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2009 年 第 54 卷 第 17 期: 2508 ~ 2516
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《中国科学》杂志社
SCIENCE IN CHINA PRESS 论 文
引用格式: 周国安, 关荣霞, 李英慧, 等. 异源表达一个大豆 Na+/H+逆向转运蛋白基因 GmNHX2提高拟南芥的耐盐性. 科学通报, 2009, 54: 2508~2516
Zhou G A, Guan R X, Li Y H, et al. Molecular characterization of GmNHX2, a Na+/H+ antiporter gene homolog from soybean, and its heterologous expression
to improve salt tolerance in Arabidopsis. Chinese Sci Bull, 2009, 54: 3536―3545, doi: 10.1007/s11434-009-0564-x
异源表达一个大豆 Na+/H+逆向转运蛋白基因 GmNHX2
提高拟南芥的耐盐性
周国安, 关荣霞, 李英慧, 常汝镇, 邱丽娟*
中国农业科学院作物科学研究所, 农业部作物种质创新利用重点开放实验室, 北京 100081
* 联系人, E-mail: qiu_lijuan@263.net, qiu_lijuan@mail.caas.net.cn
2009-03-26收稿, 2009-06-30接受
国家自然科学基金(批准号: 30490251)、国家高技术研究发展计划(批准号: 2006AA10A110, 2006AA100104)、国家“十一五”科技支撑计划
(批准号: 2006BAD13B05)资助项目

摘要 Na+/H+逆向转运蛋白调节细胞内的离子内平衡, 在植物耐盐性起重要的作用. 本
研究克隆一个大豆Na+/H+逆向转运蛋白的同源基因GmNHX2, 编码一条长534氨基酸的
多肽并预测有 10个可能的跨膜结构域. GmNHX2在大豆的根、茎和叶中表达, 但在根中
的丰度最高, 受NaCl和 PEG (polyethylene glycol)处理的诱导表达. GmNHX2与LeNHX2
和 AtNHX2的序列相似性高于 AtNHX1和 AtSOS1. 尽管系统发育分析将 GmNHX2与
细胞器(液泡和囊泡)逆向转运蛋白聚成一类, 但亚细胞定位的结果表明 GmNHX2-EGFP
(enhanced green flurescent protein)融合蛋白可能位于植物细胞的质膜或细胞器膜上. 与
野生型植株相比, 异源表达 GmNHX2 的拟南芥植株在萌发和幼苗期都更加耐高浓度的
NaCl. 这些结果暗示, GmNHX2是一个 Na+/H+逆向转运蛋白同源物, 可能在盐胁迫下执
行调节离子内平衡的功能.
关键词
GmNHX2
Na+/H+逆向转运蛋白
耐盐性
大豆
离子内平衡


土壤中高浓度的盐分会对作物造成渗透胁迫和
离子毒害 , 从而影响作物的生长 , 严重导致作物减
产[1]. 植物细胞质内积累过度的 Na+会改变 K+/Na+比,
并影响植物细胞质内许多酶的活性. Na 不是一个植
物的必须元素, 但有许多基因都被证明调节 Na+吸收
的功能. 例如, 小麦高亲和性的 K+转运蛋白 HKT1被
证明是一个 Na+/K+共转运蛋白, 可能在生理毒害的
Na+浓度下介导 Na+吸收[2]. 相似地, 拟南芥 AtHKT1
通过调节高亲和性的 K+吸收和 Na+进入植物细胞而
在植物 K+营养和耐盐性中起重要的作用 [3]. 破坏
SOS3-1 突变体幼苗的 AtHKT1 基因能够抑制 SOS3-1
幼苗对 NaCl 的敏感性[4]. 此外, 小麦低亲和性的阳
离子转运蛋白 LCT1也可能介导 Na+吸收[5]. 植物 K+
外整流通道(K+ outward rectifying channels, KORCs)
和不依赖电压通道 (voltage independent chan- nels,
VICs)也被证明调节 Na+流入植物细胞[6].
目前, 植物中主要克隆了两类 Na+/H+逆向转运
蛋白, 其不同之处在于亚细胞定位和功能机制[6]. Shi
等人 [7]通过定位克隆克隆了一个拟南芥质膜 Na+/H+
逆向转运蛋白基因 SOS1. 随后的研究表明, SOS1 参
与将 Na+运输出细胞并控制 Na+从根部向地上部的长
距离运输, 过表达 SOS1 可以提高转基因拟南芥植株
的耐盐性 [8,9]. 系统发育分析表明 , 拟南芥质膜定位
的 AtNHX8 逆向转运蛋白与 SOS1 的亲缘关系较近,
被证明是一个可能的 Li+/H+逆向转运蛋白. AtNHX8
突变的拟南芥植株对 Li+超敏感, 但对其他的金属离
子不敏感, 如 Na+, K+和 Cs+[10].
另一类 Na+/H+逆向转运蛋白主要定位在细胞器




