全 文 ：书乔松根特异启动子ＰｍＰｇＰＲ１０驱动Ｎａ＋／Ｈ＋逆转运蛋白提高
转基因水稻的耐盐性
武丽敏１　陈维１　赵艳２　冯尚国１　应奇才１　刘俊君３　王慧中１，＊
（１杭州师范大学 生物化学与分子生物学杭州市重点实验室，浙江 杭州３１００３６；２浙江工商大学 食品与生物工程学院，浙江 杭州
３１００１８；３加拿大自然资源部太平洋林业中心；＊通讯联系人，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｈｚ６２＠１６３．ｃｏｍ）
Ｓａｌｔ－ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｉｃｅ　ｗｉｔｈ　Ｎａ＋／Ｈ＋ Ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ　Ｇｅｎｅ
Ｄｒｉｖｅｎ　ｂｙ　Ｒｏｏｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＰｍＰｇＰＲ１０
ＷＵＬｉ－ｍｉｎ１，ＣＨＥＮ　Ｗｅｉ　１，ＺＨＡＯＹａｎ２，ＦＥＮＧＳｈａｎｇ－ｇｕｏ１，ＹＩＮＧＱｉ－ｃａｉ　１，ＬＩＵＪｕｎ－ｊｕｎ３，ＷＡＮＧ　Ｈｕｉ－ｚｈｏｎｇ１，＊
（１　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｈａｎｇｚｈｏｕ　Ｃｉｔｙ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１００３６，
Ｃｈｉｎａ；２　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｇｏｎｇｓｈａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１００３５，Ｃｈｉｎａ；３　Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｆｏｒｅｓｔ
Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｃｅｎｔｒｅ，５０６Ｗｅｓｔ　Ｂｕｒｎｓｉｄｅ　Ｒｄ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｖ８Ｚ１Ｍ５，Ｃａｎａｄａ；＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ，
Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｈｚ６２＠１６３．ｃｏｍ）
ＷＵ　Ｌｉｍｉｎ，ＣＨＥＮ　Ｗｅｉ，ＺＨＡＯ　Ｙａｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｓａｌｔ－ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｒｉｃｅ　ｗｉｔｈ　Ｎａ＋／Ｈ＋ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ
ｇｅｎｅ　ｄｒｉｖｅｎ　ｂｙ　ｒｏｏｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ＰｍＰｇＰＲ１０．Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｒｉｃｅ　Ｓｃｉ，２０１２，２６（６）：６４３－６５０．
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｌｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｒｉｃｅ　ｖａｒｉｅｔｉｅｓ，Ｎａ＋／Ｈ＋ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ
（ＴａＮＨＸ２）ａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　ｒｉｃｅ　ｄｒｉｖｅｎ　ｂｙ　ｒｏｏｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｏｆ　ＰＲ１０　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｐｉｎｕｓ　ｇｒｉｆｆｉｔｈｉｉ
（ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮＨＸ２），ｗｈｉｃｈ　ｈｏｌｄ　ｔｈｅ　ｃｌａｓｓｉｃａｌ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｆｅａｔｕｒｅｓ　ｌｉｋｅ　ＴＡＴＡ－ｂｏｘ　ｍｏｔｉｆ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＰＣＲ，
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ａｎｄ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅ　ｈａｄ　ｂｅｅｎ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｒｉｃｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ．Ｔｈｅ　ｓａｌｔ－
ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ａｓｓａｙ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓａｌｔ－ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮＨＸ２　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｒｉｃｅ　ｌｉｎｅｓ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ
ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｒｉｃｅ．Ｔｈｉｓ　ｒｅｓｕｌｔ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ
