全 文 ：廷葱旨替瑙冬酬演奄荃万舀 }必莹朽砚氛国外油料科技 募确定油菜及芸蔓属近缘种细胞质
细胞器组分的单叶快速核酸分析法
,目] 工又e o b l e , R .
油菜品质的改进及价格 的提忘使得全世界的油菜种植 i面积迅速扩大 。 我们 ( B “ r 引。 y
等 , 10 8 了 ) 及其他人 ( P el le it e r 等 , 1 9 8 3 ) 已运用原生质体融合技术进一步研究 这 一 作
物 , 目标是创立具有甘蓝型油菜细胸核细胞质雄性不育源 ( 如波里马和 孟于蓝 刊 ,日菜细胞质 )
的线 泛休和对三氯杂苯类啥草剂具抗性的白菜型 油菜叶绿体的细饱质杂种 。 从具它可能的细
胞 器组合中韭确 地鉴定出所需要的细胞质杂.种的唯一方法是建立一种能区分所有可能组合的
线粒体 D N A和叶绿体 D N A的分析体系 .
木文报道的是一种 决速 、 简便 、 非破坏性的分析方法 , 因为木法只需取下 1一 2 片叶 ,
这并不影响植株的正常发 育和成熟 。 除 了利用细胞质杂种的特性外 , 还可应用限制酶片段 长
度多态性分析方法来确定用传统的育种方法涪育的油菜及芸蔓属 物种的细胞器组分 。 目前用
于证实某一特定的雄性不育细胞质的存在或鉴定一种未知雄性不 育细胞质的方法是与许多不
同育性的恢复系和保持系回交 , 此法劳动强度较大 , 而且费时 , 要几年后才能获得结果 . 对
于需要一段春化时期的冬性品种尤其如此 。 本文论述的方法可在三天 内准确地鉴定出两种细
胞质的细脸 器 , 这一方法已作为我们研究室的一种常规筛选方法 。
材料和方法
植物材料 种植在任何条件千一 的任何生 长时期的植株都可用来分析 。 本试脸所用的物种
有 : ( l ) 七种不同细胞质的甘蓝型春油菜和冬油菜品种 , . ( 2 ) 三种不同细胞质的白菜型
油菜品种 , ( 3 ) 三种不同细胞质的芥菜型油菜品种 , ( 4 ) 通过原生质体 融合而产生的具
廿蓝型油菜 、 白菜型油菜和波里马细胞质的甘蓝型油菜体细胞胞质杂种 , 迄今 , 已鉴定 了 2 6
个体细胞质杂种 , ( 5 ) 自然存在的细胞质的物种埃塞俄比亚芥 、 黑芥 ( 黑芥细胞 质 ) 、 萝
卜 ( 萝 卜细胞质 ) 、 白芥 、 甘蓝 、 B . e e r t i e a 、 B . d e f l e x a 、 B . e l o 。 ` a t e 、 B . f r o t i e u l 。 S a 、
B
.
g .l a v i n a e
、
B
.
n i s u l a r i s
、
B
.
m a u r o r u : n
、
B
.
r u p e s t r i s
、
B
. s p i n e s e e n s
、
B
.
t o u r n e f o r t -
11
.
表 1
沙一 ” . .细谧海爱基 「
\ 因组 !
不同细胞质的三种油菜品系数
细胞补\某因组 、 \ _
甘蓝型油 菜
白菜塑油菜
芥 菜型油菜
甘蓝型
油 菜
白菜型
油 菜 波 里 马 萝 芥 菜 型
埃塞 俄
比亚芥 墙生二行 芥
{-一厂「 护
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0 ! V
.~ 侧 . .口 . . . . . 习 二 二 老 ;
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切 , , 〕 ` . . . . . . 召 . , ` . . 曰. , . . . . . . . ` . 」 , 己 伪` r 曰 . 曰 . ` 曰口 . J J . . 曰口 月 . . . . 片占 . ` . . . . 口 . . 口曰 . . 曰 . . J = “ . . 目 . 闷 . . . . . . . . . . . 节 . . . . 翻 . , . 口. . . . . . .
