科学院重大科学工程开放实验室进行测序。
1.4氨基酸与蛋白质生物信息学分析
依据NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、ExPASy
(http://cn.Expasy.org/)、EBI (http://www.ebi.ac.uk/)等
网站提供的各类生物信息学软件进行在线分析。核
酸及氨基酸序列的组成成分分析、理化性质分析、开
放阅读框(open reading flame, ORF)的查找和翻译用
DNAStar 6.13和 DNAMan 5.2软件完成；核苷酸和
氨基酸序列的同源性比对用 Blast在线工具和 DNA-
Man 5.2软件完成；蛋白质二级结构、跨膜结构域和
亲水性 / 疏水性的分析用 SOPMA、MHMM2.0、
ProtScale等在线软件完成。
1.5 RNA质量及浓度测定
非变性琼脂糖凝胶电泳参照《分子克隆实验指
南》(2002)的方法进行，胶浓度为 1.0%，检测总 RNA
的完整性。用紫外分光光度计测定提取的 RNA在
260 nm和 280 nm处的光吸收值，确定 RNA的纯度
及浓度。
2结果与分析
2.1总 RNA的提取
总 RNA的质量是关系反转录 cDNA完整性的
重要因素。提取的毛偃麦草总 RNA用无 RNase的
DNaseⅠ处理，除去污染的基因组 DNA，用 1.0%琼
脂糖非变性凝胶电泳鉴定，结果如图 1，28S RNA和
170
18S RNA条带清晰，表明提取的 RNA完整性较好。
提取的 RNA的 OD260/OD280都介于 1.8~2.0之间，说
明 RNA的纯度比较高，可以用于后续的实验。
2.2毛偃麦草液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆
根据小麦 TaNHX1 (AY040245)以及长穗偃麦草
TeNHX1 (AF507044)的全长在该基因编码区外设计
引物，从毛偃麦草叶中提取总 RNA 并反转录。
RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增得到片段
与估计的片段大小符合(1 700 bp左右)，如图 2所示。
用试剂盒回收纯化目的片段，连接到 pMD18-T克隆
载体上，转化大肠杆菌 DH5α。从转化的平板上挑选
白斑划线，初步筛选出带有插入片段的克隆。随机挑
选抗性克隆提取质粒 DNA，进行酶切鉴定，其中一
个能切出目的片段，如图 3。将鉴定好的菌液送往中
国农业科学院重大科学工程开放实验室测序，用
Blast软件将所得片段序列在数据库中进行搜索，发
现所得片段为所要克隆目的基因的中间片段，而且
包含全部编码区序列。我们将这个 cDNA 片段在
GenBank中进行了登记，命名为 EtNHX1 (Accession
numeber: EU876834)。
图 1从毛偃麦草中提取的总 RNA
Figure 1 Total RNA extracted from Elytrigia trichophor
图 2 EtNHX1 cDNA的扩增
注: M: DL2000 marker
Figure 2 Amplification of EtNHX1 cDNA
Note: M: DL2000 marker
2.3 EtNHX1基因序列特征分析
扩增得到 EtNHX1核苷酸序列为 1 768个核苷
酸，利用 DNAStar 6.13对 EtNHX1基因 cDNA序列
进行分析，发现该基因包含全编码区，为 1 641 bp，编
码 546个氨基酸序列(图 4)。对所推测氨基酸序列进
行分析表明，该蛋白分子量为 59.8 kD，等电点为 8.0，
pH 7.0时的电荷为 3.58；碱性氨基酸(K, R) 39个；酸
性氨基酸(D, E) 37个；疏水氨基酸(A, I, F, W, V) 256
个；极性氨基酸(N, C, Q, S, T, Y) 128个。
通过 SOPMA预测毛偃麦草 Na+/H+逆向转运蛋
白的二级结构(图 5)，表明该蛋白含约 47%的 α-螺
旋、20%的延伸链、4.5%的 β-转角和28%的不规则
卷曲。
用 ProtScale预测毛偃麦草 Na+/H+逆向转运蛋白
氨基酸序列的疏水性 /亲水性的结果表明，多肽链第
373位的谷氨酸(Glu)具有最低的分值-1.978，第350
位的甘氨酸(Gly)具有最高的分值 3.111 (图 6)。依据
氨基酸分值越低亲水性越强和分值越高疏水性越强
(参考软件 ProtScale)的规律，可以看出，在第 373位
的 Glu亲水性最强，第 350位的 Gly疏水性最强，而
就整体来看，疏水性氨基酸均匀分布在整个肽链中，