ＴａＮＨＸ２　ｇｅｎｅ　ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ａｎｄ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ＰｍＰｇＰＲ１０　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｗａｓ　ａｂｌｅ　ｔｏ　ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｔｈｅ　ｒｏｏｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴａＮＨＸ２．Ｔｏ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｓａｌｔ－ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｌｉｎｅｓ，ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｖ－ＡＴＰａｓｅ
ａｎｄ　Ｖ－ＰＰａｓｅ　ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｒ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮＨＸ２ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｌｉｎｅ　ｗａｓ　ａｔｔｒｉｂｕｔｅｄ　ｔｏ
ｔｈｅ　ｈｅａｌｔｈｙ　ｇｒｏｗｔｈ　ｓｔａｔｕｓ　ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｖ－ＡＴＰａｓｅ　ａｎｄ　Ｖ－ＰＰａｓｅ
ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｉｎｉｔｙ　ｓｔｒｅｓｓ　ｏｎｌｙ　ｉｎ　ｒｏｏｔ，ｎｏｔ　ｉｎ　ｌｅａｆ，ｆｕｒｔｈｅｒ　ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｒｏｏｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰｍＰｇＰＲ１０
ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｏｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ，ｗｅ　ｃｏｎｃｌｕｄｅ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ＰｍＰｇＰＲ１０　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｆｒｏｍ　Ｐｉｎｕｓ　ｇｒｉｆｆｉｔｈｉｉ　ｈａｓ　ｔｈｅ　ｓｔｒｏｎｇ
ａｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　ｅｎｈａｎｃｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｄｏｗｎ－ｓｔｒｅａｍＴａＮＨＸ２　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｒｉｃｅ　ｔｏ　ｒｅｓｉｓｔ　ｔｈｅ　ｓａｌｔ　ｄａｍａｇｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｐｒｏｍｏｔｅｒ；Ｐｉｎｕｓ　ｇｒｉｆｆｉｔｈｉｉ；Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．；Ｎａ＋／Ｈ＋ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ
武丽敏，陈维，赵艳，等．乔松根特异启动子ＰｍＰｇＰＲ１０驱动Ｎａ＋／Ｈ＋逆转运蛋白提高转基因水稻的耐盐性 ．中国
水稻科学，２０１２，２６（６）：６４３－６５０．
摘　要：为获得抗盐水稻，将小麦液泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因ＴａＮＨＸ２与乔松（Ｐｉｎｕｓ　ｇｒｉｆｆｉｔｈｉｉ）根诱导型特异表
达启动子ＰｍＰｇＰＲ１０融合（ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮＨＸ２）并转化水稻，以研究ＰｍＰｇＰＲ１０启动子对ＴａＮＨＸ２基因表达的影响
以及转基因植物的耐盐性。ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和实时ＰＣＲ试验结果表明，ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮＨＸ２基因已通过农杆菌介导法整
合进水稻基因组，而且外源基因已在受体细胞中正确表达。在盐胁迫处理时，转ＰｍＰｇＰＲ１０基因植株的耐盐性以及外源基
因的表达量显著高于对照植株，说明ＰｍＰｇＰＲ１０启动子可以调控ＴａＮＨＸ２基因在根中特异表达。为了进一步分析转基因
植株耐盐机理，比较了日本晴和转基因Ｔ３代植株中液泡腺苷三磷酸酶（Ｖ－ＡＴＰａｓｅ）和液泡焦磷酸酶（Ｖ－ＰＰａｓｅ）活性，发现转
ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮＨＸ２基因水稻的Ｖ－ＡＴＰａｓｅ和Ｖ－ＰＰａｓｅ酶活性显著高于非转基因对照，说明Ｖ－ＡＴＰａｓｅ和Ｖ－ＰＰａｓｅ活性
提高在转ＴａＮＨＸ２基因水稻耐盐性过程中发挥重要作用。在盐胁迫处理时，Ｖ－ＡＴＰａｓｅ和Ｖ－ＰＰａｓｅ活性只能在转基因植株
的根中但不能在叶片中被检测到，进一步说明ＰｍＰｇＰＲ１０启动子在根中特异性表达。因此，ＰｍＰｇＰＲ１０具有在根中增强下
游ＴａＮＨＸ２基因表达，并显著提高转基因植株耐盐性的能力。
关键词：启动子；乔松；水稻耐盐性；Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白
中图分类号：Ｑ９４３；Ｑ９４５．７８　　　　　　　　　　文献标识码：Ａ　　　 文章编号：１００１－７２１６（２０１２）０６－０６４３－０８
收稿日期：２０１２－０３－０５；修改稿收到日期：２０１２－０４－０９。
基金项目：国家转基因专项（２００９ＺＸ０８００１－０２２Ｂ，２００８ＺＸ０８１０－００３）；国家自然科学基金资助项目（３１１７０３４６，３０３７０１３２）；浙江省自然
科学基金资助项目（３０２０６１）。
３４６
中国水稻科学（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｒｉｃｅ　Ｓｃｉ），２０１２，２６（６）：６４３－６５０
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｉｃｅｓｃｉ．ｃｎ
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－７２１６．２０１２．０６．００２