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论 文
膜上. 拟南芥 AtNHX1是第一个从高等植物中克隆的
液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白基因[11], 其功能是将 Na+
运入液泡区隔化以维持细胞质内正常的 Na+浓度[12].
水稻 OsNHX1 被证明在将细胞质中过度的 Na+和 K+
运输到液泡区隔化中起重要的作用[13]. AgNHX1是从
盐生植物滨藜(Atriplex grnelini)中克隆的 Na+/H+逆向
转运蛋白基因, 它能恢复酵母NHX1突变体的表型[14].
在多个物种中过表达液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白基
因的结果进一步证实了其在植物耐盐性中的重要作
用[12,15~19]. 一些研究表明, Na+/H+逆向转运蛋白还具
有其他的功能 , 如区隔化 K+和调节细胞内 pH 等 .
T-DNA 插入后的 AtNHX1 突变体液泡膜上, K+/H+和
Na+/H+转运蛋白活性降低 , 离子内平衡被破坏和叶
片发育不正常, 表明 AtNHX1 可能参与调节植物体
内的 K+的内平衡[20]. 此外, 番茄 LeNHX2 被证明通
过调节 K+的内平衡方式不仅在植物耐盐性中起作用,
而且在植物生长和发育中起重要作用[21].
大豆是最重要的油料作物之一 , 是中度耐盐的
植物[22]. 调节 Na+内平衡是高等植物适应盐胁迫的一
个重要的方式. 然而, 大豆关于调节离子平衡的基因
的报道很少, 尽管生理学的研究暗示 Cl−内平衡可能
是大豆耐盐性的主要机制[23]. 大豆 Na+/H+逆向转运
蛋白基因 GmNHX1 被报道能提高植物耐盐性[24]. 本
研究克隆了一个大豆 Na+/H+逆向转运蛋白的同源基
因 GmNHX2. GmNHX2受 NaCl和干旱胁迫诱导表达,
异源表达 GmNHX2 能提高拟南芥转基因植株的耐盐
性. 尽管 GmNHX2与细胞器 Na+/H+逆向转运蛋白具
有更高的序列相似性 , 但亚细胞定位的结果表明
GmNHX2 可能位于质膜或细胞器膜. 这些结果表明,
GmNHX2 可能编码一个 Na+/H+逆向转运蛋白的同源
物, 通过调节离子内平衡提高植物的耐盐性.
1 材料与方法
(ⅰ) 克隆 GmNHX2 基因. 为了提取 RNA 样品
用于基因克隆, 耐盐大豆品种文丰 7号生长在温度和
湿度分别为 24~28℃和 60%~80%的培养箱. 种子在
蛭石中萌发并长出第一片三出复叶后 , 幼苗用含有
200 mmol/L NaCl 的 Hoagland 营养液处理 6 h. 总
RNA用 Trizol试剂提取(Invitrogen), 2 μg总 RNA用
于 cDNA第一链合成(Promega).
以拟南芥 Na+/H+逆行转运蛋白 AtNHX1 (Gen-
Bank 登录号: AAD16946)作为检索序列搜索 TIGR
(The Institute for Genomic Research)中的 EST数据库
(http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/cgi-bin/tgi/Blast/in-
