全 文 ：性 , 即新生血管形成与肿瘤的转移倾向呈正相关。因此 , 抑制肿
瘤血管生成已成为近年来控制肿瘤生长和抗肿瘤转移研究中的
热点之一。
图 1　复方红豆杉胶囊对 CAM血管形态的影响
表 2　复方红豆杉胶囊对 CAM血管生成的影响( x±s)
组别 n 一级血管数(根) 二级血管数(根)
生理盐水 10 24.2±3.77 49.8±4.66
空白血清 11 27.9±4.44 52.6±3.83
硫酸鱼精蛋白 10 14.8±4.44＊＊＊■■■ 25.5±3.37＊＊＊■■■
复方红豆杉胶囊低剂量 10 17.5±4.82＊＊■■■ 33.7±5.52＊＊＊■■■
复方红豆杉胶囊高剂量 12 15.3±3.52＊＊＊■■■ 27.8±4.27＊＊＊■■■
　　与生理盐水组比较 , ＊＊P<0.01 , ＊＊＊P<0.001;与空白血清组比较 , ■■P<
0.01, ■■■P<0.001
复方红豆杉胶囊由红豆杉 、红参 、甘草三味中药组成。红豆
杉的提取物紫杉醇是治疗转移性卵巢癌和乳腺癌的有效药物之
一。研究表明紫杉醇对血管生成有很强的抑制效应 ,证实紫杉醇
是一种血管生成抑制因子 [ 4] 。紫杉醇能够明显抑制裸鼠肝癌的
血管生成 , 是一种极其有效的化疗药物 [ 5] 。其作用机理可能是
通过与微量蛋白结合 ,促进其聚合 , 抑制细胞的有丝分裂 ,有效地
阻止肿瘤细胞的增殖。红参是人参的加工品之一 ,其主要抗肿瘤
成分是人参皂苷。人参皂苷 Rg3可以对 CAM血管生成有显著的
抑制作用 [ 6] 。人参皂苷 Rg3联合紫杉醇为主化疗具有协同抗肿
瘤作用 ,尤其在稳定肿瘤方面优势明显 [ 7] 。 人参皂苷 Rg3可能
通过抑制碱性成纤维细胞生长因子的产生 ,以抑制肿瘤血管的生
成 , 也可诱导肿瘤细胞凋亡 ,抑制肿瘤生长 [ 8] 。甘草性平 , 味甘 ,
归十二经 ,有解毒 、祛痰 、止痛 、抗癌等药理作用。现代研究表明 ,
甘草酸 、甘草黄酮对宫颈癌 、乳腺癌 、胃癌 、肝癌有抑制其增殖作
用 [ 9] 。其抗肿瘤的可能机制为通过增加免疫细胞数量来抑制肿
瘤的生长 ,但未见有抑制血管生成的报道。三药联合应用 , 抑制
血管生成 ,增强免疫力。本实验研究通过观察复方红豆杉胶囊对
CAM模型血管生成的影响 , 证明了复方红豆杉胶囊具有明显的
抑制新生血管的生成 ,间接证明了其对恶性肿瘤的治疗作用 , 相
关机制尚有待进一步探讨。
参考文献:
[ 1 ] 　谭永忠 ,李　静 ,李忠友 ,等.复方红豆杉胶囊治疗中晚期恶性肿瘤
临床观察 [ J] .重庆医学 , 2002, 31(6):525.
[ 2 ] 　刘琳琳 ,胡志敏.复方红豆杉胶囊配合肺积消 1号方治疗老年晚期
肺癌 32例 [ J] .实用中医内科杂志 , 2008, 22(3):23.
[ 3 ] 　滕红丽 ,李珪 ,钟　鸣 ,等.复方红豆杉胶囊治疗肝癌 60例临床研
究 [ J] .中医杂志, 2006, 47(4):277.
[ 4 ] 　阎家族 ,王　悦.紫杉醇抑制血管生成的研究 [ J] .药物生物技术 ,
2001, 8(1):30.
[ 5 ] 　许　俊 ,刘志苏 ,张中林.紫杉醇对裸鼠人肝癌血管生成和肿瘤生
长 、转移作用 [ J].武汉大学学报 , 2005, 26(4):449.
[ 6 ] 　耿怀成 , 陈龙帮 ,楮晓源.人参皂苷 Rg3抗血管形成作用的实验研
究 [ J] .医学研究生学报 , 2001, 14(4):193.
[ 7 ] 　袁国荣 ,叶再元.中药血管抑制剂人参皂苷 Rg3联合紫杉醇治疗胃
癌术后肝转移的研究 [ J].中华中医药学刊 , 2008, 26(4):884.
[ 8 ] 　张　荣 ,赵　翌 ,刘基巍 ,等.人参皂苷 Rg3诱导小鼠肝癌细胞凋亡
及抑制肿瘤血管内皮生长因子生成的研究 [ J] .时珍国医国药 ,
2007, 18(1):130.
[ 9 ] 　马　淼 ,周旭莉 ,户元林 ,等.乌拉甘草有效成分对人体 4种肿瘤细
胞增殖与凋亡的影响 [ J].时珍国医国药 , 2008, 19(1):9.
收稿日期:2009-12-25;　修订日期:2010-02-08
作者简介:李丽波(1975-),女(汉族),吉林敦化人 ,现任齐齐哈尔医学院
讲师 ,博士学位 ,主要从事药物代谢研究工作.