　　土壤盐渍化是造成农作物产量下降的重要原因
之一，盐害造成植物离子失衡和渗透胁迫，并引发植
物的氧化伤害，使植物生长减缓甚至死亡［１］。盐害
破坏了胞内离子和渗透的平衡，胁迫信号先被膜上
的受体感知，然后在胞内转化，打开胁迫应答基因以
调节对环境胁迫的耐受力［２］。
为适应高盐环境，植物必须维持胞质内较低的
Ｎａ＋离子水平。植物消除Ｎａ＋毒害的策略包括降低
Ｎａ＋的吸收、Ｎａ＋的外排和 Ｎａ＋的区隔化。将 Ｎａ＋
区隔化入液泡，是植物降低胞质内Ｎａ＋水平的重要
途径，一方面减少Ｎａ＋在细胞质内对细胞器的毒害
作用，另一方面也降低了植物细胞的渗透势，有利于
植物在高盐低渗环境下吸收水分，维持植物的生
长［３］。
一些植物中重要质膜和液泡膜 Ｎａ＋／Ｈ＋ 逆向
转运蛋白基因相继被克隆［４］，为其在农业上应用提
供了可能性。在小麦中，过量表达来自拟南芥液泡
膜的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因ＡｔＮＨＸ１的转基
因株系，其叶中Ｎａ＋比非转基因株系累积少，而Ｋ＋
增多。在严重的盐胁迫下，转基因小麦植株长势、萌
发率明显优于非转基因对照［５］。在Ｎａ＋－ＡＴＰａｓｅ和
Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白缺陷型的啤酒酵母（Ｓａｃｃｈａ－
ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中过量表达水稻液泡膜 Ｎａ＋／
Ｈ＋逆向转运蛋白基因，发现水稻Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运
蛋白系统不仅能作用于 Ｎａ＋，也能对 Ｌｉ＋、Ｋ＋ 和
Ｒｂ＋起作用［６］。Ｚｈａｎｇ等［７］在玉米中过量表达拟南
芥液泡膜的Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因ＡｔＮＨＸ１，
得到了２２．８％的阳性植株。耐盐性鉴定得出其中几
个株系及它们后代的耐盐性都有提高，且一些株系
种子能够在０．８％～１．０％ＮａＣｌ溶液中发芽生长。
Ａｐｓｅ等［３］在拟南芥中过量表达来自液泡膜的Ｎａ＋／
Ｈ＋逆向转运蛋白基因ＡｔＮＨＸ１，发现转基因拟南
芥能在２００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ胁迫条件下生长、开花和
繁殖。Ｍａｓａｒｕ等［８］在水稻中过量表达来自滨藜
（Ａｔｒｉｐｌｅｘ　ｇｍｅｌｉｎｉ）液泡膜的 Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋
白基因ＡｇＮＨＸ１，发现转基因液泡膜 Ｎａ＋／Ｈ＋ 逆
向转运蛋白活性是非转基因植株的８倍，转基因水
稻能在３００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ下存活３ｄ。过量表达液
泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白对植物耐盐性起着非常
重要的作用，植物通过液泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋
白实现 Ｎａ＋ 区隔化入液泡，从而既维持胞质内低
Ｎａ＋浓度水平，减少其对细胞器的毒害，又降低了细
胞的渗透势，实现植物在胁迫环境下的较好生长。
根是植物与外界环境进行信息和物质交换的主
要器官，在环境胁迫下最先受到影响的器官也是根，
将根部特异启动子或逆境诱导特异启动子应用于耐
盐、抗旱基因工程中，使外源基因在根中特异表达具
有重要意义。近年来根特异性基因表达的研究日趋
迅速增加［９－１４］，ＰＲ１［１０，１５］、ＰＲ１０［１６］、ＯＣＳ－因子［１７］、
ＭＡＳ因子［１８］和 ＡＳ－１因子［１９］等先后被鉴别。Ｌｉｕ
等［１５］发现ＰＲ１０蛋白为一类受病原菌感染和其他环
境胁迫的诱导蛋白，并在转基因拟南芥中研究
ＰｍＰＲ１０－１．１３ 的转录调控，结果发现－１３１６至
－９３０区和－３０９至－１００区是伤害应答的必需元
件。Ｌｉｕ等［１６］从白松中分离和鉴定了ＰＲ１０基因和
ＰｍＰＲ１０－１．１４。将ＰｍＰＲ１０－１．１４基因启动子驱动
ＧＵＳ基因在烟草中表达，发现其１６７５ｂｐ启动子序
列在成熟植物根中高水平调控ＧＵＳ基因表达，但在
其他组织中仅有微弱表达，由此推断ＰｍＰＲ１０－１．１４
基因启动子在侧根生长和发育阶段组织特异性调控
基因表达。除在被子植物中报道了几个根特异性表
达的启动子之外［２０－２５］，根特异表达启动子在水稻上
的应用研究较少。
本研究从乔松（Ｐｉｎｕｓ　ｇｒｉｆｆｉｔｈｉｉ）中筛选克隆
得到ＰＲ１０基因启动子序列 （ＰｍＰｇＰＲ１０），发现其
具有盐诱导表达特性。将小麦抗盐基因 Ｎａ＋／Ｈ＋
逆向转运蛋白（ＴａＮＨＸ２）在ＰｍＰｇＰＲ１０启动子驱
动下进行水稻转基因研究以获得耐盐转基因水稻，
结果发现盐胁迫条件下，转 ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮ－
ＨＸ２基因水稻生长明显好于对照，并且转基因植株
的Ｖ－ＡＴＰａｓｅ和 Ｖ－ＰＰａｓｅ酶活性也显著提高。因
此，ＰｍＰｇＰＲ１０启动子是一个新的盐诱导型根特异
表达启动子。本研究结果将为通过基因工程方法培
育耐盐水稻奠定基础。
１　材料与方法
１．１　材料
１．１．１　植物材料
乔松（Ｐｉｎｕｓ　ｇｒｉｆｆｉｔｈｉｉ）种子由中国林业科学
院亚热带林业研究所（杭州）惠赠，水稻（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉ－
ｖａ　Ｌ．）品种日本晴（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）种子由中国水稻研
究所提供。克隆中间载体为ｐＭＤ－１８Ｔ，植物转化载
体为 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００，转 基 因 所 用 根 癌 农 杆 菌
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）为菌株ＥＨＡ１０５。
１．１．２　启动子、耐盐相关基因及标记基因
裸子植物乔松ＰＲ１０ 基因ＰｍＰｇＰＲ１０ 的启动
４４６ 中国水稻科学（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｒｉｃｅ　Ｓｃｉ）　第２６卷第６期（２０１２年１１月）
子序列参照白松ＰＲ１０基因［１６］。耐盐基因来自小麦
液泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白基因（ＴａＮＨＸ２）［２６］。
