全 文 ：第３１卷第４期
２０１３年８月
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版）
ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＳＨＡＮＧＨＡＩ　ＪＩＡＯＴＯＮＧ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ）
Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．４
　Ａｕｇ．２０１３
文章编号：１６７１－９９６４（２０１３）０４－００６４－０６　 ＤＯＩ：１０．３９６９／Ｊ．ＩＳＳＮ．１６７１－９９６４．２０１３．０４．０１２
收稿日期：２０１２－１２－０６
基金项目：国家自然科学基金项目（３０９００９９２）资助；农业部公益性行业（农业）科研专项（２００９０３０５６）
作者简介：张玉婷（１９８７－）女，硕士生，研究方向：观赏植物逆境生理，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｙｕｔｉｎｇ＠ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ；
杜红梅（１９７４－）为本文通讯作者，女，博士，副教授，研究方向：植物逆境生理，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｍｄｕ＠ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
水解方法对草地早熟禾非极性化合物分离的影响
张玉婷１，俞文娟２，杜红梅１
（１．上海交通大学 农业与生物学院，上海２００２４０；２．上海交通大学 分析测试中心，上海２００２４０）
摘　要：非极性代谢产物的分离和含量分析是植物代谢组学的重要组成部分。在非极性代谢产物
的分离过程中，样品提取方法对于化合物的分离种类和分离量具有十分重要的影响。本文以草地
早熟禾品种‘午夜’的叶片为材料，采用甲醇－氯仿提取法将非极性代谢产物从叶片中分离出来，然
后再采用酸或碱水解法进行水解和甲酯化反应。经过酸水解后３０种化合物被分离出来，采用碱水
解的方法后，３６种化合物被分离出来。而且采用碱水解后，大部分化合物的分离量显著高于酸水
解。这种甲醇－氯仿提取结合碱水解的方法可以作为简单、高效的禾本科植物样品非极性化合物气
相色谱－质谱前处理方法。
关键词：草地早熟禾；气相色谱－质谱；脂肪酸；碱水解；酸水解
中图分类号：Ｓ６８８．４　　　　文献标识码：Ａ
Ｅｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｎ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ
Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｉｎ　Ｋｅｎｔｕｃｋｙ　Ｂｌｕｅｇｒａｓｓ
ＺＨＡＮＧ　Ｙｕ－ｔｉｎｇ１，ＹＵ　Ｗｅｎ－ｊｕａｎ２，ＤＵ　Ｈｏｎｇ－ｍｅｉ１
（１．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２４０，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２４０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ａｒｅ　ｍａｊｏｒ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ
ｍｅｔａｂｏｌｉｃｓ．Ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｐｌａｙ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅｓ
ｔｏ　ｔｈｅ　ｋｉｎｄｓ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｍｅｔｈａｎｏｌ－
ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｒｏｍ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ｋｅｎｔｕｃｋｙ　ｂｌｕｅｇｒａｓｓ（Ｐｏａ　ｐｒａｔｅｎｓｉｓ ‘Ｍｉｄｎｉｇｈｔ’）ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ
ａｎｄ　ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｉｄ　ｏｒ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｃａｔａｌｙｓｉｓ．Ａｆｔｅｒ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ａｃｉｄ　ａｎｄ
ａｌｋａｌｉｎｅ，３０ａｎｄ　３６ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｍｏｓｔ　ｏｆ
ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｂｙ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｂｙ　ａｃｉｄ　ｃａｔａｌｙｚｅｄ
ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｃａｎ　ａｌｓｏ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ
ａ　ｓｉｍｐｌｅ，ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｇｒａｓｓ　ｆａｍｉｌｙ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ　ｏｆ
ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｗｉｔｈ　ｇａｓ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｋｅｎｔｕｃｋｙ　ｂｌｕｅｇｒａｓｓ；ｇａｓ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ；ａｌｋａｌｉｎｅ　ｃａｔａｌｙｚｅｄ
ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ；ａｃｉｄ　ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
　　植物体的代谢产物根据极性的不同，可分为极 性代谢产物和非极性代谢产物２类［１］。非极性化合
第４期 张玉婷，等：水解方法对草地早熟禾非极性化合物分离的影响
物在植物的形态组成以及新陈代谢方面发挥着重要
作用。植物体内的非极性代谢产物主要由脂类和甾
醇等化合物组成［２－３］。膜脂是植物细胞的重要组成
成分，膜脂中脂肪酸的成分及含量直接影响膜的流
动性，进而影响整个细胞及植物组织的生理功能［４］。
植物甾醇在植物抵抗病毒、干旱、寒冷及高温等生物
与非生物胁迫中发挥重要作用［５－７］。植物非极性化
合物成分分析，对于生物膜结构与功能的研究具有
十分重要的意义，同时可以为植物抗逆机理研究、植
物分类和品种资源利用等提供重要的理论依据。植
物非极性化合物的含量分析一般采用气相色谱－质
谱分析（ｇａｓ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，简
称ＧＣ－ＭＳ）法［２，８－９］。植物细胞内的脂肪酸极少以游
离形式存在，多以甘油三酯、糖脂和磷脂的形式存
在，这些化合物沸点高，不易挥发和汽化。因此，与
其他非极性化合物的分离方法不同的是，需要先将
这些结合态的脂类化合物水解为脂肪酸和甘油，再
使脂肪酸与甲醇反应生成相应的脂肪酸甲酯，从而
降低汽化温度、提高分离效果［１０，１３］。
常用的水解方法包括碱水解和酸水解［１０－１３］。
不同的水解方法对脂肪酸的影响不同，在水解及转
甲酯化的过程中会生成不完全甲酯的衍生化，也可