且多于亲水性氨基酸。因此，整个多肽链表现为疏水
性，没有明显的亲水区域，可认为毛偃麦草 Na+/H+逆
向转运蛋白是疏水性蛋白，说明该逆转运蛋白符合
跨膜蛋白的特征。
运用 TMHMM软件对毛偃麦草的 Na+/H+逆向
转运蛋白跨膜结构进行分析，结果显示 EtNHX1含
有 12个疏水区域，其中 10个跨膜(图 7)，另外 2个
可能与膜相关，但并不跨膜。这与在水稻 OsNHX1和
番杏(Tetragonia tetragonioides) TtNHX1 基因编码的
图 3 EtNHX1 cDNA的酶切鉴定
注: M: 2-Log DNA ladder
Figure 3 Restriction analysis of EtNHX1 cDNA
Note: M: 2-Log DNA ladder
毛偃麦草 Na+/H+逆向转运蛋白的分子克隆及生物信息学分析
Molecular Cloning and Bioinformatics Analysis of a Vacuolar Na+/H+ Antiporter Gene in Elytrigia trichophora 171
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图 4 EtNHX1基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
注:氨基酸序列以单个字母表示;方框内为转录起始密码子 ATG;终止密码子以星号表示;下划线部分表示非编码区;灰底黑字
为真核生物 Na+/H+逆向转运蛋白抑制剂氨氯吡嗪脒结合位点
Figure 4 The nucleotide and deduced amino acid sequences of EtNHX1
Note: The amino acid residues are indicated by a single letter code; A potential translation initiation codon (ATG) is boxed; A termina-
tion codon is marked with asterisk; The untranslated regions are underlined; Gray shading with dark letters reflects the binding site of
amiloride that inhibits eukaryotic Na+/H+ antiporters
172
98%、96%、85%、68%和 67%。利用 DNAMan 5.2对
来源于毛偃麦草、小麦、长穗偃麦草、中间偃麦草、水
稻、小盐芥、角果碱蓬的 Na+/H+逆向转运蛋白序列进
行同源比较分析(图 8)，结果表明在 EtNHX1保守区
上有 Na+/H+逆向转运蛋白活力的竞争性抑制剂氨氯
吡嗪脒的结合位点(84IFFIYLLPPI93)，可能与 Na+的
竞争性抑制有关。
利用 DNAMan5.2对来自小麦、长穗偃麦草、水
稻、中间偃麦草、小盐芥、角果碱蓬、拟南芥、滨藜
(Atriplex gmelini)和星星草 (Puccinellia tenuiflora)等
植物的 Na+/H+逆向转运蛋白基因进行分子聚类分
析，构建了 Na+/H+逆向转运蛋白的进化树(图 9)。
进化树分析表明：EtNHX1 与液泡膜 Na+/H+逆
向转运蛋白属于同一簇。EtNHX1与盐生植物角果碱
蓬、滨藜、小盐芥、马蔺的液胞膜 Na+/H+逆向转运蛋
白基因家族的成员亲缘关系较近。其中与小麦的液
胞膜 Na+/H+逆向转运蛋白基因 TaNHX1、中间偃麦
草的 TiNHX1、长穗偃麦草的 TeNHX1、水稻的
OsNHX1亲缘关系更近。而与拟南芥质膜 Na+/H+逆
向转运蛋白基因 AtSOS1、水稻的 OsSOS1、小盐芥的
ThSOS1、星星草的 PtSOS1亲缘关系较远。序列比对
结果以及进化树分析都表明 EtNHX1应为编码毛偃
麦草液胞膜上的 Na+/H+逆向转运蛋白一类的基因。
3讨论
植物的耐盐性是复杂性状，是多个基因相互作用
的结果。然而有研究表明，转单一的 Na+/H+逆向转运
蛋白基因能够明显地提高作物的耐盐性(Porat et al.,
2002)，其原因可能是 Na+/H+逆向转运蛋白基因转化
进入植物细胞后激活了一系列与耐盐相关的基因，从
而明显地提高了植物耐盐性。因此，液泡膜 Na+/H+逆
向转运蛋白对植物耐盐性的研究具有重要的意义。
本研究采用 RT-PCR的方法从毛偃麦草中分离
得到了液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白基因 EtNHX1，