该基因由中国科学院遗传与发育生物学研究所和中
国科学院微生物研究所克隆，杭州师范大学参与了
部分研究工作。选择标记基因为新霉素磷酸基转移
酶Ⅱ基因（ｎｐｔⅡ）和潮霉素磷酸基转移酶基因（ｈｙ－
ｇｒｏｍｙｃｉｎ）。
１．２　方法
１．２．１　植物表达载体构建
根据白松启动子序列，设计引物ＰＲ１０－ＰＦ（５′－
ＡＡＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＴＧＧ－
３′）和ＰＲ１０－ＰＲ（５′－ＡＡＧＧＡＴＣＣＣＡＴＴＴＴＣＡＡＣＴ
ＣＴＣＴＣＧＣＡＡＣ－３′）用于扩增乔松 ＰＲ１０启动子。
引物 ＰＲ１０－ＰＦ 在基因５′－端引物引入 Ｈｉｎｄ Ⅲ，
ＰＲ１０－ＰＲ引物则在基因３′－端引入ＢａｍＨⅠ酶切位
点。扩增产物首先连接到中间载体ｐＭＤ－１８Ｔ进行
测序分析，将测序正确的质粒用 ＨｉｎｄⅢ／ＢａｍＨⅠ
酶切，然后将目的片段回收并插入到双元载体
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００，生成中间载体ｐＣＡＭ－ＰｍＰｇＰＲ１０。
根据ＴａＮＨＸ２基因序列，分别设计引物ＴａＮＨＸ２－
Ｆ（５′－ＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＡＴＡＣＣＡＡＧＴＧＧＴＧＧ
ＣＧＧＣＧＣＡＧＣＴ－３′）和ＴａＮＨＸ２－Ｒ（５′－ＧＧＴＡＣＣＣ
ＧＧＧＴＡＣＣＴＣＡＴＴＣＣＡＣＧＡＧＴＡＣＧＴＴＣＧＧ－３′）。
引物 ＴａＮＨＸ２－Ｆ 在基因 ５′－端引入 Ｂａｍ　ＨⅠ，
ＴａＮＨＸ２－Ｒ引物则在基因３′－端引入ＫｐｎⅠ酶切位
点。利用 ＴａＮＨＸ２－Ｆ和 ＴａＮＨＸ２－Ｒ进行ＰＣＲ扩
增，扩增产物经测序正确后用Ｂａｍ ＨⅠ／ＫｐｎⅠ双
酶切，然后将回收产物插入到中间载体 ｐＣＡＭ－
ＰｍＰｇＰＲ１０，构建成水稻转化载体１３００－ＰｍＰｇＰＲ１０
∷ＴａＮＨＸ２。随后将质粒通过电激转化法转至农
杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＥＨＡ１０５中，用
于水稻转化。
１．２．２　水稻的转化
取未成熟颖果，剥壳后在７５％乙醇中浸４ｍｉｎ，
用１０％ ＮａＣｌＯ消毒３０ｍｉｎ，再用无菌蒸馏水漂洗３
次，取幼胚接种到 ＭＳ＋２，４－Ｄ（２ｍｇ／Ｌ）的诱导培
养基。选择具有胚性结构的愈伤组织用于继代及分
化培养，分化培养基为 ＭＳ＋ ＫＴ （２．５ｍｇ／Ｌ）＋
ＮＡＡ（０．５ｍｇ／Ｌ）。
水稻转化采用愈伤组织侵染法［２７］。农杆菌生长
培养基（ＬＢ）成分：酵母提取物５ｇ／Ｌ，蛋白胨１０ｇ／
Ｌ，ＮａＣｌ　１０ｇ／Ｌ，醇脂１０ｇ／Ｌ，ｐＨ　７．２。常规灭菌
（１２１℃下２０ｍｉｎ）后加抽滤灭菌的潮霉素５０ｍｇ／Ｌ
及利福平５０ｍｇ／Ｌ。转化程序：取４ｄ龄的幼胚（继
代后的幼胚愈伤组织），原菌液稀释１５倍（１．５ｍＬ／
２０ｍＬ）或离心后稀释３倍，在无激素 ＭＳ培养液中
共培养２０ｍｉｎ，放置在带灭菌滤纸的培养皿上吸干
多余菌液，再将愈伤组织接种到含潮霉素的诱导培
养基进行抗性愈伤组织筛选。２１ｄ后将潮霉素抗性
愈伤组织块转入附加潮霉素的分化培养基上进行芽
分化试验，以筛选潮霉素抗性水稻植株。
１．２．３　转基因植株外源ＴａＮＨＸ２基因的ＰＣＲ检
测
水稻总 ＤＮＡ 按 ＣＴＡＢ法提取。根据 ＴａＮ－
ＨＸ２基因碱基序列［２６］，设计并合成两个ＰＣＲ引物，
琼脂糖凝胶电泳分析检测。
ＴａＮＨＸ２引物序列：正向引物：５′－ＡＴＧＧＧＡ
ＴＡＣＣＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＣＡＧＣＴ－３′；反 向 引
物：５′－ＣＧＧＧＴＡＣＣＴＣＡＴＴＣＣＡＣＧＡＧＴＡＣＧＴＴ
ＣＧＧ－３′。
１．２．４　转基因植株基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ鉴定
水稻基因组 ＤＮＡ 提取同上。选择ＴａＮＨＸ２
基因序列中没有酶切位点的ＥｃｏＲⅠ 酶切水稻基因
组ＤＮＡ。酶切体系为５０μＬ，包含基因组 ＤＮＡ
（２０μＬ，５μｇ）、ＥｃｏＲⅠ（５μＬ）、１０×缓冲液 （５μＬ），
ｄｄＨ２Ｏ补足至５０μＬ。探针的制备采用ＰＣＲ扩增
法，扩增引物分别为ＴａＮＨＸ２ＰＦ（５′－ＧＡＧＧＡＧＡ
ＡＣＣＧＣＴＧＧＣＴＣＡＡ－３′）和ＴａＮＨＸ２ＰＲ（５′－ＡＴＧ
ＴＧＧＣＡＴＣＧＴＴＣＡＣＡＡＣＡＣ－３′），探针长度为６００
ｂｐ。探针制备和杂交方法参照分子克隆［２８］进行。
１．２．５　外源ＴａＮＨＸ２基因的实时ＰＣＲ表达分析
为验证外源基因整合到水稻基因组后是否已经
表达，将生长至４叶期的幼苗转入１５０ｍ／Ｌ　ＮａＣｌ溶
液中进行盐处理，然后分别在０ｈ、１ｈ、３ｈ、６ｈ和
２４ｈ分别提取对照和转基因植株的ＲＮＡ并进行反
转录ＰＣＲ。总ＲＮＡ的提取参照Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司的
Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒手册进行，然后将提取后的总ＲＮＡ约
１μｇ用ＤＮａｓｅⅠ处理后，利用ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔⅢ 反转
录试剂盒（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）进一步生成ｃＤＮＡ。再
以生成的ｃＤＮＡ为模板，用ＴａＮＨＸ２ 基因特异引
物ＮＨＸ－ＲＬＦ（５′－ＴＴＧＡＧＡＡＧＴＧＧＡＡＡＴＴＴＧＣ
ＴＡＧＴＧＡ－３′）和ＮＨＸ－ＲＬＲ（５′－ＧＣＴＴＡＴＴＴＴＴＴ
ＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＴＴＣ－３′） 与 ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ
ＳｕｐｅｒＭｉｘＩ（ＢｉｏＲａｄ公司）反应液混合，反应体系为
１０μＬ，水稻Ａｃｔｉｎ基因作为内参。Ａｃｔｉｎ基因扩增
引物为ＡｃｔｉｎＦ（５′－ＣＴＴＣＡＴＡＧＧＡＡＴＧＧＡＡＧＣＴ
５４６武丽敏等：乔松根特异启动子ＰｍＰｇＰＲ１０驱动Ｎａ＋／Ｈ＋逆转运蛋白提高转基因水稻的耐盐性
ＧＣＧＧＧＴＡ－３′）和ＡｃｔｉｎＲ（５′－ＣＧＡＣＣＡＣＣＴＴＧＡＴ
ＣＴＴＣＡＴＧＣＴＧＣＴＡ－３′）。ＰＣＲ仪为ＣＦＸ９６Ｒｅａｌ－
ｔｉｍｅ系统（ＢｉｏＲＡＤ公司）。
１．２．６　转基因水稻盐胁迫处理
将生长至４叶期幼苗转入含０ｍｍｏｌ／Ｌ和１５０
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ的溶液中进行耐盐试验，观察盐胁迫
下植株的生长情况。每天用蒸馏水补足蒸发掉的水