能会产生脂肪酸的异构化、氧化或者水解等反
应［１４］。而有关酸水解和碱水解对植物非极性化合
物分离影响的研究未见报道。本文采用甲醇提取法
提取 草 地 早 熟 禾 品 种 ‘午 夜’（Ｐｏａ　ｐｒａｔｅｎｓｉｓ
‘Ｍｉｄｎｉｇｈｔ’）叶片中的极性和非极性代谢产物，并采
用氯仿为溶剂，将非极性代谢产物分离出来，然后采
用酸或碱水解的方法进行水解，并采用 ＧＣ－ＭＳ方
法分离鉴定各种代谢产物。通过分析不同水解方法
分离的化合物种类和化合物的相对含量，来筛选适
合草地早熟禾非极性化合物提取的方法。并为其他
禾本科植物非极性化合物的提取和鉴定，以及相关
植物代谢组学的研究提供一种有效方法。
１　材料与方法
１．１　实验材料
２０１１年１１月上旬将‘午夜’的种子播种与高１８
ｃｍ、直径２０ｃｍ的塑料盆中，基质为体积比为１∶１
河沙和园土的混合物，播种量１５ｇ／ｍ２。种子萌发
后，置于上海交通大学农业与生物学院农业工程训
练中心的温室中生长６０ｄ，温室的温度控制设定为
２８℃／１５ ℃ （昼温／夜温），相对湿度为 ６０％ ～
８０％。然后放入人工气候箱（ＨＰ　１５００ＧＳ－Ｂ）中，控
制温度２０℃／１５℃，相对湿度７０％～８０％，光照强
度５１０μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ），光周期１４ｈ。草种生长过程
中每周修剪２次，修剪高度为５～６ｃｍ，浇水２次，
施用Ｎ∶Ｐ∶Ｋ＝１５∶６．５∶８．３的复合肥１次。
１．２　实验方法
１．２．１　非极性化合物的提取
取充分伸展的叶片１００ｍｇ，用锡箔纸包裹，液
氮快速冷冻后，置于－８０℃冰箱内保存待用。
非极性化合物提取参照 Ｌｙｔｏｖｃｈｅｎｋｏ等的方
法，并稍做修改［２］。将冰冻的叶片在液氮中充分研
磨后，加入１．４ｍＬ　８０％甲醇，混匀后转入１０ｍＬ离
心管中，并加入５０μＬ　２ｍｇ／ｍＬ十九碳酸甲酯的氯
仿溶液作为内标。充分震荡，混匀后在７０℃水浴中
加热提取１５ｍｉｎ。１２　０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ后将
上清液转移至玻璃离心管中，加入１．４ｍＬ　Ｈ２Ｏ和
０．７５ｍＬ氯仿。混匀后，４　０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。
弃去上层液体。
１．２．２　衍生化反应
在硅烷化之前，采用碱水解和酸水解的方法对
样品中脂肪酸进行转甲酯化反应。
酸水解：在氯仿相中加入９００μＬ氯仿与１ｍＬ
３％ Ｈ２ＳＯ４甲醇溶液（Ｖ／Ｖ），在１００℃水浴中加热
４ｈ。
碱水解：在氯仿相中加入９００μＬ氯仿与１ｍＬ
０．４ｍｏｌ／Ｌ　ＫＯＨ甲醇溶液，室温下，２００ｒ／ｍｉｎ振荡
水解０．５ｈ。
酸水解和碱水解结束后，离心管中均加入４ｍＬ
Ｈ２Ｏ，充分震荡，４　０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃去上层
水相。重复操作２次。取１．５ｍＬ非极性提取液，
分次加入１．５ｍＬ高效液相的上样瓶中，置于浓缩
仪中浓缩、干燥。
将干燥的样品用８０μＬ氯仿重新溶解，并加入
４０μＬ吡啶和４０μＬ　ＢＳＴＦＡ（含１％的ＴＭＣＳ）。将
样品瓶密封后，混匀，７０℃硅烷化６０ｍｉｎ。
１．２．３　ＧＣ－ＭＳ分析
ＧＣ－ＭＳ方法根据 Ｑｉｕ等［１５］的方法并稍加修
改。硅烷化后的样品用美国安捷伦公司７８９０－
５９７５型气相色谱－质谱联用仪进行分析。色谱柱
为ＤＢ－５ＭＳ（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）。不分流
进样，进样量１μＬ。ＧＣ进样口温度２６０℃，稳定５
ｍｉｎ。色谱柱起始温度８０℃，样品注入２ｍｉｎ后色
谱柱温度以５℃／ｍｉｎ的速度上升到２８０℃。离子
源温度２００℃。载气为氦气，载气流速１ｍＬ／ｍｉｎ。
５６
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版） 第３１卷
溶剂延时３ｍｉｎ，电子碰撞电离电压７０ｅＶ，采用全
扫描方式进行检测，扫描质量数（ｍ／ｚ）范围为
３０～５５０。
