全 文 ：植物学通报 2005, 22 (增刊): 99~107
Chinese Bulletin of Botany
①华中科技大学引进人才启动项目(0101170064)资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: fuch@sina.com.cn
收稿日期: 2004-05-20 接受日期: 2004-12-22 责任编辑: 白羽红
专 题 介 绍
细胞融合与植物细胞质雄性不育性状改良①
付春华② 余龙江
(华中科技大学生命科学与技术学院 武汉 430074)
摘要 原生质体融合技术不仅可以实现核基因组的重组, 而且可以实现胞质基因组的重组, 为转移由
线粒体DNA或叶绿体DNA控制的性状提供了一条捷径。本文综述了获得胞质杂种的方法及其原理, 细
胞融合在胞质转移及创造新的细胞质雄性不育(CMS)资源上的研究进展及其应用情况, 以及CMS在有
性后代中的遗传规律, 探讨了此育种途径的优势及其在木本果树无籽育种上的应用。
关键词 原生质体融合, 细胞质雄性不育(CMS), 胞质杂种, 无籽育种
Research Progress in Plant Cytoplasmic Male Sterility
by Protoplast Fusion
FU Chun-Hua② YU Long-Jiang
(College of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074)
Abtract Protoplast fusion for combining and exchanging nuclear and cytoplasm genomes in
hybrid progeny provides a new strategy to improve traits controlled by chloroplast or mitochon-
drial DNA. This paper reviews the methods and mechanisms of obtaining cybrids, advances in
transforming cytoplasmic male sterility (CMS), the potential use of these CMS somatic hybrids
and the genetic transformation of CMS in sex hybrids. In addition, the application of this strat-
egy to breeding seedless woody fruit trees is discussed.
Key words Protoplast fusion, Cytoplasmic male sterility (CMS); Cybrids; Seedless breeding
生物体内除核基因组外, 还存在着另外2
种遗传物质的载体— —线粒体DNA和叶绿体
DNA, 它们控制着农作物的许多经济性状。
有关胞质基因组控制遗传信息方面的研究表
明, 大多数高等植物的叶绿体和线粒体基因组,
在有性杂交过程中都表现为母性遗传。现在
人们已确知, 植物的细胞质雄性不育(cytoplas-
mic male sterility, CMS)性状由线粒体基因组
决定, 但因其为母性遗传, 通过传统的有性杂
交方式转移CMS要经过5~8代(甚至8~10代)
才能替换掉胞质供体的核基因组(郭文武和邓
秀新, 1996)。20世纪70年代兴起的原生质体
融合技术(又称体细胞杂交)不仅可以实现核基
因组的重组, 而且可以实现细胞质基因组的重
100 22(增刊)
组, 为转移由细胞器控制的性状提供了一条新
的途径。体细胞杂交一代理论上产生的杂种
有 3 种情况: 核杂种(综合双亲所有遗传物
质)、非对称杂种(综合双亲部分遗传物质)和
胞质杂种(含有一方亲本的核及另一方的胞质
或者两方的胞质)。由于胞质杂种避免了胞质
供体细胞核基因的渗入而带来的一些不良性
状, 遗传更为稳定, 在转移细胞器控制的性状
方面有明显优势(邓秀新和余桂红, 2000)。
CMS性状的转移是胞质杂种利用研究最多的
领域。本文就国内外胞质杂种的获得途径,
细胞融合获得的杂种在植物CMS性状改良上
的应用潜力, 以及CMS 性状在有性后代中的
遗传等方面的研究进展进行探讨。
1 胞质杂种的制备方法
为了使胞质基因组能够重组以产生新类
型, 同时又避免因倍性增加带来的不利性状, 首
先要获得胞质杂种。据已有的文献报道, 通过
细胞融合产生植物胞质杂种至少有3种途径。
1.1 对称融合产生胞质杂种
对称融合后自发形成胞质杂种的现象在
植物上比较普遍, 无论种内、种间还是属间