dex.cgi), 获得一条与 AtNHX1同源的、长 729 bp的
EST (TC233618). 根据此EST序列, 设计一对特异引物
(5′-CAGTTGTGTTGAGGGACACA-3′和 5′-GCACTCG-
ACAAAAGGTAGCC-3′), 用 RT-PCR 从上述盐诱导的
cDNA扩增该片段. 反应程序为: 94℃变性 5 min; 94℃
变性 1 min, 60℃退火 1 min, 72℃延伸 1.5 min, 35个循
环; 最后 72℃延伸 10 min. GmNHX2的全长 cDNA用
3′ RACE (rapid amplification of cDNA ends)方法获得.
3′ RACE cDNA根据 cDNA合成试剂盒(Promega)的说
明书进行, 但用接头引物(5′-GGATCCTAATACGACT-
CACTAGCTTTTTTTTTTTTTTT(A/G/C)-3′)替代 Oligo
(dT)16引物. 第一轮 PCR 反应体系为: 1×PCR Advan-
tage 2 缓冲液, 2 µL 3′ RACE cDNA, 0.2 mmol/L
dNTPs, 引物各 0.2 µmol/L, Advantage 2 Taq DNA聚
合酶 1 U(ClonTech). 第二轮 PCR 反应体系为: 以 1
µL第一轮 PCR产物作为模板, 其余同上. 3′ RACE的
基因特异性引物(GSP)为 N21 (5′-CCTCCGCCGCAA-
GAAGGTTTACA-3′); 第二轮 GSP为 N22 (5′-CAGG-
GCGTGGTTCAATTTTCACG-3′); 接头引物为 rac
(5′-GGATCCTAATACGACTCACTAGC-3′). 3′ RACE
产物克隆至 pMD18-T 载体 (TaKaRa)测序 . 根据
RT-PCR和 3′ RACE获得的序列, 设计一对特异引物
N2F (5′-CAGTTGTGTTGAGGGACACA-3′)和 N2R
(5′-GGCATGTATCAACTGCATGG-3′), 以 cDNA为模
板扩增 GmNHX2 全长的 cDNA 验证 RT-PCR 和 3′
RACE的结果. 随后, PCR产物克隆至 pMD18-T载体
(TaKaRa)后测序.
(ⅱ) GmNHX2-EGFP 融合蛋白的亚细胞定位.
用正向引物 5′-CAGGATCCGTCGACATGGTGACA-
AGGGCGAG-3′(含有BamHⅠ/SalⅠ酶切位点)和反向
引物 5′-CAGGAGCTCCTCGAGTCATCCGGACTTG-
TACAGCTC-3 ′ (含有 XhoⅠ /SacⅠ酶切位点 )从
pEGAD 质粒扩增 EGFP 基因, 将扩增的 EGFP 基因
亚克隆至植物表达载体 pBI121 的 BamHⅠ/SacⅠ位
点并替代 pBI121 载体中的 GUS 基因. 用正向引物
5′-GCCGGATCCATGGCCTCGGAATTAGAAATTTC-
3′ (含有 BamHⅠ酶切位点)和反向引物 5′-GCGGTC-
GACTGATGAATAGTGGTTCTGGC-3′ (含有 SalⅠ酶
切位点)从 cDNA中扩增 GmNHX2基因的 ORF, 然后
克隆至 pBI121-EGFP 载体 . 用电激法将重组质粒