ＧＣ－ＭＳ分析得到的总离子流色谱图，采用安捷
伦公司 ＮＩＳＴ　２０１１谱库进行检索。使用十九碳酸
甲酯（Ｃ１９：０）作为内标，计算代谢产物的相对含量。
１．３　数据统计与分析
酸水解和碱水解均重复４次。应用ＳＡＳ９．１．２
软件，在Ｐ ＝０．０５的水平上，采用Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ最小显
著差数法对实验结果进行统计分析。
２　结果与分析
经过酸、碱水解和硅烷化后，几十种非极性化合
物被分离出来（图１和表１）。其中，经过酸水解后，
３０种非极性代谢产物被鉴定出来，而经过碱水解
后，有３６种非极性代谢产物被鉴定出来（表１），均
包含脂肪酸、酰胺、脂肪醇、烷烃、腈类和甾醇６类化
合物（表２）。其中，十六烷醇、十八碳烯酰胺、３，７，
１１，１５－四甲基十六烯醇、十九碳酰胺和油酰胺仅在
碱水解后被检测出来（表１）。
图１　酸水解（Ａ）与碱水解（Ｂ）后草地早熟禾品种‘午夜’叶片ＧＣ－ＭＳ总离子流色谱图
Ｆｉｇ．１　Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ　ＧＣ－ＭＳ　ｔｏｔａｌ　ｉｏｎ　ｃｕｒｒｅｎｔ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ　ｏｆ　ｌｅａｆ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｉｎ　Ｋｅｎｔｕｃｋｙ　ｂｌｕｅｇｒａｓｓ
（Ｐｏａ　ｐｒａｔｅｎｓｉｓ‘Ｍｉｄｎｉｇｈｔ’）ａｆｔｅｒ　ａｃｉｄ（Ａ）ａｎｄ　ａｌｋａｌｉｎｅ（Ｂ）ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
　　采用功能团以及碳原子数和双键的数量对分离
得到的化合物进行归类，其结果见表２。脂肪酸类
是提取的非极性化合物中最主要的一类化合物。采
用碱水解方法提取到的脂肪酸总量是酸水解的４．２５
倍。其中Ｃ１６∶０、Ｃ１８∶０、Ｃ１８∶２、Ｃ１８∶３这４类化合
物，碱水解的含量显著高于酸水解。尤其是１８碳的
２类不饱和脂肪酸，Ｃ１８∶２和Ｃ１８∶３碱水解后的含
量分别是酸水解的８．０１和６．４１倍。
如表２所示，采用酸水解和碱水解法我们还分
离得到了较高含量的酰胺类化合物。采用碱水解法
分离得到了碳原子数分别为１８、１９、２２、２４和２５的
５类酰胺类化合物。采用酸水解法我们仅分离得到
了碳原子数为２２和２５的２类酰胺类化合物。碱水
解法分离得到的酰胺类化合物的总量是酸水解的
３．２１倍。在２种水解方法都检测到的酰胺类化合
物中，碱水解后的分离量均显著高于酸水解。
采用碱水解法，明显增加了脂肪醇类化合物分
离的种类和大部分脂肪醇类化合物的含量。十六烷
醇、３，７，１１，１５－四甲基十六烯醇和二十二醇只能在
碱水解后检测到，而在酸水解后未检测到（表１、２）。
碱水解后醇类化合物的总量是酸水解的６．２１倍。
除二十烷醇酸水解后的含量显著高于碱水解外，其
他３类醇，包括３，７，１１－三甲基十二烷醇、十八烷醇
和二十六烷醇，碱水解的含量均显著高于酸水解（表
１、２）。
采用酸或碱水解的方法我们还分离和检测到烷
烃、腈类和甾醇类化合物。本实验仅检测到２种烷
烃类化合物，其中十六烷在碱水解后的提取量显著
高于酸水解，二十九烷在酸水解和碱水解条件下提
取量差异不显著。另外，采用酸或碱水解的方法，我
们分离到２种甾醇类化合物，菜油甾醇和谷甾醇。
其中菜油甾醇在２种水解条件下的差异不显著，而
谷甾醇在碱水解条件下的提取量显著高于酸水解。
在本研究中，在碱水解或酸水解后我们还发现了碳
原子数为１６、２２和２４的３种腈类化合物。在２种
水解条件下，它们的提取量差异均不显著（表２）。
３　结论与讨论
植物细胞中的代谢产物包括有机酸、氨基酸、
糖、糖醇、磷酸化的中间产物和脂溶性的化合物［１］。
甲醇－氯仿提取法是常用的、有效的植物细胞中代谢
产物提取方法［１－２，１６］。有机酸、氨基酸、糖等极性代
谢产物溶于甲醇中，而脂类和甾醇等非极性代谢产
物溶于氯仿中。由于重力的不同，离心后可以简单、
高效的将极性和非极性代谢产物分离开来。
６６