分，使ＮａＣｌ浓度保持稳定。取盐胁迫后５ｄ的Ｔ３代
植株作为后续分析材料。将盐处理３０ｄ的转基因
水稻及对照进行拍照并统计存活率和测定根长。
１．２．７　Ｖ－ＡＴＰａｓｅ和Ｖ－ＰＰａｓｅ的水解活性检测
将４叶期的 Ｔ３代转基因水稻用１５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ处理３ｄ，取叶片和根进行 Ｖ－ＡＴＰａｓｅ和 Ｖ－
ＰＰａｓｅ活性分析。参照 Ｗａｎｇ等［２９］的方法略有修改
进行分析：首先分离液泡膜，在３７℃下，分别用１
ｍｍｏｌ／Ｌ钼酸钠、１ｍｍｏｌ／Ｌ叠氮钠和１ｍｍｏｌ／Ｌ钒
酸钠测定 Ｖ－ＡＴＰａｓｅ的活性；３７℃ 下，分别用 １
ｍｍｏｌ／Ｌ钼酸钠、１ｍｍｏｌ／Ｌ 叠氮钠、５０ｍｍｏｌ／Ｌ硝
酸钾和１ｍｍｏｌ／Ｌ钒酸钠测定Ｖ－ＰＰａｓｅ的活性。每
个株系６次重复。
２　结果与分析
２．１　启动子ＰｍＰｇＰＲ１０的克隆及转化载体１３００－
ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮＨＸ２的构建
根据白松 ＰＲ１０ 基因启动子序列设计引物
ＰＲ１０－ＰＦ和ＰＲ１０－ＰＲ并进行乔松ＰｍＰｇＰＲ１０启动
子扩增，得到一段长度约１．７ｋｂ　ＤＮＡ片段。该片
段大小与白松启动子相似，因而被分离纯化及进行
后续测序分析（图１－Ａ）。测序结果表明该片段共有
１６６４个碱基，具有典型的启动子驱动元件如ＴＡＴＡ
盒和ＣＡＡＴ盒（图１－Ｂ）。如果以转录起始密码子
ＡＴＧ的Ａ作为＋１碱基，则ＴＡＴＡ盒和ＣＡＡＴ盒
分别位于－１００和－２３９ｂｐ。此外该ＤＮＡ片段还
包含若干可能的顺式作用元件作为转录因子的结合
位点。这些鉴定出来的顺式作用元件包括ＤＯＦ和
ＧＡＭＹＢ等（表１）。因此，该乔松ＤＮＡ片段具有活
性启动子的相关结构特性，为白松ＰＲ１０基因启动
子的同源物。我们将位于 Ｔ载体上的乔松启动子
ＰｍＰｇＰＲ１０ 和ＴａＮＨＸ２ 基因顺序插入 ｐＣＡＭ－
ＢＩＡ１３００表达载体，并最终形成水稻转化载体１３００－
ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮＨＸ２（图１－Ｂ）。
２．２　转基因水稻的分子鉴定
将１３００－ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮＨＸ２载体通过农表
１　转１３００－ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮＨＸ２基因植株的存活率
Ｔａｂｌｅ　１．Ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔ　ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ａｔ　１５０
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ．
株系
Ｌｉｎｅ
种植总数
Ｔｏｔａｌ　ｔｅｓｔ
ｎｕｍｂｅｒ
存活个体数目
Ｓｕｒｖｉｖｅｄ
ｐｌａｎｔ　ｎｕｍｂｅｒ
百分比
Ｒａｔｉｏ
／％
株系３Ｌｉｎｅ　３　 ９０　 ５３　 ５８
日本晴 Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ　 ９５　 ０　 ０
杆菌介导转化水稻愈伤组织，转基因当代共获得１２
株转化苗。从转化材料中分别提取总 ＤＮＡ 并用
ＴａＮＨＸ２基因特异引物对转基因植株进行分子检
测。结果发现所有１２株再生苗均显示ＰＣＲ阳性
（图２）。
２．３　转基因植株的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ鉴定
为检测ＰＣＲ阳性的个体的外源ＴａＮＨＸ２基因
是否已整合到水稻基因组中以及外源基因的拷贝
数，我们提取了Ｔ３ 代植株总ＤＮＡ并进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
杂交分析。杂交结果显示，未转化株系没有杂交信
号，转化株系有阳性信号，而且每个株系的杂交带型
均不同（图３）。说明不同株系外源基因的插入位置
和拷贝数均不同，各株系为独立的插入事件。此外，
绝大多数株系只有一条杂交条带，说明本次转基因
以单拷贝整合为主。
２．４　ＰｍＰｇＰＲ１０启动子驱动ＴａＮＨＸ２基因在根中
特异表达
　　为进一步检测外源ＴａＮＨＸ２基因在宿主细胞
内的表达情况，将不同处理时间的转基因材料分别
从根、茎和叶中提取ＲＮＡ进行实时ＰＣＲ检测。定
量ＰＣＲ检测结果显示ＰｍＰｇＰＲ１０ 驱动的ＴａＮ－
ＨＸ２基因在转基因水稻根中特异表达（图４－Ａ），而
且基因表达随诱导时间延长而逐渐提高（图４－Ｂ）。
但不同株系间表达量略有不同，具体可分为３种类
型：强诱导、中度诱导和轻微诱导。从３种类型中分
别选出代表性的两个株系进行不同处理时间的诱导
表达研究，结果发现在处理２４ｈ后，株系１和２表达
量分别较处理前仅上升１．８倍和１．６倍，表现为轻
微诱导；而株系３和４在盐处理２４ｈ后，表达量分别
上调了６倍和５．１倍，表现为强诱导；株系５和６则
分别上调了３．４倍和３．２倍，表现为中等诱导（图４－
Ｂ）。这些结果进一步说明ＴａＮＨＸ２基因不仅已整
合到水稻基因组中而且能够正常转录表达。
２．５　Ｖ－ＡＴＰａｓｅ和Ｖ－ＰＰａｓｅ水解活性检测结果
根据转基因后代对于盐诱导后的基因上调表达
６４６ 中国水稻科学（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｒｉｃｅ　Ｓｃｉ）　第２６卷第６期（２０１２年１１月）
Ａ－乔松ＰＲ１０启动子扩增结果；Ｂ－水稻双元转化载体１３００－ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮＨＸ２；Ｃ－乔松根特异ＰＲ１０启动子序列及元件分析。ＴＡ－
ＴＡ盒、ＣＡＡＴ盒和顺反子序列分别标记为蓝色、橙色和紫色。
Ａ，Ｔｈｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ＰＲ１０　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｆｒｏｍＰ．ｇｒｉｆｆｉｔｈｉｉ　ＭｃＣｌｅｌ　ａｎｄ　ｂｙ　ＰＣＲ；Ｂ，Ｔｈｅ　ｂｉｎａｒｙ　ｖｅｃｔｏｒ　１３００－ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮＨＸ２；Ｃ，Ｔｈｅ　ｍｏｔｉｆ
ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＰｍＰｇＰＲ１０　ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｔｈｅ　ＴＡＴＡ－ｂｏｘ，ＣＡＡＴ－ｂｏｘ　ａｎｄ　ｃｉｓ－ｔｒａｎｓ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｂｌｕｅ，ｏｒａｎｇｅ　ａｎｄ　ｐｕｒｐｌｅ，ｒｅｓｐｅｃ－