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pBI121-GmNHX2-EGFP 转入农杆菌菌株 C58C1. 农
杆菌介导的拟南芥(Col 生态型)转化采用蘸花法 [25].
15 个独立的转基因株系用于观察融合蛋白的亚细胞
定位. 3 个独立的只表达 EGFP 基因的拟南芥转基因
株系作为对照. 用激光共聚焦显微镜(Bio-Rad 1024)
观察绿色荧光.
(ⅲ) 定量 Real-time PCR分析. 大豆品种文丰 7
号种子播于蛭石中萌发并生长 7 d后, 幼苗进行盐和
干旱胁迫处理. 盐处理, 幼苗浸泡在含有 200 mmol/L
NaCl的 Hoagland营养液中 6 h. 干旱处理, 幼苗浸泡
在含有 15% PEG 6000的 Hoagland营养液中 6 h. 收
获根、茎和叶提取 RNA. 2 μg总 RNA用于 cDNA第
一链合成 (Promega). 用于 Real-time PCR 分析的
GmNHX2 基因的引物为 RNHX2F (5′-CAACACCAT-
GTCTGGCAGAGATA-3′)和 RNHX2R (5′-TGTGTGA-
TTGTATGGTGAGATCCA-3′). 大豆 Actin 基因(Gen-
Bank 登录号: V00450)用作内参, 引物序列为 RA3F
(5′-CAGAGAAAGTGCCCAAATCATGT-3′)和 RA3R
(5′-TTGCATACAAGGAGAGAACAGCTT-3′). Real-time
RT-PCR反应使用 Power SYBR green PCR Master Mix
(Applied Biosystems), 在 Prism 7000定量荧光 PCR仪
上进行(Applied Biosystems). 每个反应重复 3次.
(ⅳ) 异源表达 GmNHX2拟南芥转基因植株的耐
盐性分析. 末端分别带有 BamHⅠ和 SacⅠ酶切位点
的 GmNHX2 ORF片段克隆至 pBI121的 BamHⅠ/SacⅠ
位点, 将 GmNHX2置于组成型的 CaMV 35S启动子
驱动下. pBI121-GmNHX2重组质粒用电击法转入农
杆菌菌株 C58C1. 农杆菌介导的拟南芥转化采用蘸
花法 [25]. T0 代转基因植株种子收获后在含有 50
mg/L卡那霉素的MS培养基上筛选[26], 共获得了 50
个独立的阳性转基因株系 . 通过逐代在含有 50
mg/L 卡那霉素的 MS 培养基上筛选获得 15 个纯合
的转基因株系.
转基因和对照植株种子点播于含有不同浓度
NaCl (0, 100, 150和 200 mmol/L)的 1/2 MS固体培养
基上进行萌发实验, 先在 4℃放置 3 d, 然后移入培养
室(光周期: 16 h光照/8 h黑暗; 温度: 23℃)萌发并生
长 8 d. 统计萌发并发育成绿色并展开的子叶的种子
数. 每一个值代表 80~100 种子的平均的萌发百分数.
对于植株存活率实验 , 转基因和对照植株种子播于
MS 培养基上生长 5 d, 然后幼苗转移至含有 200
mmol/L NaCl的MS固体培养基上培养 7 d. 具有 75%
绿色叶面积的幼苗计为存活.
2 结果
2.1 GmNHX2基因克隆和系统发育分析
本研究以拟南芥 Na+/H+逆向转运蛋白 AtNHX1
(GenBank登录号: AAD16946)氨基酸序列运用 tblastn
程序搜索 TIGR 中的 EST 数据库 , 查询到一个与
AtNHX1具有一定同源性的大豆 EST (TC233618). 序
列比较结果表明, TC233618 与已知的 Na+/H+逆向转
运蛋白基因同源, 且该 EST 是一条不完整的 cDNA.
根据该 EST, 设计了一对引物从盐诱导的大豆品种文
丰 7 号幼苗中扩增到该 EST 片段, 再用 3′ RACE 获
得了全长的 cDNA序列, 命名为 GmNHX2. GmNHX2
长 2152 bp, 可读框(ORF)为 1602 bp, 编码一条含 534
个氨基酸、理论分子量为 58 kD且等电点为 5.5的多
肽. 疏水性分析表明, GmNHX2是高度疏水性的, 并
含有 10 个可能的跨膜结构域(图 1). 前人研究表明,
氨氯吡咪结合基序 (163DVFFLFLLPPI173)抑制人
NHE1 逆向转运蛋白活性[27], 而 GmNHX2 中也存在
氨氯吡咪结合基序的共有序列(图 1(b)). GmNHX2与
拟南芥的 AtNHX6[28]和番茄 LeNHX2[29]分别具有
78.0%和 80.3%的序列一致性及 86.0%和 87.8%序列
相似性. 然而, GmNHX2与拟南芥的 AtNHX1[11], 大
豆的 GmNHX1[24]和水稻的 OsNHX1[30]分别仅具有
29.3%, 27.9%, 29.1%的序列一致性及 42.3%, 44.5%,
44.6%的序列相似性.
系统发育分析确定 GmNHX2与已知的 Na+/H+逆
向转运蛋白的关系(图 2). 聚类分析将 GmNHX2与已
知的 14 个相关基因分成 3 组, 第Ⅰ组又由 2 个亚组
组成. 第Ⅰ亚组的 3 个成员(AtNHX1, OsNHX1 和
GmNHX1)都为液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白, 其功能
主要是将 Na+运入液泡区隔化 [12,13,24]. GmNHX2 与
LeNHX2都属于第Ⅱ亚组, LeNHX2定位与细胞内的
小囊泡膜上将 K+区隔化 [21]. 第Ⅱ组由动物的质膜
Na+/H+逆向转运蛋白组成 , 这些成员介导 Na+的吸
收[31]. 在第Ⅲ组中, SOS1 是一个质膜 Na+/H+逆向转
运蛋白, 它控制植物 Na+长距离运输并将 Na+从细胞
质排到细胞外[7,8]. 绿脓杆菌 NhaP 和裂殖酵母 SOD2
都是 Na+/H+逆向转运蛋白, 负责将 Na+从细胞质排向
细胞外空间[32,33]. 这些结果暗示, GmNHX2可能与细
胞器 Na+/H+逆向转运蛋白具有更高的进化关系, 因
此可能定位在细胞器膜上.
2.2 大豆 GmNHX2基因的表达分析
用 Real-time-PCR 分析了非生物胁迫下 GmNHX2