- 一 . . . 相 . , . . .侧 . 0. . . , .片 哥月 , . 合曰 . ` . 门目 . . . . . . ” . . . 咬 , 烈口 , . , . ` 曰. 侧口 . . -线粒体 D N A 的提取
9 6
本法由K c o b le 等 ( 19 8 0 ) 论述的玉米线粒体 D N A提取方法 修 改
中国油杆
而成 。 除了特别说明之外 , 所有过程均在 4 ℃下进行 . 所有的离心均用 5 5 3 4 旋 转 器 中 的
50 m l 离心管和 S or v al R C一 S B离心机 . 离心沉淀物用 4 号小画笔搅动使之悬浮 。 使用这种
笔损坏的细胞器比其他方法少 .
二般取叶片组织 10 一 15 9 , 但这一方法也可少至 2 一 3 9 ( 即不到一片 叶 ) , 将叶片组织
置于盛有 70 m 1 A 缓冲液的研钵或华林 ( W ar ing ) 搅拌器中制成匀浆 , 但用研钵得到的完整
线粒体要多 。匀浆用四层纱布和一层 M i r a c lo ht 布过滤 , 之后在 l o o o x g条件下 离心 10 分 钟 。
在 17 0 0 0 又 g条件下离心 10 分钟 , 使上清液中的线粒体浓缩 , 然后悬浮在 10 m l 的A 缓冲液中 ,
再在 10 0 X g条件下离心 10 分钟 , 以去掉残存的叶绿体和细胞核 , 在上清液中加入 I M 的 氯
化镁和 10 m g / m l当即配制的 D N A 酶溶液 , 以使最后浓度分别为 10 o M和 10 协g / g鲜叶片组 织 。
在 4 ℃下静置 l 小时 , 线粒休在 17 0 0 x g条 件下 , 用20 o 1 B缓冲液离心 20 分钟 . 沉淀物悬浮
于 10 m l的B缓冲液中 , 再在 1 7 0 0 x g 条件下离心 10 分钟 , 将最后的沉淀物溶解于缓冲液C 中 ,
轻轻搅动 , 在 37 ℃下放置 1 小时 . 在溶解产物中加 入 .0 2 M的 醋酸按 . 在室温下用苯一 氯仿
浸提液提取三次 , 纯化线粒体 D N A . 在 20 ℃下用酒精沉淀 1 夜或在 一 80 ℃下沉淀 2 小 时 。
再在室温下通过离心浓缩 D N A沉淀物 , 用 70 %洒精冲洗两次再悬浑干无菌蒸馏水中 。 线 粒
体 D N A样品可立即用限制酶消化或保存在一 20 ℃条件下备用 .
叶绿体D N A 的提取 本方法是由马铃薯和 A tr i lP o x t r i a n g吐 a r is 的叶绿 体 D N A 提 取
方 法修改而成 。 所有过程在 4 ℃下进行 , 除恃别说 明外 , 所有的离心部用 S or v a l R C一 S B
离心机的 5 5 3 4旋转器进行 , 离心的所有沉淀物都用 4 号小画笔使之悬浮 .