疏水性分析表明，本研究所克隆的 EtNHX1具有 10
个跨膜区，这与已报道的动植物 Na+/H+逆向转运蛋
白的跨膜区数目(10~12)一致。与其他植物液泡膜
Na+/H+逆向转运蛋白的同源性分析可以看出，跨膜区
是高度保守的，这些区域在Na+与 H+交换中可能起到
重要作用(Orlowski andGrinstein, 1997)。分析 EtNHX1
的拓扑结构表明其蛋白的 C 端位于液泡的内腔内
(图 7)，可以调节该蛋白的Na+和K+选择性。然而也存
在着非保守区，在这些差异区域中，EtNHX1氨基酸序
列与TaNHX1、TeNHX1、OsNHX1、TiNHX1 序列同源
性很高，而这 5个基因均是甜土植物的 Na+/H+逆向
图 5毛偃麦草 Na+/H+逆向转运蛋白二级结构的预测
注: a: α-螺旋; b:延伸链; c: β-转角; d:不规则卷曲
Figure 5 Predicted secondary structure for Na+/H+ antiporter from
Elytrigia trichophora
Note: a: Alpha helix; b: Extended strand; c: Beta turn; d: Random
coil
图 6毛偃麦草 Na+/H+逆向转运蛋白疏水性 /亲水性的预测
Figure 6 Predicted hydrophobicity/hydrophilic for Na+/H+ an-
tiporter from Elytrigia trichophora
图 7毛偃麦草 Na+/H+逆向转运蛋白跨膜区分析
Figure 7 Prediction of transmembrane helixes for Na+/H+ an-
tiporter from Elytrigia trichophora
Na+/H+逆向转运蛋白具有 12个跨膜结构域有一定
的差别(刘祝玲等, 2007;吕慧颖等, 2004)。
2.4同源比对与系统树构建
将毛偃麦草 Na+/H+逆向转运蛋白与 GenBank
中所有的氨基酸序列进行 Blast 比对，结果显示
EtNHX1编码蛋白与中间偃麦草、小麦、长穗偃麦草、
水稻、角果碱蓬、小盐芥植物的液泡膜 Na+/H+逆向转
运蛋白氨基酸序列高度同源，同源性分别为 98%、
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图 8 不同植物来源的液泡型 Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列的同源性比较
注:黑底白字和灰底黑字分别代表 100%和 75%的同源性;序列中的圆点代表缺少的氨基酸; EtNHX1假定的跨膜结构域用罗
马字表示; Na+/H+逆向转运蛋白的来源分别为:毛偃麦草的 EtNHX1 (ACG58413),中间偃麦草的 TiNHX1 (ABN54446),小麦的
TaNHX1 (AAK76737),长穗偃麦草的 TeNHX1 (AAQ07963),水稻的 OsNHX1 (AAQ63678),小盐芥的 ThNHX1 (ABJ97691),和
角果碱蓬的 ScNHX1 (ABF68604)
Figure 8 Homology analysis of amino acid sequence of vacuolar Na+/H+ antiporters from different plant species
Note: Dark shading with white letters and gray shading with dark letters reflect 100% and 75% sequence conservation respectively; Dot
signs represent gaps introduced to maximize similarity; The putative transmembrane domains of EtNHX1 are indicated by Roman num-
bers; The accession numbers in GenBank and sources of the Na+/H+ antiporters are as follows: EtNHX1 (ACG58413), Elytrigia trichopho－
ra; TiNHX1 (ABN54446), Thinopyrum intermedium; TaNHX1 (AAK76737), Triticum aestivum; TeNHX1 (AAQ07963), Elytrigia elon－