ｔｉｖｅｌｙ．
图１　乔松ＰＲ１０基因启动子克隆及双元转化１３００－ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮＨＸ２ 载体
Ｆｉｇ．１．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ＰＲ１０　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｆｒｏｍＰｉｎｕｓ．ｇｒｉｆｆｉｔｈｉ　ａｎｄ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　１３００－ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮＨＸ２．
Ｍ－１ｋｂ　ＤＮＡ分子量标记；Ｐ－ｐＧＥＭ－Ｔ－ＴａＮＨＸ２质粒作为阳性对照；Ｎｉｐ－非转化对照植株日本晴；１～１２－转１３００－ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮ－
ＨＸ２基因不同植株。
Ｍ，１ｋｂ　ＤＮＡ　ｌａｄｄｅｒ；Ｐ，Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｐＧＥＭ－Ｔ－ＴａＮＨＸ２　ｐｌａｓｍｉｄ；Ｎｉｐ，Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｕｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ　ｐｌａｎｔ；１－１２，
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｐｌａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　１３００－ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮＨＸ２．
图２　转１３００－ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮＨＸ２基因植株ＰＣＲ检测
Ｆｉｇ．２．ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＴａＮＨＸ２　ｇｅｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒｓ．
量差异，我们选择２４ｈ处理后最大上调表达的株系
３进行根部和叶片的Ｖ－ＡＴＰａｓｅ和Ｖ－ＰＰａｓｅ水解活
性检测。结果发现，盐胁迫下转基因水稻根部两种
酶活性均有不同程度的提高。表明ＰｍＰｇＰＲ１０启
动子在根部驱动ＴａＮＨＸ２ 表达的效果非常明显。
与未转基因对照相比，Ｖ－ＡＴＰａｓｅ和 Ｖ－ＰＰａｓｅ活性
分别提高了２．４倍和１．８倍（图５－Ａ）。但在幼叶
中，Ｖ－ＰＰａｓｅ和 Ｖ－ＡＴＰａｓｅ活性在转基因水稻和非
转基因对照差异不明显（图５－Ｂ）。
７４６武丽敏等：乔松根特异启动子ＰｍＰｇＰＲ１０驱动Ｎａ＋／Ｈ＋逆转运蛋白提高转基因水稻的耐盐性
Ｐ－质粒ｐＧＥＭ－Ｔ－ＴａＮＨＸ２作为阳性对照；Ｎ－非转基因日本晴植
株作为阴性对照；１～１２－１３００－ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮＨＸ２ 转基因植
株。
Ｐ，Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｐＧＥＭ－Ｔ－ＴａＮＨＸ２　ｐｌａｓｍｉｄ；Ｎ，Ｎｅｇａｔｉｖｅ
ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ　ｒｉｃｅ　ｐｌａｎｔ；１－１２，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｌｉｎｅｓ
ｃａｒｒｙｉｎｇ　ｏｆ　１３００－ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮＨＸ２．
图３　转１３００－ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮＨＸ２植株的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ结果
Ｆｉｇ．３．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｉｎ　Ｔ３ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．
Ａ－ＴａＮＨＸ２基因在根中特异表达；Ｂ－ＴａＮＨＸ２ 基因表达量随
盐处理时间延长而提高。１－６分别代表转１３００－ＰｍＰｇＰＲ１０∷
ＴａＮＨＸ２基因的水稻株系。
Ａ，Ｒｏｏｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴａＮＨＸ２　ｇｅｎｅ．Ｂ，Ｔｈｅ　ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅａｌ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴａＮＨＸ２　ｇｅｎｅ　ｗｉｔｈ　ｐｒｏｌｏｎｇｉｎｇ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ．１－６，Ｒｅ－
ｐｒｅｓｅｎｔ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｒｉｃｅ　ｐｌａｎｔｓ　ｏｆ　１３００－ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮＨＸ２．
图４　ＰｍＰｇ启动子驱动ＴａＮＨＸ２基因在水稻根中特异表达
Ｆｉｇ．４．Ｒｏｏｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴａＮＨＸ２　ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｔ３ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｐｌａｎｔｓ　ｕｎｄｅｒ　ｓａｌｔ　ｓｔｒｅｓｓ．
Ｎｉｐ－非转基因株系；ＰｍＰｇＰＲ１０－转１３００－ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮ－