一般取 5 9 ( 最少只取 .0 5 9 ) 叶片组织置于盛有 70 m工D 缓冲液的华林搅拌器 中 制 成 匀
浆 . 匀浆用四层纱布和一层M i r ac 1Ot h布过滤 , 然后在 10 0 0 x g条件下离 心 10 分 钟 , 沉 淀
物悬浮于 10 m l 的 E缓冲液 中 , 再在 10 0 K g 条件下离心 10 分钟 , 悬 浮于 9 . 5 m l 的 E 缓 冲 液
中 , 再在 70 m 130 帕蔗塘和 18 m 160 肠蔗塘 (均为 E缓冲液 ) 的梯度 中分层一用B e c k m a n SW 27
振动旋转器和 L S 超离心机 , 在每 分钟 2 6 0。。转条件下离心 , 使纯化的叶 绿体集 中于 30 肠 :
60 肠的界面上 。 用吸管吸出此带 , 加 30 nI 1E缓冲液稀释 . 在 15 0 0 X g条 件 下 离 心 15 分钟 ,
最后的沉淀物溶于 C缓冲液中 , 叶绿体 D N A的纯化除 了只进行两次 苯 一 氯 仿 提 取 外 、 其
余与线粒体 D N A的纯化相 同 。
限翻醉分析和凝胶电泳 在酶过量的条件下 , 放置 6 小时 , 一般为 一 夜 , 从 而 获 得
线粒体D N A和叶绿体 D N A的限制酶片段 。 用 0 . 7肠或 1 % 的琼脂糖平 板 凝胶 在 2 . 4 V c/ m
下 电泳 16 小时 , 然后染色 , 用 30 2 m m紫外线透照仪照相 . 其方法 见 K e o bl ℃ 等 ( 198 0 ) 。
结 果
用上述约提取方法 , 分别 由少至 2 9和。 . 59 的芸蓝属植物叶片组织获得线粒体D N A 和叶
绿体 D N A 。 本研究使用了许多不同的限制酶 , 以期从中找出一种或一系列能准确区分 我 们
所感兴趣的所有芸蔓属物种的线粒体和叶绿体基因组的内切酶 。 结果发现 , E c o R l能 达 到
上 述要求 , 它能清楚地区分甘蓝型油菜 、 波里马 、 小仓萝 卜 ( 。 g u ) 、 普通萝 卜、 二行芥 、
埃塞俄 比亚芥和黑芥细胞质的线粒体基因组 。 虽然白菜型油崔和芥菜型油菜细胞质的线粒体
D N A图谱相同 , 但它们与其他细胞质的图谱区别明显 。
在波里马 、 萝 卜( 。 g u ) 和二行芥细胞质的线粒体 D N A 图谱中观察到的约 8 . 3 k b的 强 荧
光片段代表了某些芸蔓属品种 中存在的 1 1 . 3 k b的线状线粒体质粒的最大 E co R I片 段 . 虽 然
最近的报道指出这一 E 。 。 R l片段的大小为 7 . s k b , 但在我们的电泳体系 巾 , 这一片段 通 常在
1日8 8午 第 王期 9 7
8
.
3 k b的位浑_ }几。 这一 线粒体质粒的有无及细胞质堆性不育的 冷茶已有报道 。 质位的 有无能
用来区分 }` !姨型油菜和芥菜塑 山袋沟浅位体口 N人 。 在听分析的芥菜卫 }` :弃细他质的品 系 ` 5
个具芥菜型 {川泛细胞核 , 一 个具 甘蓝型油菜细脑核 ) 中都未发现这 一质拉 , 但在 6 个具 白菜
型油菜细饱质的自菜塑油 衰品种中有 5 个含有这一质粒 , 3 0 个具白菜型油菜细胞质的甘蓝型
品种 1一扫有 15 个品系有这一质粒 。 E c o R I也能清 竺地区 分一甘蓝型油菜 、 波里马 、 萝 卜 ( 0卿 ) 、
普通 l沙 卜 ( r a p ) 、 琦生 一 价 ; 芥 、 埃 塞峨比亚芥和界莽细她质的叶绿体臼N 一、 。 与线粒体 D N A
相比 , 这些叶绿体 。 N A 差异沙及到的片一段要少 。 例如 , 小 一仓萝 卜 ( 吧 。 ) 和普通 萝 卜 ( r o p )
的叶绿休 l) 汉A 只一个片 价灼大小 打笼异 ( 吃 u 中有 1 . 4 5 k b片段 , r aP 中有 1 . s k b片段 ) 及 ’后