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论 文

图 1 GmNHX2序列分析
(a) GmNHX2的疏水性图谱, 疏水性值由程序 TMPRED计算. (b) GmNHX2 与大豆 GmNHX1 (AAY43006)、番茄 LeNHX2 (CAC83608)
和拟南芥 AtNHX1 (AAD16946)、AtNHX6 (AAM08407)的序列比对分析. 序列比对用 ClustalX程序进行. 完全和部分保守的氨基酸分别
用黑色和灰色显示. TM1~10为预测的 10 个可能的跨膜结构域. *表示氨氯吡咪结合基序的共有序列

在大豆幼苗的不同组织中的表达水平 . 在非胁迫条
件下, 在大豆植株的根、茎和叶中检测到 GmNHX2
的 mRNA, 但 GmNHX2的 mRNA在根中的丰度高于
茎和叶(图 3). 在 200 mmol/L NaCl处理 6 h后, 茎和
叶中 GmNHX2的 mRNA丰度大约是未处理对照的 2
倍, 但在根中的表达水平只有微弱的增加(图 3(a)).
同样, 根、茎和叶中 GmNHX2也受 PEG处理的诱导
表达(图 3(b)). 这些结果表明, GmNHX2 应答离子和
渗透胁迫.
2.3 GmNHX2亚细胞定位
疏水性分析表明 GmNHX2含有 10个可能的跨膜
结构域, 暗示 GmNHX2 可能是一个膜蛋白. 为了确