gata; OsNHX1 (AAQ63678),Oryza sativa; ThNHX1 (ABJ97691), Thellungiella halophila; ScNHX1 (ABF68604), Suaeda corniculata
图 9 Na+/H+逆向转运蛋白的系统发育树分析
注: Na+/H+逆向转运蛋白分别来自:毛偃麦草 EtNHX1 (ACG58413,框内);长穗偃麦草 TeNHX1 (AAQ07963);中间偃麦草 TiN-
HX1 (ABN54446); 小麦 TaNHX1 (AAK76737); 角果碱蓬 ScNHX1 (ABF68604); 小盐芥 ThNHX1 (ABJ97691), ThSOS1
(ABN04857); 拟南芥 AtNHX1 (AAM08403), AtSOS1 (NP_178307); 水稻 OsNHX1 (AAQ63678), OsSOS1 (AAW33875); 滨藜
AgNHX1 (BAB11940);马蔺 IlNHX1 (AAV81619);星星草 PtSOS1 (ABO32636)
Figure 9 Phylogenetic tree analysis of Na+/H+ antiporter proteins
Note: EtNHX1(ACG58413, boxed) from Elytrigia trichophora, TeNHX1 (AAQ07963) from Elytrigia elongate; TiNHX1 (ABN54446)
from Thinopyrum intermedium; TaNHX1 (AAK76737) from Triticum aestivum; ScNHX1 (ABF68604) from Suaeda corniculata; ThN-
HX1 (ABJ97691) and ThSOS1 (ABN04857) from Thellungiella halophila; AtNHX1 (AAM08403) and AtSOS1 (NP_178307) from
Arabidopsis thaliana; OsNHX1 (AAQ63678) and OsSOS1 (AAW33875) from Oryza sativa, AgNHX1 (BAB11940) from Atriplex
gmelini; IlNHX1 (AAV81619) from Iris lactea; PtSOS1 (ABO32636) from Puccinellia tenuiflora
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转运蛋白基因，即甜土植物与盐生植物 Na+/H+逆向
转运蛋白氨基酸序列之间存在着非保守区，这些差
异可能是甜土植物与盐生植物 Na+/H+逆向转运蛋白
活性不同的反映。
棉花液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白基因 GhNHX1
受盐胁迫强烈诱导，在各个器官中都有表达，但在
叶中更强一些(Wu et al., 2004)。同样，小麦 TaNHX1
基因的表达也受盐胁迫的诱导，并且在苗中表达量
相对要高一些(Wang et al., 2002)。而长穗偃麦草的
Na+/H+反向转运蛋白基因 TeNHX1只在长穗偃麦草
的根中表达，并且不受盐胁迫的诱导，是组成型表
达的基因(乔卫华, 2006)。我们克隆得到的毛偃麦草
Na+/H+逆向转运蛋白基因 EtNHX1也不受盐胁迫诱
导，也是组成型表达基因。有关的研究报道，一些与
耐盐有关的基因，在盐生植物盐芥中是组成型表达
的，而在它的近缘物种盐敏感植物拟南芥中却是盐
胁迫诱导表达的，这或许就是盐芥比拟南芥更耐盐
的原因(Taji et al., 2004)。因此我们推测，偃麦草属牧
草之所以具有比其它禾本科作物更强的耐盐能力，
也许是因为能组成型表达一些在其它植物中需要盐
胁迫诱导才能表达的基因，例如 TeNHX1、TiNHX1。
因此我们推断 EtNHX1在提高植物的耐盐能力方面
起着重要的作用。但液泡的纳盐容量有限，仅仅依靠
液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白提高植物的耐盐能力可
能有限。如果同时能够提高质膜 Na+的外排能力，即
将质膜 Na+/H+逆向转运蛋白和液泡膜 Na+/H+逆向
转运蛋白基因共同转入植物可能效果会更好(邱生平
等, 2006;邱念伟等, 2001)。
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