全 文 ：园 艺 学 报 2001, 28 ( 6) : 532~ 537
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期: 2001- 04- 09; 修回日期: 2001- 11- 06
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (39170396) ; 九五 国家科技攻关项目 ( 960020219003)
原生质体非对称电融合获得不结球白菜胞质
杂种
侯喜林1 曹寿椿2 佘建明3 陆维忠3
( 1南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室, 南京 210095; 2南京农业大学园艺学院, 南京
210095; 3江苏省农业科学院遗传生理所, 南京 210014)
摘 要: 以不结球白菜 OguCMS !91H 秋100∀ (不育系) 和 !91H 秋21∀ (保持系) 为试
材, 研究了不同交流场强、交流频率、直流脉冲场强、直流幅宽及脉冲次数对非对称细胞融
合效果的影响。结果表明, 不结球白菜电融合的最适电场条件为交流场强 20 V/ cm、交流频率
1500 kHz、直流场强 200 V/ cm、直流脉冲幅宽 40 s、直流脉冲次数 3 次。融合产物用 KM8P1
培养基进行包埋培养, 获得了 383块小愈伤组织, 其中 32 块分化出芽, 形成 20 株完整植株,
驯化后栽培成活 8 株, ZS2、ZS6、ZS8等 3 株不育, 后用保持系花粉授粉, 分别收获种子。对
胞质杂种的分子、细胞及生化分析将在其后代中继续进行。
关键词: 不结球白菜; 电融合; 再生植株; 胞质杂种
中图分类号: S 634. 1 文献标识码: A 文章编号: 0513353X ( 2001) 06053206
经由萝卜胞质不育转育获得的不结球白菜 ( Brassica campestris ssp. chinensis) OguCMS
系统由于苗期低温黄化和花器蜜腺发育不良而难以应用于生产, 且苗期黄化是该 CMS 系
应用上的主要障碍, 它主要是因为萝卜胞质中的叶绿体基因组与不结球白菜核之间的不协
调而引起的不良反映。芸薹属的 CMS特性均与线粒体有关, 而线粒体基因组控制的 CMS
性的产生, 使叶绿体 DNA发生了相应的变化, 因此异源胞质植株上最常见的异常现象就
是叶绿素缺乏症和雄性不育, 这些异常可能是核与叶绿体之间功能性不亲和的结果。国内
外众多研究者试图通过常规手段从芸薹属作物品种中筛选 缺绿 的 校正基因 和 CMS
性状的恢复基因以改变胞质遗传背景, 结果均告失败。这是因为通过有性杂交, 杂种的细
胞质几乎全由母本提供, 其结果必然是要么后代的胞质得不到改变, 要么完全改变, 从而
导致不育性的丧失。因此, 必须采用既能保持线粒体不育胞质, 又能使叶绿体基因组与核
基因组亲和的特殊手段, 而利用非对称细胞融合获得 胞质杂种 是有希望的手段之一。
通过胞质基因组的转移, 与相应的保持系形成 胞质杂种 , 便能向萝卜胞质掺入正常的
不结球白菜胞质, 以改善胞质与核的协调性, 从而使其既保持 CMS特性, 又克服原有苗
期低温黄化缺陷, 经过严格的鉴定筛选, 便有希望获得无黄化、有蜜腺的 CMS系。
叶志彪等曾对核失活的萝卜 OguCMS 与线粒体失活的花椰菜原生质体进行了融合研
究, 用化学方法 ( PEG) 诱导的融合, 细胞分裂能力弱, 不能再生出植株; 用电融合的原
生质体则再生出植株#1∃。在植物细胞融合研究中, 电融合方法操作简单, 无化学毒性, 对
细胞损伤小, 融合同步并可在显微镜下观察融合过程#2, 3∃。但对于不同作物, 电融合的处
理条件差异较大#4∃。因而需在细胞电融合研究中, 首先找出适宜的融合条件, 以提高融合
率及植板率。本研究旨在通过用具有正常叶绿体基因组的不结球白菜 (保持系) 与带有萝
卜胞质 ( OguCMS) 的不结球白菜雄性不育材料进行非对称细胞融合, 探讨不同电融合条