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图 2 GmNHX2与其他代表性的 Na+/H+逆向转运蛋白进
化关系的系统发育分析
分别用 ClustalX, Mega4.1 程序进行多重序列比对和进化树的绘制.
进化距离的计算用 Neighbor-Joining 方法. 各物种的逆向转运蛋白的
GenBank 登录号为: 拟南芥 AtNHX1 (AAD16946)、AtNHX2
(AAM08403)、AtNHX6 (AAM08407)和 SOS1 (AAF76139); 水稻
OsNHX1 (BAA83337); 人 NHE1 (P19634)、NHE2 (AAD41635)和
NHE5 (AAC98696); 球蒴藓 PaSOS1 (CAD91921); 酵母 SOD2
(P36606); 番茄 LeNHX2 (CAC83608); 绿脓杆菌 NhaP (BAA31695);
褐家鼠 NHE4 (P26434)和大豆 GmNHX1 (AAY43006)


图 3 GmNHX2的表达分析
(a) GmNHX2 在大豆不同组织中都受 NaCl 胁迫正调节表达. (b)
GmNHX2在大豆不同组织中都受干旱胁迫正调节表达. 大豆Actin
基因作为内参. CK, 未处理的对照

定 GmNHX2 在细胞中的位置, 将 GmNHX2 与 EGFP
融合并在 CaMV 35S 启动子的驱动下在拟南芥中表
达 . 在激光共聚焦显微镜下观察转基因拟南芥植株
细胞的绿色荧光. 在表达 GmNHX2-EGFP 的转基因
植株幼根细胞表面观察到绿色荧光 , 而在只表达
EGFP的转基因植株幼根细胞的表面和细胞核中都观
察到绿色荧光(图 4). 这一结果表明, GmNHX2可能编
码一个膜蛋白, 并可能位于质膜和细胞器膜上.
2.4 异源表达 GmNHX2 提高拟南芥转基因植株的
耐盐性
为了检查 GmNHX2 在耐盐性中的作用 , 将
GmNHX2 的编码区亚克隆至 pBI121 载体且置于
CaMV 35S 启动子的驱动下, 并转化野生型拟南芥,
共获得了 50 个卡那霉素抗性的转基因株系. 选择 3
个纯合的转基因株系进行耐盐性鉴定. Real-time PCR
分析 GmNHX2 在这 3 个转基因株系和对照植株的表
达水平, 结果表明, GmNHX2的 mRNA在转基因株系
中积累, 但在对照植株中没有检测到(图 5(d)). 当 5
天龄幼苗生长在没有 NaCl 的 MS 培养基上, 转基因
和对照的表型没有差异(图 5(a)). 然而, 当 5 天龄幼
苗转移到含有 200 mmol/L NaCl的 MS培养基上生长
7 d后, 对照植株的生长受到抑制并逐渐白化死亡(图
5(b)), 只有 24.36%的对照植株存活并维持 75%的绿
色叶面积, 而 3 个异源表达 GmNHX2 基因的转基因
株系 L1, L4和 L6的存活率分别为 46.34%, 70.59%和
65.06%(图 5(c)).
为了确定异源表达 GmNHX2 基因能否提高转基
因植株在萌发期和幼苗早期的耐盐性, 将 3个转基因
株系和对照植株种子播于含有不同浓度的 NaCl 的
MS 培养基上进行耐盐性鉴定. 在不含 NaCl 的培养
基上 , 转基因植株的种子萌发率和萌发后生长与对
照植株没有明显的差异, 然而在 NaCl 胁迫下, 转基
因种子的萌发率明显高于对照(图 6(b)). 在含有 100
mmol/L NaCl的MS培养基上, 3个转基因株系 L1, L4
和 L6的萌发率分别为 93.74%, 93.80%和 95.93%, 高
于对照植株的 78.36%. 当 NaCl 的浓度增加到 150
mmol/L时, 对照种子的萌发率急剧的下降到 60.01%,
而 3个转基因株系 L1, L4和 L6种子的萌发率只有较
小程度的下降, 分别为 80.0%, 88.89%和 87.80%. 这
种趋势在 200 mmol/L NaCl处理后进一步加剧, 对照,
L1, L4和 L6的萌发率分别为 14.5%, 37.21%, 47.62%
和 46.04%. 在盐胁迫下, 转基因植株在萌发后比对
照植株生长的更快, 主根更长, 更大的子叶和更早出