第４期 张玉婷，等：水解方法对草地早熟禾非极性化合物分离的影响
表１　采用酸水解或碱水解方法从草地早熟禾品种‘Ｍｉｄｎｉｇｈｔ’叶片中分离得到的非极性化合物
Ｔａｂ．１　Ｌｉｓｔ　ｏｆ　ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ｋｅｎｔｕｃｋｙ　ｂｌｕｅｇｒａｓｓ（Ｐｏａ　ｐｒａｔｅｎｓｉｓ‘Ｍｉｄｎｉｇｈｔ’）
ｗｉｔｈ　ｂｙ　ａｃｉｄ　ｏｒ　ｂａｓｅ　ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
序号
Ｎｏ．
保留时间／ｍｉｎ
Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ
化合物名称
Ｃｏｍｐｏｕｎｄ
衍生物
Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ
质荷比
ｍ／ｚ　ｆｏｒ　ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
１　 ２０．２５６　 ３，７，１１－三甲基十二烷醇 （１ＯＨ　Ｃ１５∶０） ２０７
２　 ２２．６６ 十六烷 （Ｃ１６） ２２６
３　 ２９．０８ 十六腈 （Ｃ≡Ｎ　Ｃ１６∶０） ２３６
４　 ２９．４９ 十六烯酸甲酯 （Ｃ１６∶１） ２６８
５　 ２９．６２ 十六烷酸甲酯 （Ｃ１６∶：０） ２７０
６　 ３０．２８ 十六烷醇 （１ＯＨ　Ｃ１６∶０）ｃ　 Ｏ－ＴＭＳ　ａ ２９９
７　 ３１．７２ 十六碳烯酸 （Ｃ１６∶１） Ｏ－ＴＭＳ　 ３２６
８　 ３１．９４ 十六烷酸 （Ｃ１６∶０） Ｏ－ＴＭＳ　 ３２８
９　 ３２．５５ 十八碳烯酰胺 （Ｃ１８∶１）ｃ ２８１
１０　 ３２．８２　 ９，１２－－十八碳二烯酸甲酯 （Ｃ１８∶２） ２９４
１１　 ３２．９０　 ９，１２，１５－十八碳三烯酸甲酯 （Ｃ１８∶３） ２９２
１２　 ３３．１４　 ９，１２，１６－十八碳三烯酸甲酯 （Ｃ１８∶３） ２９２
１３　 ３３．１８　 ９，１２，１７－十八碳三烯酸甲酯 （Ｃ１８∶３） ２９２
１４　 ３３．４３ 硬脂酸甲酯 （Ｃ１８∶０） ２９８
１５　 ３３．９６ 十八烷醇 （１ＯＨ　Ｃ１８∶０） Ｏ－ＴＭＳ　 ３２７
１６　 ３４．２３　 ３，７，１１，１５－四甲基十六烯醇 （１ＯＨ　Ｃ２０∶１）ｃ　 Ｏ－ＴＭＳ　 １４３
１７　 ３４．８８ 十八碳二烯酸 （Ｃ１８∶２） Ｏ－ＴＭＳ　 ３５２
１８　 ３５．０２ 亚麻酸 （Ｃ１８∶３） Ｏ－ＴＭＳ　 ３５０
１９　 ３５．２２ 十九烷酸甲酯ｂ ３１２
２０　 ３５．４１ 十九碳酰胺 （Ｃ１９∶０）ｃ ３２７
２１　 ３５．４９ 十八烷酸 （Ｃ１８∶０） Ｏ－ＴＭＳ　 ３５６
２２　 ３６．０８ 二十二醇 （１ＯＨ　Ｃ２２∶０）ｃ ３０８
２３　 ３７．３４ 二十烷醇 （１ＯＨ　Ｃ２０∶０） Ｏ－ＴＭＳ　 ３５５
２４　 ３８．７６ 十八碳烯酸 （Ｃ１８∶１） Ｏ－ＴＭＳ　 ３４０
２５　 ３９．６０ 二十二碳烯腈 （Ｃ≡Ｎ　Ｃ２２∶１） ３１９
２６　 ３９．７２９ 二十二烯酸甲酯 （Ｃ２２∶１） ３２０
２７　 ３９．９９３ 二十四碳腈 （Ｃ２４∶０） ２７８
２８　 ４１．４４７ 二十二碳烯酸 （Ｃ２２∶１） Ｏ－ＴＭＳ　 ４１０
２９　 ４２．７０１ 二十六碳烯酸甲酯 （Ｃ２６∶１） ３４７
３０　 ４３．８８ 二十二碳烯酰胺 （Ｃ２２∶１） ３３７
３１　 ４４．４４４ 二十五碳烯酰胺 （Ｃ２５∶１） Ｎ－ＴＭＳ　 ４０９
３２　 ４５．５７２ 二十九烷 （Ｃ２９） ４７０
３３　 ４６．１２４ 二十六烷醇 （１ＯＨ　Ｃ２６∶０） Ｏ－ＴＭＳ　 ４３９
３４　 ４６．６７６ 二十四碳烯酰胺 （Ｃ２４∶１）ｃ ３６５
３５　 ４９．９２３ 菜油甾醇 Ｏ－ＴＭＳ　 ４７２
３６　 ５１．１２５ 谷甾醇 Ｏ－ＴＭＳ　 ４８６
　注：ａ．硅烷化衍生物；ｂ．内标；ｃ．酸水解后未检测到的化合物。