件下非对称细胞融合的效果, 为创建不结球白菜胞质雄性不育新种质奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料的制备
OguCMS不育材料为 !91H 秋100∀ ( BC7) , 低温下黄化, 无蜜腺; 保持系为 !91H 秋
21∀ 。采用南京农业大学细胞遗传研究所研制的 南京 CY% 型细胞融合仪#5∃, 交流输
出电压 0~ 40 V, 频率 50~ 2000 kHz; 直流方波脉冲电压 0~ 500 V, 脉冲幅宽 5 s~ 2 ms,
脉冲次数 1~ 9次可调。电极为两块平行放置的铜片嵌在 25 mm & 76 mm 的光滑有机玻璃
中, 电极间距为 2 mm, 容积为 100 L, 使用时将电极浸泡在 75%酒精中 30 min, 取出后
用无菌重蒸水洗 3次, 融合液洗 1次, 备用。OguCMS下胚轴原生质体及保持系子叶原生
质体的制备, 按侯喜林和曹寿椿的方法#6~ 9∃进行。将获得的 OguCMS下胚轴原生质体进行
核失活处理, 先将其密度调整为1. 5 & 105 个/ mL, 分装在小玻璃指形管中 ( 10滴/管) ,
以剂量率为 15 Gy/ min的60Co 照射。核失活的半致死剂量 ( LD50) 为 140 Gy。保持系子叶
原生质体线粒体的失活处理: 将罗丹明 ( R6G) 溶解于含10. 0 g/ 100 mL 二甲基亚砜
(DMSO) 的融合液中, 配成 1 mg/mL 的母液, 抽滤灭菌。处理浓度和时间分别为 40 g/
mL 和 30 min (包括离心所需时间)。
1. 2 电融合处理与观察方法
将核失活的 OguCMS 下胚轴原生质体与线粒体失活后的保持系子叶原生质体按 1∋1的
比例混合, 在融合电极间进行融合。进行不同交流场强、交流频率、直流脉冲场强、幅宽
及脉冲次数处理。处理后立即在倒置显微镜下观察统计细胞融合及细胞破裂情况, 每个处
理观察 10个视野。将融合处理后的细胞在 25 ( 黑暗条件下, 含有0. 5 mol/ L 甘露醇及 2 ,
4 D 0. 5 mg/ L、6BA 0. 25 mg/ L、NAA 1. 0 mg/ L的 KM8P1 培养基中培养 48 h 后, 转到含
0. 3 mol/ L 甘露醇的相同培养基中培养, 以后每隔 48 h分别将甘露醇降到0. 2 mol/ L 和0.
1 mol/ L, 1周左右转移到无甘露醇的培养基中进行液体浅层培养。4周后调查小愈伤组织
发生情况, 统计植板率, 以估计细胞的活力。
原生质体电融合可分为两个过程, 首先是原生质体在交流电场中彼此接触并排成串,
然后在直流脉冲下, 部分彼此接触的原生质体发生融合。由于本试验中不结球白菜保持系
子叶含有明显的叶绿体而区别于白色的 OguCMS下胚轴原生质体, 易于在显微镜下精确地
研究融合条件。
1. 3 融合产物的培养
融合产物与等量的 2倍 KM8P1 培养基混合后, 进行液体浅层培养和包埋培养, 60 h
左右进行第一次分裂, 前 2周为暗培养, 之后于散射光下培养, 1个月后获得肉眼可见的
愈伤组织, 并将其增殖, 转移到分化培养基中分化出不定芽。不定芽生根后形成完整幼
苗, 经炼苗后转移到盆钵中栽培。
5336 期 侯喜林等: 原生质体非对称电融合获得不结球白菜胞质杂种
2 结果与分析
2. 1 不同交流场强和频率对细胞成串及融合率的影响
从表 1可以看出, 交流场强直接影响到原生质体的成串效果和融合频率, 当场强低于
10 V/ cm时, 原生质体不能成串。场强为 20 V/ cm, 原生质体串长最大; 以后随着场强的
增大, 串长降低。交流场强为 20 V/ cm时 (交流频率为 1500 kHz) 可得到最大的 1对 1融
合频率 ( 28. 6 %) , 而此时的原生质体平均成串为 18个细胞。
表1表明, 随着交流电场的频率升高, 原生质体成串变得容易, 串长也明显增加。当
交流频率为1500 kHz, 融合频率达最高 ( 26. 4% )。
表 1 不同交流场强和交流频率对原生质体融合的影响
Table 1 Effects of different alternating current field intensity and frequency on the cell fusion