组合都有报道。涉及的物种也较多, 在模式
植物烟草及木本果树柑橘上尤为普遍(邓秀新
和余桂红, 2000)。对于此种方式获得胞质杂
种, 郭文武和邓秀新(1996)认为与两亲本的亲
缘关系有关, 亲缘关系越近, 越易形成。烟草
种内融合时, 有1/2以上为胞质杂种, 种间融合
时 1/4以上为胞质杂种。在柑橘上通过对称
融合产生的200余例体细胞杂种中有近30例
全部或部分为胞质杂种(Grosser et al., 2000 )。
对称融合产生胞质杂种的机理还没有定论, 一
般认为有3种可能性: 1) 细胞融合过程中形成
异核体, 胞质融合而核未融合, 在随后的杂种
细胞分裂过程中, 双亲细胞核由于不同步等原
因, 一方的核逐渐丢失, 导致胞质杂种的产生;
2) 细胞质和细胞核都融合形成了杂种细胞, 但
由于双亲遗传上的不协调, 或双亲细胞分裂周
期长短不同, 杂种细胞在分裂过程中排除了亲
本之一的全部或部分染色体, 从而导致胞质杂
种或非对称杂种的产生, 这种情况在远缘体细
胞杂交中较为多见; 3) 物理因素(如电场刺激)
导致供体胞质基因整合进了受体细胞。
1.2 供体-受体融合方式
对称融合获得胞质杂种途径具有不确定
性, 效率也较低。为了制备具有特定亲本核
的细胞质杂种, 研究者们进行了不懈的探索, 提
出了一些改进方法。一种方法是 “供体 -受
体”式原生质体融合技术。其原理是基于生
理代谢互补, 即原生质体经高于致死剂量的电
离辐射处理, 使其核解体或完全失活后作为供
体。目前, 对供体的处理有以下几种方法: 射
线(X、γ和UV)辐射原生质体; 限制性内切酶
处理原生质体(Forsberg et al., 1998); 纺锤体
毒素、染色体浓缩剂处理原生质体(Ramula
et al., 1996)。目前研究结果表明, 射线的作
用最好。射线中主要是 X和γ射线, 因为其
穿透力较强, 但这2种射线不很安全, 尤其是以
Co 60作为放射源的g射线更是如此, 而且辐射
时间一般都很长。近年来, 紫外线(UV)逐渐
被用于非对称融合(Vlahova et al. , 1997;
Forsberg et al., 1998)。而受体原生质体则用
碘乙酸( iodoace t ic ac id , IA)或碘乙酰胺
(iodoacetamide, IOA)处理, 使其细胞质失活, 其
基本原理是: IA和 IOA都可以与磷酸甘油醛
脱氢酶上的-SH基团发生不可逆的结合, 抑制
酶的活性, 从而阻止3-磷酸甘油醛氧化生成3-
磷酸甘油酸, 使糖酵解不能进行; 另外还有一
种是罗丹明6-G (rhodamin 6-G), 可以抑制线粒
体氧化磷酸化。线粒体氧化磷酸化和糖酵解
都是在细胞中产生能量的过程。细胞生长发
育的能量得不到供应, 细胞就不能正常生长发
育。经不同处理的供体和受体原质体融合后,
只有融合体能够实现代谢上的补充, 进行持续
分裂, 才能形成愈伤组织或再生成植株。这
1012005 付春华等: 细胞融合与植物细胞质雄性
种技术的优点是, 双亲不需要任何选择标记, 适
应范围广, 可行性强。缺点是适宜的辐射剂
量难以掌握, 如果剂量不足, 可能在转移细胞
质的同时, 会转入部分核基因组; 如果剂量过
高, 则会对细胞质产生影响。尽管如此, 这是
目前最为可行且效率最高的方法。
1.3 胞质体-原生质体融合方式
另一种可行的方法就是Maliga等提出的
“胞质体 - 原生质体”融合法。所谓胞质体
是指去核后的原生质体。目前去核方法有两
种: 一种是细胞松弛素B(cytochalasin B, CB)
处理法, 其原理是CB处理后使微丝解聚, 从而
使细胞结构松弛, 然后在很小的离心力下就可
以使细胞核与细胞质分开; 另一种是Percoll密
度梯度 -超速离心法, 其原理是根据细胞质、
细胞核各部分的浮力离心密度不同, 离心后使
核、质在不同的界面分层。后者的优点是避
免了电离辐射或毒性物质可能产生的不利影
响。但目前此方法的应用还不广泛, 只在少
数作物上获得了成功, 大多数作物还处在探索
阶段, 主要是因为在胞质体的制备上存在技术
困难。虽然不少研究者作了很多有益的探索,
但因物种及基因型不同, 密度梯度液的组成, 离
心速度和时间均不同, 所以目前还没有胞质体
分离的固定模式。另外, 虽然获得胞质体, 但
费用太高, 并且获得的胞质体的活力不高且数
量不多。由胞质体 -原生质体融合方式获得
CMS胞质杂种的报道只有 1例(Spangenberg
et al., 1990)。
2 无性CMS杂种在育种研究上的
应用潜力
利用原生质体融合技术来转移雄性不育
性状已在许多植物, 包括烟草属(Nicotiana)
(Dragoeva et al., 1999)、芸苔属(Brassica)
(Sigareva and Earle, 1997)及水稻(Bijoga et al.,