者无 2 . s k b l均片段 。 波里马 与白菜型油 类和芥菜型油菜叶绿体 D丫 A的兰别是 3 . , k b这一 片段
的有无或 多少 。 埃塞俄比亚芥和 吧芥的叶绿体 日 N A电泳图潜几乎相同 , 只是埃塞俄比 亚 芥
有 5 . 4 k b片段 , 黑芥 汀8 . I k b )l ’段 。
有证据农明 , 存正 两种不同的 E c o 代 I甘蓝型油菜叶绿体 D N A 图谱 ,堆性不 汀灼 甘蓝型油
菜细抱质的叶绿体 D X 入具衬一个 3 . 2 k b沟片一段 , 而雄性 「」育的 一甘蓝型油菜细胞质 的 叶 绿 体
D N A 中没有这 ) }一段 。 但是后者有一个不育 细胞质所没有的 3 . 3 k b的片段 。 这一结 呆 令 人 吃
惊 , 囚为 堆性不育注 政认 勺是线 位体编码的 , 而不是叶绿体编码的 。 但是雄性可育和堆性不
育的甘获型细胞质线拉体户N人的限刊酶片段没有差异 。
和线泣体 D N A一样 , 白菜型油菜和芥菜型 _油菜细胞质表现两种非常 相 似 的 E c川引叶 绿
体 日N左列诸 。 ,勺菜型油菜仆绿体 D N A有芥菜型油菜所没有的 2 . s k b片段 , 芥菜型油菜具有 自
菜型油菜叶绿体 D N八所 没肩`的 4 . I k b片段 , 但是 , 在讨沦 r }“将会 谈到两神叶绿体 D N A 图谱的
丈化与 i造取叶绿休 D N人的 谊株的核背景有关 。
除了 E c o R工外 , B o l l 也能用来区 分芸受属物种的叶绿体 D汉气。 另外 , 小仓乡 扮 ( 。 妙 )
和普通萝 卜( r ; p ) 的叶绿体口N A 习卜常相以 , 仅一个片段有差异 ( r a p 为 7 . 了k b , 雌 “ 为 9 . 6和
。 . 见k b ) 。 黑芥与埃塞俄 比亚芥的 士旱是多一个 了. o k b片段 。雄性 可育和雄性不育的 甘蓝型油
菜叶绿体 D N A只在一个片段 匕有 士片 。 自菜型油菜 、 芥菜型油菜和波里马的叶绿休 D N A 在
9
.
6
、
9
.
3
、 ’
:
.
o k b的片段 仁不 词 , }以可用细微的限制酶片段 一长度多态性米清楚地区另j , 自莱
型油菜的叶泳体 D入八具 4 . 3 k b和 2 . 4 k b的片段 , 芥菜型旧菜具 4 . 2 k b和 2 . 创勺片段 , 而波 里 马
共 4 . 3 k b和 2 . s k b的少i `段 。
自菜型油菜和芥菜型油菜 比匕绿体 D义气的B c l 限制酶片段化学计 最长度多态性 之间 的 差
异是该细粗 贡灼价征 , 而 、个段亚化任计量长度的差异随细胞 核的不同而不同 , 所有的芥菜型
下; !i菜叶绿体 D N 、 月三有 4 . 2 k b的片段 , 而所有的 自菜型 油菜细泡质叶绿体 ON A一都有 4 . 3 k b 口勺片
段 , 一与兵 于一: 羊 六组无关 。 但是 与自然的芥菜型油 岌细抱核组合的芥菜型油菜细胞质叶绿体
D N A具 9 . 6 k与和 丁 . 0 k b为 片段 , 当它与甘蓝型油菜结合时 , 出现 9 . 1k b和 9 . o k b的 )卜段 。 `丁
此 阳似 , 与自然 f勺自菜型油菜细胞该结合的 白菜型油菜细饱质的 仆卜绿体 D NA 具 9 . 6 kl ) { {勺片
段 , 而与甘蓝型油菜细饱核结合时 , 这一 片段被 9 . 2肠和 9 . o kb 的片段所取代 。 由于 在 甘蓝
型油 雀中 , 芥菜型油共细袍质的 B c 1U ; 段 与相 同该背景下的 自菜型 油菜和甘蓝型油菜 细 哑
质的 B c l l 片段相 同 , 所以 , 可 J 证明细抱核控制 着叶绿体基因组的形成 . 最近 , 正 反 问 交
表明 , 玉米的线粒体 D N A 也受细饱核控制 。
木分析的普遍性和可靠性的标志是表 1 所列的 1 12 种核质组合和 26 个体细 咆细抱质 杂 种