交流场强
Alternating current
f ield intensity (V/ cm)
成串细胞数
No. of cells
融合率
Fusion rate ( % )
交流频率
Alternat ing current
field frequency ( kHz)
成串细胞数
No. of cells
融合率
Fusion rate ( % )
5 0 0 100 0 0
10 6 9. 4 500 5 11. 2
20 18 28. 6 1000 9 16. 7
30 10 16. 9 1500 16 26. 4
40 5 8. 2 2000 7 21. 6
2. 2 不同直流场强和幅宽对细胞融合率及植板率的影响
在所有电场参数中, 直流脉冲场强对原生质体融合的影响最为直接。表 2表明, 随着
场强的增大 ( 50~ 200 V/ cm) , 融合频率和植板率不断上升, 但场强达到 250 V/ cm后则开
始下降, 当场强达 300 V/ cm时, 原生质体就出现破碎现象。可见, 融合频率以 200 V/ cm
时最高 ( 21. 4 %)。在本试验中, 场强为50~ 100 V/ cm时细胞融合率和植板率都很低, 说
明直流场强不宜低于 100 V/ cm。西尾刚#10∃在甘蓝与白菜的细胞融合中也观察到类似结果。
直流脉冲的幅宽代表了高压直流脉冲作用于原生质体上时间的相对长短。幅宽的增加
能显著提高原生质体融合频率, 在 1500 kHz, 20 V/ cm 的交流电场和 200 V/ cm 的直流场
强下, 幅宽从 10s升到 40 s, 融合频率不再升高, 植板率略有增加, 但 50 s的直流幅
宽能引起原生质体破碎 (表 2)。本试验中最适直流幅宽为 40 s, 处理时间太短, 则影响
细胞相互靠近, 从而影响细胞融合率#11∃。
表 2 不同直流场强和直流幅宽对融合的影响
Table 2 Effects of different direct current intensi ty and pulse width on the cell fusion
直流场强
Direct current
intensity ( V/ cm)
融合率
Fusion rate ( % )
植板率
Plating
efficiency ( % )
直流幅宽
Direct current
pulse width ( s)
融合率
Fusion rate ( % )
植板率
Plating
efficiency ( %)
50 6. 3 4. 2 5 10. 2 5. 8
100 10. 6 8. 2 10 21. 6 16. 3
150 16. 7 19. 6 20 20. 3 16. 6
200 21. 4 18. 4 30 20. 8 17. 3
250 13. 6 6. 6 40 21. 4 16. 9
300 3. 2 0 50 2. 6 0
534 园 艺 学 报 28卷
2. 3 不同脉冲次数对细胞融合率及活力的
影响
不同的直流场强下, 脉冲次数对融合有
一定的影响, 低场强下, 重复电击有助于融
合频率的升高。表 3 表明, 当直流场强为
200 V/cm, 3 次脉冲处理, 其细胞融合率
(18. 6 %) 及植板率均较高 ( 13. 8 %) , 说
明脉冲强度与脉冲次数达成最佳组合, 有利
于提高融合效率。
表 3 脉冲次数对融合率和植板率的影响
Table 3 Effects of direct pulse number on
cell fusion and plating efficiency
脉冲次数
Pulse number
融合率
Fusion rate ( % )
植板率
Plat ing eff iciency ( % )
1 4. 1 4. 6
2 10. 6 13. 4
3 18. 6 13. 8
4 12. 3 7. 6
注:直流场强为 200 V/ cm。
Note: The direct current intensity was 200 V/ cm.