ＨＸ２株系。
Ｎｉｐ， Ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ　ｒｉｃｅ　ｌｉｎｅ； ＰｍＰｇＰＲ１０，
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｒｉｃｅ　ｌｉｎｅ　ｗｉｔｈ　１３００－ＰｍＰｇＰＲ１０∷ＴａＮＨＸ２．
图５　Ｖ－ＡＴＰａｓｅ和Ｖ－ＰＰａｓｅ的水解活性检测结果
Ｆｉｇ．５．Ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｖ－ＡＴＰａｓｅ　ａｎｄ　Ｖ－ＰＰａｓｅ　ｉｎ　Ｔ３ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｒｉｃｅ　ｐｌａｎｔ（ｒｏｏｔｓ　ａｎｄ　ｌｅａｆ）ｅｘｐｏｓｅｄ　ｔｏ　１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ　ｆｏｒ　３
ｄａｙｓ．
Ａ－处理前。Ｂ－１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ处理３０ｄ。
Ａ，ＣＫ；Ｂ，Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｌｉｎｅｓ　３ｅｘｐｏｓｅｄ　ｔｏ　１５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ　ｆｏｒ　３０ｄａｙｓ．
图６　转基因水稻的耐盐性试验
Ｆｉｇ．６．Ｓａｌｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｒｉｃｅ　ｐｌａｎｔｓ．
２．６　转基因植株在不同盐胁迫条件下的生长情况
在４叶龄期，将盐胁迫条件下强诱导表达的株
系３的幼苗放在含１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ的培养盒中
进行盐处理，观察盐胁迫下植株的生长情况。盐处
理前，转基因植株的长势与对照基本一致（图６－Ａ）。
然而当幼苗在１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ溶液处理７ｄ后，
对照叶片便开始变黄，两周后整个植株开始发黄，３０
ｄ后则基本死亡（图６－Ｂ）。而转基因植株的生长虽
然受到一定影响，但是３０ｄ后有５８％的株系存活
（表１），且其叶片仍呈绿色（图６－Ｂ）。
３　讨论
通过基因工程途径培育耐盐转基因水稻已经成
８４６ 中国水稻科学（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｒｉｃｅ　Ｓｃｉ）　第２６卷第６期（２０１２年１１月）
为热点，目前已有多个耐盐相关基因的被克隆并用
于水稻转基因研究，如脯氨酸合成基因Ｐ５ＣＳ［３０］、甜
菜碱脱氢酶基因ＢＡＤＨ［３１－３２］、山梨醇脱氢酶基因
ｇｕｔＤ ［３３］、甘露醇脱氢酶基因ｍｔｌＤ［３４］等。最近，从
拟南芥中分离到的 Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白 ＮＨＸ１
及其水稻同源基因显示出良好的耐盐效果［３５－３８］。拟
南芥共有６个Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白，分为两个亚
家族［３９］。亚家族１包含 ＮＨＸ１－ＮＨＸ４四个成员，
其中ＮＨＸ１的耐盐功能及ＮＨＸ２影响细胞伸长的
功能已有报道［４０］。亚家族２包含２个成员 ＮＨＸ５
和ＮＨＸ６，最近 ＮＨＸ５和 ＮＨＸ６在发育和盐敏感
性方面的研究也已有报道［４１］。虽然 ＮＨＸ２ 与
ＮＨＸ１相比，均含有相似的跨膜保守结构域，然而
ＮＨＸ２在水稻中的耐盐性不详。目前水稻耐盐机
理研究多采用组成型启动子如 Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ或 Ａｃｔｉｎ
驱动，而植物的根在吸收土壤营养和保护地上部免
受生物和非生物胁迫过程中发挥重要作用，因而分
离根特异的盐诱导表达启动子以提高植物耐盐性显
得尤为重要。白松ＰＲ１０基因已经被证明在根中特
异表达，并且受低温等胁迫条件诱导，因而ＰＲ１０基
因启动子具有极高潜能提高水稻耐盐性。然而
ＰＲ１０基因启动子驱动的下游基因提高水稻耐盐性
研究一直未见报道。本研究从裸子植物乔松中克隆
了ＰＲ１０基因的启动子序列（ＰｍＰｇＰＲ１０）及小麦
Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转运蛋白ＮＨＸ２，并将ＰｍＰｇＰＲ１０启
动子驱动的 ＮＨＸ２ 基因转化水稻，进行水稻盐胁
迫适应研究。
通过农杆菌介导转化法，我们共获得了１２个
ＴａＮＨＸ２ 基因独立转化体。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔ杂
交，我们发现外源基因已整合到水稻基因组中，并且
在转基因后代中可稳定遗传（图３）。然而，在１５０
ｍｍｏｌ／Ｌ盐胁迫处理条件下，我们发现不同株系外
源基因表达有明显差异。其中，株系１～４均是单拷
贝插入事件，而株系３和４的盐诱导能力比株系１
和２显著提高（图４）。说明株系间基因表达差异可
能与拷贝数无关，而与外源基因的插入位置相关。
外源基因的染色体位置效应已被广泛研究，旁侧序
列及结构是影响外源基因表达的重要因素［４０］。此
外，在盐胁迫条件下，ＴａＮＨＸ２基因在水稻根部特
异表达且随着盐处理时间延长基因表达量显著提
升，且其抗盐能力也明显增强，表明乔松ＰＲ１０启动
子在水稻中具有感受盐信号并驱动下游基因表达的
能力。体外 Ｖ－ＡＴＰａｓｅ和 Ｖ－ＰＰａｓｅ酶活性检测结
果表明：盐胁迫提高了转ＰｍＰｇ－ＴａＮＨＸ２ 基因水
稻植株的 Ｖ－ＡＴＰａｓｅ和 Ｖ－ＰＰａｓｅ酶活性。我们推
测，转基因植株耐盐能力提高可能是由于 Ｖ－
ＡＴＰａｓｅ和Ｖ－ＰＰａｓｅ酶活性的激活，为ＴａＮＨＸ２提
供了足够多的离子电化学梯度，使 ＴａＮＨＸ２把
Ｎａ＋从胞质内区隔化到液泡中的能力增强。此外，
启动 子 序 列 的 生 物 信 息 学 分 析 结 果 表 明，
ＰｍＰｇＰＲ１０启动子含有多个可能的转录因子结合
位点，推测它们在接受盐离子等外源生物和非生物
胁迫过程中发挥重要作用。因而随后的启动子深度
分析 实 验 （构 建 缺 失 不 同 转 录 结 合 位 点 的
ＰｍＰｇＰＲ１０启动子驱动Ｇｕｓ报告基因表达实验），
将会加深我们了解ＰｍＰｇＰＲ１０启动子接收盐信号
的分子机制，也将为利用ＰｍＰｇ启动子驱动下游基
因表达培育耐盐水稻品种打下坚实基础。
参考文献：