1999)等植物中获得了成功。据不完全统计,
目前利用原生质体融合获得的转移CMS性状
的体细胞杂种、胞质杂种及非对称杂种总共
有50余例, 其中对称融合获得具有CMS性状
的体细胞杂种24例, 胞质杂种12例; 供体-受体
融合获得的具有CMS的非对称杂种有19例; 胞
质体 -原生质体融合获得的胞质杂种仅1例(表
1)。在一些模式植物(如烟草)上, 这一技术体系
已很完善, 许多由细胞融合转育成的CMS胞质不
育系已被纳入新的育种程序, 结合常规有性杂交
育种, 有望从中可选育出新的胞质雄性不育系。
2.1 创造新的CMS 类型
原生质体融合过程中, 不仅发生核 DNA
重组, 还发生叶绿体 DNA 重组以及线粒体
DNA 重组。融合后获得的 CMS杂种有两种
类型, 一种是可育胞质与不育胞质融合后导致
的不育; 另一种是两种可育胞质发生融合后,
发生重组导致新的不育类型的产生。利用原
生质体融合技术, 人们获得了许多新的胞质雄
性不育材料。Prakash和Chopra(1990)利用白
菜型油菜(Brassica campestris)及芥菜型油菜
(B. juncea)分别与B. oxyrrhina进行原生质体
融合, 在后代中得到了新的细胞质雄性不育系
Oxy CMS。 后来又有报道用芥菜型油菜与刺
油菜(B. spinescens)融合(Kirti et al., 1991)、
甘蓝型油菜与洋基芥(B. tournefortii)融合(Liu
et al., 1996), 分别得到了新的不育系 Spines
CMS和 Tour CMS。印度Kirti等(1997)报道
由芥菜型油菜与 Trachystoma ballii融合, 在
后代中得到了稳定的Trachy CMS, 并找到了
其育性恢复基因。利用芥菜型油菜与
Diplotaxis catholica融合, 又得到了Catholica
CMS(Kirti et al., 1995c)。Yamagishi 和
Glimelius(2003)利用原生质体融合克服了拟南
芥(Arabidopsis thaliana)和萝卜(Raphanus
sativus)远缘杂交不亲和的障碍, 获得了具有萝
卜 CMS性状的新材料。
2.2 作为胞质供体亲本, 回交转育新的不
育系
融合获得的CMS胞质杂种, 其经济性状
102 22(增刊)
表 1 部分成功转移CMS的作物组合(1992~2004年)
Table 1 Parts of fusion combination aiming to transfer CMS trait (1992-2004)
组合 融合方式 杂种类型 参考文献
十字花科Cruciferae
芸苔属 Brassica
种 B. napus + B. napus (Ogu CMS) 对称融合 胞质杂种 Orczyk et al., 1995
内 B. juncea (Ogu CMS) + B. juncea 对称融合 体细胞杂种 Kirti et al., 1995a
B. oleracea + B. oleracea (CMS) 供受体融合 胞质杂种 Sigareva and Earle, 1997
种 B. oleracea + B. rapa (Anand CMS) 供受体融合 非对称杂种 Cardi and Earle, 1997
间 B. oleracea + B. juncea (Tour CMS) 对称融合 体细胞杂种 Arumugam et al., 1996
B. oleracea + B. napus (Ogu CMS) 对称融合 体细胞杂种 Kao et al., 1992
B. oleracea + B. juncea 对称融合 体细胞杂种 Pradhan et al., 1995
(Tour or Oxy CMS)
B. campestris, B. juncea + B. oxyrrhina 对称融合 体细胞杂种 Prakash and Chopra, 1990
B. juncea + B. spinesvens(CMS) 对称融合 体细胞杂种 Kirti et al., 1991
B. napus + B. ournefoutii 对称融合 胞质杂种 Stiewe and Robbelen, 1994
供受体融合 非对称杂种 Liu et al., 1996
属 B. napus + Raphanus sativus (Kos CMS) 供受体融合 非对称杂种 Sakai and Imamura, 1992
间 B. juncea + Diplotaxiscatholica (CMS) 对称融合 体细胞杂种 Kirti et al., 1995c
B. juncea + Trachystoma ballii (CMS) 对称融合 体细胞杂种 Kirti et al., 1995b