2. 4 融合产物培养和愈伤组织的形成及植株再生
本研究用 2种方法对融合产物进行培养。但液体浅层培养未获得再生植株, 这可能是
由于培养密度低而带来的结果。用 KM8P1 附加2, 4D 0. 5 mg/ L+ NAA 1. 0 mg/ L+ 6BA
0. 25mg/ L培养基进行包埋培养, 获得了 383块小愈伤组织, 愈伤组织增殖后转移到 MS+
6BA 10. 0 mg/ L+ NAA 0. 3 mg/ L分化培养基上, 其中 32块分化出不定芽, 形成完整再生
植株 20株。经驯化后, 在温室盆钵中栽培, 成活 8 株, 编号为 ZS1~ 8, 其中 3 株不育
( ZS2、ZS6、ZS8) , 5株可育。ZS2、ZS6、ZS8 3株不育株, 在套袋隔离条件下, 用保持系的
花粉授粉, 分别收获种子。另 5株可育株, 采用自交和成对交方法, 分别留种。
表 4 细胞融合再生植株后代的田间表现
Table 4 The characters in field of the regenerated plants from cell fusion
再生株编号
No. of plant
调查株数
Total number
田间表现
Charaters in field
ZS1 56 全部可育, 不黄化, 蜜腺正常
All fertile, no chlorosis, with normal nectary
ZS2 (A) 15 全部不育, 均不黄化, 无蜜腺
All sterile, no chlorosis, no nectary
ZS3 28 全部可育, 不黄化, 蜜腺正常
All fertile, no chlorosis, with normal nectary
ZS4 14 全部可育, 不黄化, 蜜腺正常
All fertile, no chlorosis, with normal nectary
ZS5 10 全部可育, 不黄化, 蜜腺正常
All fertile, no chlorosis, with normal nectary
ZS6 (A) 10 全部不育, 均不黄化, 花药、蜜腺有性状分离。其中 6株的花药为花瓣状
(原始型)、无蜜腺; 另 4株花药退化正常, 不育度、不育率均为 100% ,
2株无蜜腺, 2株具 4个发达的蜜腺。
All sterile, no chlorosis, with seperated charaters of anther and nectary.
Six plants with widetype anther and no nectary. Other four plants with
degenerated anther and 100% sterile degree and sterile rate. Among them
two having no nectary and the other two having four developed nectary.
ZS7 5 全部可育, 不黄化, 蜜腺正常
All fertile, no chlorosis, with normal nectary
ZS8 (A) 3 全部不育, 均不黄化, 无蜜腺
All sterile, no chlorosis, no nectary
保持系 ( CK 1) 30 全部可育, 不黄化, 蜜腺正常
The maintainer line Al l fertile, no chlorosis, with normal nectary
OguCMS ( CK2) 30 全部可育, 叶片黄化, 无蜜腺
All fertile, chlorosis, no nectary
5356 期 侯喜林等: 原生质体非对称电融合获得不结球白菜胞质杂种
2. 5 细胞融合再生植株后代的主要性状表现
表4表明, 5株细胞融合再生出的可育株后代均表现可育, 低温下不黄化, 蜜腺正
常, 与保持系完全一致, 在本研究中无利用价值。ZS2( A) 和 ZS8 ( A) 后代全部不育, 虽
叶片不黄化, 但均无蜜腺, 也无利用价值。只有 ZS6( A) 后代中的 2株 (完全不育、低温
下叶片不黄化、有蜜腺) 有利用价值, 编号分别为 ZS6( A) 3和 ZS6( A ) 10; ZS6( A) 3 全株共
调查了360朵花, 全部有 4个蜜腺, ZS6( A) 10共调查了 267朵花, 也全部有 4个蜜腺。将
ZS6( A) 3 和 ZS6(A) 10分别套袋隔离, 用保持系的花粉继续授粉, 单株收获种子, 供进一步
进行细胞质鉴定用。
3 讨论
本试验统计的细胞融合率, 包括了 2个以上细胞的融合, 在体细胞杂交中, 希望得到
两个不同材料来源细胞的融合, 再生植株才可称为体细胞杂种植株。试验中统计的融合率
实际上也包括了同一材料来源的细胞融合, 而且有些细胞融合后不久就产生破裂, 因而与
实际融合率有一定差异。
因本试验中 OguCMS不育材料的种子采用暗培养, 故下胚轴原生质体中没有叶绿体,
而保持系材料的种子采用光照培养, 则子叶原生质体中含有较多的叶绿体。在电融合过程
中, 利用上述两者之间的差异, 显微镜下很容易区别开 OguCMS自体融合 (两个细胞均无
叶绿体)、保持系自体融合 (两个细胞均有叶绿体) 和双亲融合 (一个细胞有叶绿体, 另