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ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　ｒｉｃｅ．ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ，２００２，５３２（３）：２７９－２８２．
［９］　Ｈｏｎｇ　Ｊ　Ｋ，Ｌｅｅ　Ｓ　Ｃ，Ｈｗａｎｇ　Ｂ　Ｋ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｅｐｐｅｒ　ｂａｓｉｃ
ＰＲ－１ｇｅｎｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｄｕｒｉｎｇ　ｄｅｆｅｎｓｅ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｔｏ　ｐａｔｈｏｇｅｎ，
ａｂｉｏｔｉｃ　ａｎｄ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ．Ｇｅｎｅ，２００５，３５６：１６９－
１８０．
［１０］Ｊｕｎｇ　Ｈ　Ｗ，Ｋｉｍ　Ｋ　Ｄ，Ｈｗａｎｇ　Ｂ　Ｋ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐａｔｈｏｇｅｎ－
ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｏｆ　ａ　ｐｅｐｐｅｒ　ｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ
ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ（ＣＡＬＴＰＩ）ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ
ＣＡＬＴＰＩ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ａｎｄ
９４６武丽敏等：乔松根特异启动子ＰｍＰｇＰＲ１０驱动Ｎａ＋／Ｈ＋逆转运蛋白提高转基因水稻的耐盐性
ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ．Ｐｌａｎｔａ，２００５，２２１：３６１－３７３．
［１１］Ｆｅｓｔｅｒ　Ｔ，Ｓｃｈｍｉｄｔ　Ｄ，Ｌｏｈｓｅ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ
ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｉｎ　Ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ　ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ　ｒｏｏｔｓ．Ｐｌａｎ－
ｔａ，２００２，２１６（１）：１４８－１５４．
［１２］Ｂｕｚｅｌｉ　Ｒ　Ａ， Ｃａｓｃａｒｄｏ　Ｊ　Ｃ， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ　Ｌ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ－
ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＢｉＰ　ｇｅｎｅｓ：Ａ　ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｄｏｍａｉｎ
ｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ＢｉＰ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ　ｍｅｒｉｓｔｅｍｓ．Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，２００２，５０：７５７－７７１．
［１３］Ｇｏｌｏｐ　Ｒ，Ｅｖｅｎ　Ｓ，Ｖｉｏｌｅｔａ　Ｃ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｒａｐｅ
ｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ
ｒｅｇｉｏｎ．Ｊ　Ｅｘｐ　Ｂｏｔ，２００２，５３（３７３）：１３９７－１４０９．
［１４］Ｒｏｂｅｒｔ　Ｈ， Ｍｅｎｄｅｌ　Ｒ　Ｒ， Ｃｅｒｆｆｒ　Ｕ，ｅｔ　ａｌ．Ｌｉｇｈｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ａｎａｅｒｏｂｉｃ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｉｚｅ　ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ　３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　４（ＧａｐＣ４）ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ
ａｎｄ　Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ．Ａｎｎ　Ｂｏｔ，２００３，９１：１４９－１５４．
［１５］Ｌｉｕ　Ｊ　Ｊ，Ｅｋｒａｍｏｄｄｏｕｌａｈ　Ａ　Ｋ　Ｍ，Ｐｉｇｇｏｔｔ　Ｎ　ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ｐａｔｈｏｇｅｎ／ｗｏｕｎｄ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ＰＲ１０ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｆｒｏｍ
Ｐｉｎｕｓ　ｍｏｎｔｉｃｏｌａ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔａ，２００５，２２１：１５９－１６９．
［１６］Ｌｉｕ　Ｊ　Ｊ，Ｅｋｒａｍｏｄｄｏｕｌａｈ　Ａ　Ｋ　Ｍ．Ｒｏｏｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ
ｗｅｓｔｅｒｎ　ｗｈｉｔｅ　ｐｉｎｅ　ＰＲ１０　ｇｅｎｅ　ｉｓ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，
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０５６ 中国水稻科学（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｒｉｃｅ　Ｓｃｉ）　第２６卷第６期（２０１２年１１月）