B. juncea + Moricandia arvensis (CMS) 对称融合 体细胞杂种 Prakash et al., 1995
B. oleracea + Raphanus sativas 供受体融合 非对称杂种 Kanno et al., 1997
Arabidopsis thaliana+Raphanus sativus 对称融合 体细胞杂种 Yamagishi and Glimelius,2003
禾本科Gramineae
稻属Oryza
种 O. sativa + O. sativa (CMS) 对称融合 体细胞杂种 Bijoga et al., 1999
内 供受体融合 胞质杂种 Akagi et al., 1995a
供受体融合 胞质杂种 Akagi et al., 1995b
科 O. satival + Daucus carota (CMS) 供受体融合 非对称杂种 Kisaka et al., 1994
间 茄科(Solanaceae)烟草属(Nicotiana)
种 N. tabacum + N. tabacum (CMS) 胞质体 -原生质体融合 胞质杂种 Spangenberg et al., 1990
内 对称融合 体细胞杂种 Kofer et al., 1990
供受体融合 非对称杂种 Kofer et al., 1992
种 N. suaveolens (CMS)+ N. tabacum 供受体融合 非对称杂种 Matibiri and Mantell, 1994
间 N. tabacum + N. alata 供受体融合 非对称杂种 Atanassov et al., 1998
属 N. tabacum + Daucus carota 供受体融合 非对称杂种 Kisaka and Kame, 1994
间 N. tabacum + Hyoscyamus 供受体融合 非对称杂种 Zubko et al., 1996
N. tabacum + Petunia 供受体融合 非对称杂种 Dragoeva et al., 1999
矮牵牛属 Petunia
种 Petunia (fertile) + Petunia (CMS) 对称融合 体细胞杂种 Chartier-Hollis et al., 1988
间
黑麦草 Lolium perenne
种 Perennial ryegrass (Jon 401) + 供受体融合 非对称杂种 Creemers-Molenaar et al.,
间 Perennial ryegrass (B200, CMS) 1992
柑橘属Citrus
Guoqing NO.1+HB pummelo 对称融合 胞质杂种 Guo et al., 2004
Guoqing NO.1+ Sunburst Mandarin 对称融合 胞质杂种 Guo et al., 2004
Guoqing NO.1+ Oric Lee hybrids 对称融合 胞质杂种 Guo et al., 2004
Guoqing NO.1+Murcott tangor 对称融合 体细胞杂种 Guo et al., 2004
1032005 付春华等: 细胞融合与植物细胞质雄性
往往会有某方面的缺陷, 但用此种质与经济性
状好的亲本回交 , 可望获得理想类型。如
Arumugam等(2000)利用原生质体融合获得了
具有“Oxy”CMS 的芥菜型油菜(AABB)(有
严重的褪绿症)与B. oleracea(CC)的杂种, 并且
利用此杂种与B. napus(AACC)和B. carinata
(BBCC)回交, 得到了许多含CMS但无褪绿症
的新品系。烟草上获得的体细胞杂种作为回
交亲本, 与亲本之一回交, 解决了其失绿的缺
陷。又有人获得了烟草 CMS的体细胞杂种,
但其花冠和雄蕊不正常, 与野生种回交后, 获
得了正常的改良 CMS 品系(Zubko et al . ,
1996)。Kirti等(1998)利用融合获得的CMS 体
细胞杂种作为回交亲本, 与亲本之一回交, 解
决了其失绿的缺陷。Arumugam等(1996)也获
得了同样的结果。
2.3 分离克隆与CMS 相关的基因
Ogu CMS与正常的油菜相比, 线粒体在
多处发生了重排, 通过一般的手段难以找到与
CMS 相关的基因片段, 而Bonhomme(1991)通
过获得的胞质CMS体细胞杂种与可育亲本相
比较, 获得了与CMS相关的基因。水稻上, 利
用此方法寻找到了与 CMS 紧密连锁的基因
ATP6(Akagi et al., 1995a)。同样, 利用油菜
与花椰菜的体细胞杂种 C M S 系 , 证明了
orf224/atp6 与Polima CMS 有关 (Wang et al.,