一个细胞不含叶绿体)。本试验未将双亲融合的细胞挑选出来进行单独培养, 是由于双亲
细胞在融合前分别进行了60Co 照射和 R6G处理, 细胞再生能力受到很大影响, 如果再将
融合后的双亲细胞挑选出来 (挑选细胞的过程对其细胞再生能力伤害很大) 进行培养, 植
株再生率极低, 几乎为零。
从育种角度来讲, 在进行体细胞杂交时需注意: )有目的地选择亲本材料和多注意选
择近缘种间的原生质体融合, 这样易于得到具有所期望优良性状的杂种后代; ∗不仅要利
用对称的体细胞杂种, 而且要特别重视利用不对称杂种和胞质杂种。因为不对称杂种只是
DNA重组没有额外的染色体, 胞质杂种避免了胞质基因供方的野生性状进入杂种, 其遗
传性状稳定地遗传, 是最有希望成为能直接用于育种的简便、有效途径。体细胞杂交可以
实现有用性状的转移, 这已被无数次试验所证明, 但野生种某些劣质性能在杂种中也得到
表现, 如烟草叶难变黄、烟叶烤后色泽暗、烟叶蛋白质含量偏高等#12∃, 通过回交就可以
避免这些性状的出现。
在进行植物原生质体融合研究中, 过去往往只重视得到再生植株, 至于再生植株的数
量, 是否获得后代重视不够, 并且忽视再生植株后代的观察和育种上的应用。因此, 应提
倡生物技术同常规育种相结合, 取长补短, 充分利用宝贵的再生植株为育种工作服务。
形态学特征是判断所获得的体细胞杂种植株是否有利用价值的最基本而又最重要的指
标; 细胞染色体数目结合形态学特征可以可靠地证明融合产物的杂种本质; 同工酶的电泳
带型多态性分析是鉴定种内体细胞杂种的常规方法; 近年来发展起来的分子生物学鉴定手
段, 使鉴定技术更加先进、可靠。对本研究获得的胞质杂种的分子、细胞及生化分析鉴定
将在其后代中继续进行。
536 园 艺 学 报 28卷
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Synthesis of Cytoplasm Hybrid of Nonheading Chinese Cabbage
through Asymmetric Electric Fusion of Protoplast Cell
Hou Xilin1, Cao Shouchun2, She Jianming3, and Lu Weizhong3
( 1State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement , Nanj ing Agricultural University , Nanjing 210095;
2College of Horticulture, Nanj ing Agricultural University , Nanj ing 210095; 3I nstitute of Genetics and Physiology , Jiangsu
Agricultural Academic Sciences , Nanjing 210014)
Abstract: The effects of different electric fields on the asymmetrical cell fusion of nonheading
Chinese cabbage was studied by using OguCMS 91Hqiu100 ( sterile line) and 91Hqiu21 (maintain
er line) as materials. The best electric field for electric fusion was as follows: alternating current field
intensity ( 20V/ cm ) , alternating current frequency ( 1500 kHz) , direct current intensity ( 200 V/
cm) , direct current pulse width ( 40 s) , direct pulse number ( 3 t imes) . The product of the fusion
was embedded and cultured on KM8P1medium. 383 calli were obtained. Of these calli, 32 shoots dif
ferentiated and 20 plantlets developed. 8 plantlets were successfully transplanted after acclimatization.
Three of the plants were sterile. They set seeds after pollination with the maintainer pollen. Molecular,
celluar and biochemistry analysis will be made on their progeny.
Key words: Nonheading Chinese cabbage; Electrofusion; Regenerated plantlet ; Cytoplasm hy
brid
5376 期 侯喜林等: 原生质体非对称电融合获得不结球白菜胞质杂种