2513
论 文

图 4 GmNHX2亚细胞定位分析
(a) EGFP蛋白在拟南芥转基因植株幼根细胞中的定位结果. (b) GmNHX2-EGFP蛋白在拟南芥转基因植株幼根细胞中的定位结果.
从左到右分别为在暗背景下细胞的绿色荧光和光背景下细胞的结构以及两者的组合


图 5 异源表达 GmNHX2转基因植株的耐盐性鉴定
5天龄转基因和对照的幼苗从正常的 MS培养基上转移至含有 0 (a)或 200 mmol/L NaCl (b) MS培养基上生长 7 d. (c) 转基因和对照
植株用 200 mmol/L NaCl处理 7 d后的存活率. (d) Real-time PCR 基因检测 3个转基因株系(L1, L4和 L6)和对照植株中 GmNHX2的
表达水平. 拟南芥 Actin基因作为内参

现真实的叶片(图 6(a)).
3 讨论
本研究分离了一个大豆 Na+/H+逆向转运蛋白基
因同源物 GmNHX2, 编码一个含有 10 个可能的跨膜
结构域(图 1). 到目前为止, 已报道的植物 Na+/H+逆
向转运蛋白都含有 10~12个跨膜结构域, 参与调节离
子内平衡. 系统发育分析表明, GmNHX2与植物细胞
器 Na+/H+逆向转运蛋白的亲缘关系更近, 而与植物
和动物的质膜 Na+/H+逆向转运蛋白的亲缘关系较远
(图 2). 细胞器 Na+/H+转运蛋白又进一步分为 2 个亚
组. GmNHX2与第Ⅱ亚组的成员 LeNHX2和AtNHX6
明显区分于第Ⅰ亚组的成员 AtNHX1, OsNHX1 和
GmNHX1. Yokoi 等人[28]克隆了 5个拟南芥 AtNHX1
的同源物 AtNHX2~6, 根据氨基酸序列的相似性将它
们分为 2个亚组(AtNHX1~4; AtNHX5 和 6). 序列分



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图 6 转基因植株的种子萌发实验
(a) 种子在含有 0, 100, 150和 200 mmol/L NaCl的MS培养基上萌发(从左至右). (b) 萌发并发育成绿色子叶的种子百分数. 在播种 8 d后计数