都产生一个特有的叶绿体 D N A和线粒体 D N A限制图谱 . 此外 , 从 招个芸罄属野生种也 得 到
了特有的线粒体 D N A和叶绿体 D N人的 E c o R I图谱 。
9 8 中国油杆
讨 论
芸 蔓属线粒体 DA N的限制晦片段 已被用来确定甘蓝裂油菜 、 白菜型油菜和甘蓝 的 限 制
图谱和 物 理 图i 并( h C et ri `等1 98 噜, E r i e k s o n 等 19 8 6 a , L e b e q 和 V e d l 19 8 1 , I , a l m e r
和 S h i e l d s 29 8 4 ) ; 鉴 定杂种的 D N A 重组 ( C h e t r i t 等 19 5 5 ) 及确定 1 1 . 3 k b质粒 的 结 构
( E
r ic k s o n等 19 8 6 , P al m e r等 198 3 a ) 。 芸 蔓属叶绿体 ’〕N A的限制酶片段 已被用来 获 得 甘
蓝型油菜的 {`良制图谱和 物 理 叫 i普 ( E r i o k s o n 19 s 6 a , L e b a e q 和 V e d e l , 10 5 1 , V e d e l 和
M a t h i o a 19 8 3 )
, 决定杂种 中细胞器的遗 传 ( P o l l e t i e r 等 , 29 8 3 ) 和弄清芸蔓属细胞质的进
化起源 ( rE `c气S。 “ 等 `” ” “ , P “ `m e r等 `” “ ” b )o 匕述报道中论述的方法不适于 、作 为 单 株细胞质 D N A的快速筛选程序 , 因为多数方法都需要大量的叶片组织丽毁灭受体植株 . 此外 ,
也还尚未发现一种能区分所感兴趣的线粒体和叶绿体基 因组的限制酶 。 本文论述 的细 胞 质
D N A 特性分析克服了这一 不足 .
本 文报道的非破坏性的单叶线粒体 D N A和叶绿体 D N A 限制酶片段长度多态性快速分 析
体系的优点及用途如下 :
1
、 能迅速鉴定任何细胞质雄性不育值株相应的恢复系和保持系 。 用传统的育种方法来达
到这一 目的需要与大量的保持系和恢复系回交几年 , 并且这也非常费劳 费时 . 而限制酶片段
长度多态性分析可在三天内完成 , 且十分经济 。 一个技术员可同时进行几个分析 。
.
2
、 可准确地鉴定出通过原生质体融合试验产生的体细胞杂种和细胞质杂种 。 我们已应用
这一方法在甘蓝型油菜细胞质杂种中发现了新的线粒体和叶绿体组合 .
3
、 可在细 胞质 D N A 水平下发现 自然植株群体和 组织培养再生的植株的遗传变异 。 植物育
种家急于培育一些具有多种细 饱质基因组的作物 , 以防类 i’a 于玉米小斑病 T小种的 流行病 。
4
、 如果带菌的种子具有不同的细胞质 , 那么就可确定任何一批种子的带菌程度 。 不幸的
是 , 象双低油菜等小粒作物经常遇到混种现象 。
5
、 检查细胞器移植试验是否成功 , 用叶绿体转移外源 D N A 的最新证据使得这一 问 题 成
为若干植物分子生物学家的主要研究重点 。
这一分析体系的另一个好处是只用一种酶 ( E co R I ) 就能区分大多数芸蔓属植物 的 线
粒体 D N A和叶绿休 D N A 。 这不仅利于准备限制酶反应 ( 例如只需一种缓冲药 剂 ) , 而 月
E c o R工是一种最便宜 、 最稳定并广泛应用的限制酶 。
从同一匀浆中提取线粒体 D N A和叶绿体 D N A会使这一分析的速度进一步加快 。 在 10 0 。
火 g条件下初步离心 10 分钟后 , 其上清液用来 按前所述方法提取线拉体 D N A , 然后 将 离心沉
淀物恳浮 庄 10 m l E缓冲液 中 , 按前述方法提取 叶绿体 D N A .
这一分析的作用有 : ( l ) 能区别志贺 ( S ih g a ) 甘蓝型雄性不育系统的叶 绿 体 D N A .