　Ｎｏｔｅ：ａ．ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌａｔｅｄ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ；ｂ．ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｓｔａｎｄａｒｄ；ｃ．ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｎｏｔ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ａｆｔｅｒ　ａｃｉｄ　ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．
７６
上 海 交 通 大 学 学 报 （农 业 科 学 版） 第３１卷
表２　采用酸水解与碱水解方法在草地早熟禾品种“Ｍｉｄｎｉｇｈｔ”
叶片中分离得到的非极性化合物的相对含量
Ｔａｂ．２　Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｉｎ
ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ｋｅｎｔｕｃｋｙ　ｂｌｕｅｇｒａｓｓ（Ｐｏａ　ｐｒａｔｅｎｓｉｓ‘Ｍｉｄｎｉｇｈｔ’）
ｗｉｔｈ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ｂａｓｅ　ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
化合物
Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ
碱水解
Ｂａｓｅ　ｃａｔａｌｙｚｅｄ
ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
酸水解
Ａｃｉｄ　ｃａｔａｌｙｚｅｄ
ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
脂肪酸
Ｃ１６∶０　 ２８．９４±２．４２＊ １２．６１±１．７０
Ｃ１６∶１　 ２．５７±０．２３　 ２．０８±０．１８＊
Ｃ１８∶０　 １２．６６±１．７０＊ ６．７４±１．１５
Ｃ１８∶１　 １．１５±０．２８　 ０．７８±０．１１
Ｃ１８∶２　 ２７．３８±１．４４＊ ３．４２±０．５０
Ｃ１８∶３　 １３５．０９±６．６６＊ ２１．０８±３．６２
Ｃ２２∶１　 １．３２±０．２７　 ２．０７±０．６７
Ｃ２６∶１　 ０．６７±０．１９　 ０．５８±０．２８
总量 ２０９．７８±１２．１３　 ４９．３６±１２．９９
酰胺
Ｃ１８∶１　 ３．９８±０．６６＊ — ａ
Ｃ１９∶０　 １．５９±０．２３９＊ —
Ｃ２２∶１　 ６２．８３±７．８１＊ ２５．６４±１２．１５
Ｃ２４∶１　 ０．４１±０．０９＊ —
Ｃ２５∶１　 ３６．２７±２．３６＊ ７．１３±１．２７
总量 １０５．０８±１０．７６　 ３２．７７±１２．２８
脂肪醇
１ＯＨ　Ｃ１５∶０　 ０．２２±０．０２＊ ０．０３±０．０１
１ＯＨ　Ｃ１６∶０　 ０．５４±０．０７＊ —
１ＯＨ　Ｃ１８∶０　 １．２１±０．１０＊ ０．４８±０．０８
１ＯＨ　Ｃ２０∶０　 ０．２３±０．０５　 ０．９４±０．１１＊
１ＯＨ　Ｃ２０∶１　 ６．８４±０．１５＊ —
１ＯＨ　Ｃ２２∶０　 ０．２９±０．０５＊ —
１ＯＨ　Ｃ２６∶０　 ０．８４±０．０７＊ ０．２０±０．０４
总量 １０．１８±０．１１　 １．６４±０．２０
烷烃
Ｃ１６　 ０．２９±０．０６１＊ ０．０６±０．０１４
Ｃ２９　 ０．２４±０．０９９　 ０．１６±０．０７５
总量 ０．８６±０．１８　 ０．２２±０．０８
腈类
Ｃ≡Ｎ　Ｃ１６∶０　 ０．２３±０．０３　 ０．４７±０．１５
Ｃ≡Ｎ　Ｃ２２∶１　 ４６．３１±１０．１４　 ２５．５０±１３．０３
Ｃ≡Ｎ　Ｃ２４∶０　 ０．５９±０．２０　 ０．８８±０．１７
总量 ４７．１４±１０．３５　 ２６．８６±１３．２３
甾醇
菜油甾醇 ０．４６±０．０２　 ０．３６±０．０８
谷甾醇 １．４１±０．０８＊ ０．９３±０．１０
总量 １．８７±０．１０　 １．２９±０．１８
　注：表中相对含量通过化合物与十九碳酸甲酯内标峰面积相比得