析也表明, GmNHX2 与 AtNHX6 和 LeNHX2 的序列
相似性高于AtNHX1, OsNHX1和GmNHX1. AtNHX1
和 OsNHX1 已经被证明是液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋
白 , 功能 为区 隔化 Na+[12,13]. 这 些结 果 暗 示 ,
GmNHX2 很可能是一个位于细胞器膜上的 Na+/H+逆
向转运蛋白, 可能在植物耐盐性中执行与 AtNHX1
和 OsNHX1不同的功能.
GmNHX2 基因在大豆各组织中都应答高盐和
干旱胁迫(图 3). 高盐处理能增加 GmNHX2 在大豆
根、茎和叶中的转录水平, 同样, PEG 处理能增加
GmNHX2在大豆根、茎和叶中的转录水平, 这可能表
明, GmNHX2是受离子胁迫和渗透胁迫诱导表达. 拟
南芥 AtNHX1 和 AtNHX2 基因在 Col-0 gl1 幼苗中的
表达受等渗的 NaCl 和山梨醇处理的诱导[28]. Li 等
人[24]的研究结果表明大豆 GmNHX1 基因也受 NaCl
和 PEG 处理诱导表达. NaCl 和 PEG 处理后, 根中
GmNHX2 的 mRNA 增加的水平低于茎和叶中增加的
水平, 且根中的的丰度在胁迫和非胁迫下都比茎和
叶中高, 这可能是由于 GmNHX2在根中的基础表达水
平更高所致. GmNHX2 的这种诱导表达模式与番茄的
LeNHX2 基因相似, 表明 GmNHX2 在根的耐盐性中可
能起组成型作用. 非生物胁迫下, NHX 基因在不同组
织的差异表达模式在其他物种也存在, 如拟南芥、水
稻和番茄. 番茄 LeNHX2 和拟南芥 AtNHX1 基因在叶
中受 NaCl正调节表达, 但在根中不受 NaCl正调节表
达[21,34]. 在不同浓度 NaCl处理下, 水稻 OSNHX1在地
上部中的表达水平都比根中高[13]. 此外, AgNHX1 在
叶的转录本在所有的胁迫处理条件下都比根中高[14].
目前的研究表明 , 系统发育树的第Ⅰ组的大部
分成员都定位于液泡膜或别的细胞器膜 . 异源表达
GmNHX2-EGFP 融合蛋白可能位于拟南芥细胞的质
膜或细胞器膜(图 4). 第Ⅰ亚组的成员定位于液泡膜,
而第Ⅱ亚组的成员 LeNHX2 被观察到位于细胞内的
小囊泡 , 明显与 AtNHX1 和 AtNHX2 质膜定位不
同[21], 而且也观察到别的非植物的 NHX 蛋白定位于
小囊泡[35]. 本研究结果表明 GmNHX2 可能定位与质
膜或细胞器膜. 由于缺少特异的抗体, 我们不能观察
内源的 GmNHX2 蛋白的定位. 尽管需要进一步的实
验确定 GmNHX2 是位于质膜还是细胞器膜, 本研究
结果暗示 GmNHX2 可能编码一个膜蛋白, 执行调节
离子平衡的功能.
液泡膜和质膜 Na+/H+逆向转运蛋白执行调节细
胞离子平衡的功能, 通过将 Na+排出细胞(如 AtSOS1)
或将 Na+运入液泡区隔化(如 AtNHX1)提高植物的耐




2515
论 文
盐性[7,12]. 尽管 Na不是植物的必需元素, 但在拟南芥
中有 40 多个基因属于 Na+/H+逆向转运蛋白家族, 暗
示 Na+/H+逆向转运蛋白基因可能有着不同的功能[36].
AtNHX1突变体的液泡K+/H+和Na+/H+转运蛋白活 性
降低 , 离子内平衡破坏和叶片发育不正常 , 表明
AtNHX1 可能参与调节植物体内的 K+的内平衡 [20].
番茄 LeNHX2调节 K+内平衡, 通过促进 K+积累在盐
胁迫中起着重要的作用 [21]. 由于大豆遗传转化非常
困难, 我们在拟南芥中表达 GmNHX2 以明确其在耐
盐性中的作用. 异源表达 GmNHX2 的转基因植株的
种子萌发率显著高于对照植株(图 6). 因为盐胁迫下
高萌发率并不总是与发育后期的耐盐性共相关[37~39],
我们测试了转基因植株在苗期的耐盐性. 结果如图 5
所示, 转基因植株幼苗在含有 200 mmol/L NaCl 的
MS 培养基上处理 7 d, 其存活率明显高于对照植株.
由于 GmNHX2 与细胞器 Na+/H+逆向转运蛋白具有更
高的序列相似性, 暗示 GmNHX2 可能定位与质膜或
细胞器膜, 可能通过调节离子平衡改善植物的耐盐
性. 拟南芥 AtNHX1具有 K+/H+和 Na+/H+转运蛋白活
性 , 番茄 LeNHX2 也被证明调节 k+平衡 , 而
GmNHX2 与 LeNHX2 具有高度的序列同源性暗示
GmNHX2可能是一个K+/H+和Na+/H+转运蛋白, 但需
要进一步实验去证明 GmNHX2 具有 K+/H+还是
Na+/H+转运蛋白活性.
致谢 感谢中国科学院遗传与发育生物学研究所陈受宜研究员为本研究提供宝贵的建议.
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