1995)。在矮牵牛中, 找到了与CMS相关的基
因 — — the s-pcf locus (Wolf-Litman et al.,
1992)。Yamagishi和Glimelius(2003)发现拟南
芥和萝卜的体细胞杂种中具有CMS性状的植
株都含有 ORF138基因, 说明此基因为控制
Ogu CMS的基因。Pathania等(2003)利用
CMS体细胞杂种与亲本回交, 寻找到与育性恢
复有关的基因 ATPA。
3 无性杂种的CMS 性状在后代中
的遗传
CMS 应用的限制因素之一是不育性的遗
传不稳定。通过原生质体融合转移CMS , 线
粒体普遍发生了重组, 这些因重组而获得的
CMS 性状, 在通过有性或无性途径传递给后代
时的遗传稳定性受到人们的关注。Belliard和
Pelletier(1982)在马铃薯上发现CMS 可以稳定
地遗传给后代, 不发生性状的分离。Akagi等
(1995b)得到了相同的结果。而Leino等(2003)
把存在于萝卜中的CMS 转移到了油菜中, 融
合后得到的植株有3种: CMS 可以稳定遗传给
有性后代、CMS 不能稳定遗传及可育的植
株, 并从分子水平上研究了能稳定遗传植株的
线粒体 DNA。结果表明尽管CMS 可以稳定
遗传, 但线粒体DNA 却发生了变化, 并且涉及
了整个基因组, 据此认为是线粒体 DNA发生
重组, 从而阻碍了核-质互作使得不育类型发
生了变异。而Izhar等(1983)利用转移了CMS
的体细胞杂种为试材, 研究通过茎尖培养及有
性杂交等方式中CMS 的遗传情况, 发现绝大
多数的CMS 通过此两种方式均可以稳定遗传
给后代, 但也有少数发生了性状的转移。令
人惊奇的是, 这种转移均是不育(ms)转变为可
育(mf), 他认为这与异质期的存在有关, 并且不
育与可育不表现一定的显-隐性关系; 不育基
因( STE)是额外因素, 而可育基因(FTE) 是缺乏
的额外因素。另一种解释是在异质中, STE 的
复制要快于 FTE , 导致了ms 向mf 的转移。
对于胞质杂种的CMS 性状在后代中能否稳定
遗传及遗传规律还有待于进一步证实。
4 展望
通常, 连续回交是转育新的雄性不育系的
唯一方法, 这一般需4~5年。若利用原生质融
合来转移雄性不育性状, 则可以在一年内完
成。但体细胞融合得到的四倍体杂种, 虽然
克服了有性杂交中遇到的一些障碍, 实现了不
同种间、属间甚至族间的遗传重组, 但倍性
升高后导致一些经济性状的下降, 因而细胞融
合得到倍性不增加的二倍体胞质杂种是植物
104 22(增刊)
细胞工程领域的发展方向之一。为达到既克
服育种障碍又不增加倍性的目的, 19世纪 80
年代以后, 大多采用非对称融合方式, 但从已
有的报道看, 非对称融合效果不稳定, 受诸多
因素的影响; 对称融合产生胞质杂种还具有一
定的偶然性, 对其产生机理的研究将有助于此
种方式的应用; 随着不同植物胞质体分离技术
的成熟, 胞质体-原生质体融合在胞质基因组
改良方面将会发挥其优势。
对于具有单性结实的果树(如柑橘)来说,
CMS 可以导致无籽, 对于果树来说这是一种优
良性状。以前获得 CMS 及改良的主要途径
有以下3种: 1)发现天然的雄性不育材料; 2)通
过有性杂交, 包括属间的远缘杂交、回交, 进
行核代换得到新的CMS 类型; 3)利用转基因
技术。自然选种和有性杂交费时费力, 效率
不高, 如通过常规有性杂交, CMS 的转移需要
多次重复回交, 以交换胞质供体的核基因组。
对于水稻而言需6~9年, 对于烟草需3~4年, 而
对于诸如柑橘等多年生木本植物来说, 则需要
更长的时间。转基因技术利用的前提是要克
隆控制CMS 的基因, 这在柑橘上有一定的难
度。大田作物上利用原生质体融合进行 CMS
育种成功的事例为柑橘无籽育种展示了一条
新途径。另外, 柑橘细胞对称融合得到二倍
体叶肉亲本类型植株的现象(邓秀新和余桂红,
2000), 为柑橘育种, 特别是为转移胞质基因控
制的性状提供了一条新途径。柑橘胞质基因
控制的农艺性状, 比较清楚的只有温州蜜柑的
雄性不育型 , 雄性不育导致温州蜜柑无籽
(Yamamoto et al., 1997)。我国有许多地方柑
橘品种如‘沙田柚’和‘椪柑’等, 各种农艺和
经济性状均较好, 唯种子较多而影响品质。
将它们的叶肉细胞与温州蜜柑的愈伤组织细
胞融合, 有希望得到二倍体雄性不育柑橘类型,
获得无籽品种, 对于我国‘柚子’、‘黄岩本地
早’等优良地方品种的遗传改良具有重要意
义。目前, 柑橘上的研究取得了一定进展, 对
称融合获得了几例胞质杂种(Guo et al., 2004),
从这些胞质杂种有望得到无籽的柚、橘类新
品种。
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