到（ｎ＝４）。＊号表示同一化合物不同处理方法在Ｐ＝０．０５水平上
差异显著。ａ酸水解后未检测到的化合物
　Ｎｏｔｅ：Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ａｒｅ　ｐｅａｋ　ａｒｅａｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｎａｌ
ｓｔａｎｄａｒｄ　ｎｏｎａｄｅｃａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ　ｍｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ（ｎ＝４）．Ｎｕｍｂｅｒｓ　ｍａｒｋｅｄ
ｗｉｔｈ　ｓｔａｒ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ａｔ　ｔｈｅ　０．０５ｌｅｖｅｌ　ｂｅｔｗｅｅｎ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ．ａ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ
ｎｏｔ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ａｆｔｅｒ　ａｃｉｄ　ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
　　植物非极性化合物提取过程中，经常采用酸水
解的方法进行脂类化合物的水解和转甲酯化反
应［１７－１８］。与酸水解的方法相比，碱水解方法温度
低，反应时间短，可能更适合酯类的转甲酯化反
应［１１］。在前期预备实验的基础上，本研究采用３％
的Ｈ２ＳＯ４ 甲醇溶液水解４ｈ或０．４ｍｏｌ／Ｌ　ＫＯＨ甲
醇溶液水解０．５ｈ的方法，比较了酸水解和碱水解
法对脂肪酸分离和提取的影响。发现，与酸水解相
比，在碱水解条件下，脂肪酸分离的总量成倍增加，
尤其是Ｃ１６∶０、Ｃ１８∶０、Ｃ１８∶２和Ｃ１８∶３的脂肪酸。
这可能是由于酸水解的温度高，时间长，在长时间高
温的条件下，部分不饱和脂肪酸降解和发生双键的
异构化现象［１０］。
除了脂肪酸以外，与酸水解相比，在碱水解条件
下，醇类、酰胺类和烷烃类等化合物分离的种类和分
离量也发生了显著变化。植物叶表面含有丰富的蜡
质层，在碱的作用下，蜡质可以水解为脂肪酸和脂肪
醇类。与脂肪酸相似，与酸水解相比，碱水解后绝大
部分脂肪醇的种类和数量显著增加，这部分脂肪醇
可能是蜡质水解的产物［１９］。２０碳的脂肪醇是植物
蜡质的组成成份之一，与其他检测到的脂肪醇不同
的是，该脂肪醇酸水解后的含量显著高于碱水解，可
能的原因是２０碳的脂肪醇除了作为蜡质的组成成
份，可能还参与其他重要的生理过程。酰胺是一类
有重要生物活性的化合物［２０］。在碱水解后，酰胺类
化合物的种类增加，相关化合物的含量显著提高，这
说明这些酰胺类化合物在草地早熟禾的叶片中可能
是以一种结合态的形式存在。而关于其功能以及存
在形式，还有待进一步研究。
Ｃ２９烷烃是植物细胞表面蜡质的主要成份，在
２种水解条件下，Ｃ２９烷烃的含量没有显著变化，而
在碱水解后，Ｃ１６烷烃的含量显著增加。与酸水解
相比，增加的部分Ｃ１６烷烃可能是某些化合物水解
的产物。甾醇在植物细胞中以游离态和结合态两种
形式存在［１９］。在酸和碱水解条件下，都检测到２种
甾醇类化合物，其中碱水解后谷甾醇的含量显著增
加。这可能说明，在草地早熟禾的叶片中有部分以
酯类形式存在的谷甾醇［２０］。在２种水解条件下都
没有检测到以酯类形式存在的甾醇，这可能和实验
８６
第４期 张玉婷，等：水解方法对草地早熟禾非极性化合物分离的影响
条件以及仪器的检测灵敏度有关。
综上所述，与酸水解相比，碱水解不仅有利于脂
类化合物的转甲酯化反应，进行脂类化合物的分离
和鉴定，也有利于脂肪醇、酰胺、烷烃和甾醇等化合
物的分离和鉴定。甲醇－氯仿提取法结合碱水解，是
一种简单、高效的植物样品非极性化合物气相色谱
－质谱的前处理方法。
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