和雄性可育的甘蓝塑油菜细泡质的 叶绿体 D N A 。 表明这两种细胞质由不 同的 起 源 进 化丽
米 , 或者这 两种细胞质是在进化 一罕期由同一亲本分化而来 。 ( 2 ) 能鉴别萝 卜中两 种不 同
类型的线拉体 D N 八绪构 。 ( 3 ) 能区别几个具有潜在细胞质 堆性不育来 源的 芸 蔓 属 野 生
种或非戏谙种的线粒体 O N A和叶绿体 D N A 。 ( 4 ) 证 明叶绿体基囚组结构受细胞核控制 。
( 5 ) 有功于我们 了解芸蔓属植物的细咆质遗传学 , 而这方面正是一个薄弱环节 。 芸蔓属野
生种茧然具有很不相同的植株形态如叶片大小 、 角质层的厚薄及刺毛的有无 , 但线粒体 D N A
和叶绿体 D N 山匀提取方法都能得到足够 纯度的 D N A 作限制酶分析 。 这一发现及本研究已成
功池从较为 普通的物种中提取细胞质 D N A , 表明这些方法可用于大多数物种 。 ( 一厂转 9 4 )
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叭芳灼列 , 长 费合理 , 欢迎联 东
地 日一 : 洲 一几 J I弋吕保 _赎安
)日三丫拼十院油料 作物研 。。序价」报 · `
共一头一刀 ,一奥一 于下 : 一矢一长东分
重 要 启 事
关峪片决笼:事一长一于东旁 ;斑子花笼
《 国外衣学一油 } }一汗物 》 自工9 3 3年起 与扣 户国
邵 . 在过去五 丰中 , 不刊得到广大 i卖者 和作者的 乞
沁订 工9 8 8年 《 中国油料 》 杂志者 , `歹直接汇止
料 》 编辑 花 ( 湖北武吕泪:料所 ) 补 汀叻 .
》 合千IJ 。 未流清寄了中国湘料 》 编龚
!夺于日洛 J功 , 在此 谨致衷心 :均 :舫右 。
( 与期 。 . 而 尼 , 州卜。 . 0 0 ; : ) 至 《 中囚 山
协囚油料 分编沂部
众久只级兵久众众 欠久户瞬 ;声 众 级久众众久久久众户 众久久户众只久众决久众只 及众 久众欠 众浇男 久众众受久只久 竺久夕交只众 会久众久夕 众夕二夕只 声 众 众久户二 只夕二价众户众久久
仁书初倾 ) /附 : 各种缓冲液的配方 /
八缓冲液 10 1n M T E S 〔X一三 ( 经甲获 ) 甲笼一 2 一氛 势 乙烷磺骏 p州为丁. 2二 , 0 . 5 、 !
甘露醉 , l m M E C ’ r A ( 乙一醉双 乙胺 醚一汉 ; N ’ 一 四 乙 酸 ) , 0 . 2 肠的 13 5 了、 ( 牛 血 清 蛋
白 ) 和 0 . 5 肠 一价光氨酸 .
B缓冲液 Z o m M E D T A ( 乙 一 .胺 四 乙胶 ) , 10 m M T E S ( p l 一1为了 . 2 ) , 。 . 6 M 旅糖 .
C缓冲液 5 0 m M T r i s一 H C I ( 三径甲从氛 基甲烷一盐酸 , p l 为 8 . 0 ) , 10 m M E I) T 六 ,
2 肠 S a r k o s y l 和 0 , 0 一2 肠蛋 自酶 k .
I) 缓冲液 o . 3 5 M 山梨塘辞 , s o m 入1 T r i s一 H C I ( p H为 8 . 0 ) , s n色 [ E IJ T A , 0 . 1肠
牛血清蛋自 , 15 m M 硫氢基 乙醉 , 1 m M精胺 , 1 m M 亚精胺 。
E缓冲液 o . 3 5 M 山梨糖醇 , s o m 、 I ’ r r i s一 H C I ( p H 为 8 . 0 ) , 2 5 m M E D ’ f A , z m M精
胺 1 m M亚精胺 .
帅启荣摘译自 《 T h e o r 八 p P I . G e n e t 》 7 3 ( 3 ) 1 0 8了: 3刹一 3 70 刘定富校
公4 中国油才