蹄叶橐吾乙醇提取物对肝细胞色素 P450的影响
李丽波 , 孙　超 , 王玉春
(齐齐哈尔医学院 ,黑龙江 齐齐哈尔　161006)
摘要:目的 研究蹄叶橐吾乙醇提取物对大鼠和小鼠肝细胞色素 P450(CYP450)的影响。方法 蹄叶橐吾乙醇提取物口
服给药后 , 观察其对小鼠戊巴比妥钠催眠作用的影响 、对大鼠肝微粒体 CYP450含量 、肝脏指数的影响 ,采用 HPLC测定
探针药的代谢率观察其对大鼠肝 CYP450的 7种亚型酶活性的影响。结果 蹄叶橐吾乙醇提取物对戊巴比妥钠诱导小鼠
的睡眠时间无影响 , 大鼠肝 CYP450含量及肝脏指数无显著变化 , 对大鼠肝 CYP450的 7种亚型探针药的代谢率亦无影
响。结论 蹄叶橐吾乙醇提取物对肝药酶无诱导作用。
关键词:蹄叶橐吾;　肝细胞色素 P450;　诱导作用
中图分类号:R962　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)05-1262-03
　　细胞色素 P450(cytochromeP450, CYP450)是生物体内参与
各类外源性及内源性物质代谢的主要酶系 , 负责 90%以上药物
的生物转化。 CYP450的活性可受到多种因素的影响。近年来 ,
由于药物代谢性相互作用诱发的不良反应日渐引起人们的重视。
但有关中草药对 CYP450影响作用的报道尚不多见。蹄叶橐吾
(Ligulariafischeri)为菊科(Compasitae)橐吾属(Ligularia)多年生
草本植物 , 又名肾叶橐吾(《中药志》)、马蹄叶(东北)等 , 其根和
根茎收入吉林省药材标准 , 名山紫菀 [ 1] 。 药理研究表明 , 其根和
根茎具有镇咳祛痰作用 [ 2] , 叶的提取物具有抗氧化作用 [ 3 , 4] , 地
上部分乙醇提取物具有抗炎免疫 [ 5 , 6]和抗溃疡作用 [ 7] 。 且蹄叶
·1262·
时珍国医国药 2010年第 21卷第 5期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.5
橐吾的安全性较高 [ 8 , 9] 。本实验通过研究蹄叶橐吾地上部分乙
醇提取物对肝 CYP450的影响 , 预测其在联合用药时可能会产生
的代谢性相互作用 , 对蹄叶橐吾临床合理用药提供科学依据。
1　材料与仪器
1.1　药品 蹄叶橐吾(野生)在吉林省珲春市采集 , 由延边大学
药学院刘永镇教授鉴定。蹄叶橐吾地上部分乙醇提取物(ethanol
extractfromLigulariafischeri, 以下简写为 Lfe)的制备:蹄叶橐吾
地上部分晾干 、粉碎 , 用 95%乙醇加热回流提取 , 滤液加水放置
24 h,过滤后用石油醚萃取 , 水层加热浓缩至浸膏 ,每克相当于 20
g生药 ,实验用其水溶液灌胃给药。
1.2　试剂 非那西汀(phenacetin), 双氯酚酸(Diclofenac), 奥美
拉唑(Omeprazole), 氢溴酸右美沙芬(DextromethorphanHydrobro-
mide),氯唑沙宗(Chlorzoxazone),氨苯砜(Dapsone, aminophenyl-
sulfone)均购于中国药品生物制品检定所 , 香豆素(Coumarin)购
于沈阳市试剂三厂(化学纯)。葡萄糖 -6 -磷酸(D-Glucose6
-phosphatedisodiumsalthydrate)、氧化型辅酶Ⅱ (β -Nicotinam-
ideadeninedinucleotidephosphatesodiumsalthydrate, β -NADP)
和葡萄糖 -6 -磷酸脱氢酶(Glucose-6 -phosphateDehydrogen-
ase)购于 sigma公司。戊巴比妥钠 , Serva进口分装(上海化学试
剂分装厂)。 HPLC级甲醇 、乙腈购于美国 Fisher公司。
1.3　仪器 美国 ThermoFinnigansurveyor高效液相色谱仪(配有
四元泵 、自动进样器 、二极管阵列检测器);Xcalibur1.4色谱工作
站;AgilentXDB-C18色谱柱(4.6mm×250 mm, 5μm);日本岛津
ShimadzuUV-260紫外可见光分光光度计;MQX-200酶标仪
(美国 Bio-TekInstrumentsInc.);EYELA旋转蒸发仪(N-1000
SD-2000);BECKMAN公司高速冷冻离心机;2K-15型高速离
心机(Sigma);YKH-3型液体快速混合器(江西医疗器械厂);瑞
士 METLERTOLEDO公司 AG135型电子天平。
1.4　动物 昆明种雄性小鼠 , 体质量(20 ±2)g;Wistar雄性大
鼠 , 体质量(210±10)g。购于北京维通利华实验动物技术有限
公司 , 许可证编号:SCXK(京)2006-0009。
2　方法
2.1　Lfe对小鼠戊巴比妥钠催眠作用的影响 小鼠随机分为两
组 , 每组 10只。药物组灌胃(ig)给予 Lfe250 mg· kg-1 , 对照组
ig同体积生理盐水 , 1次 /d, 连续 3d。末次给药后 24 h各组小鼠
均腹腔注射(ip)戊巴比妥钠 50mg· kg-1。室温 22 ～ 25℃, ip戊
巴比妥钠的时间在上午 9时左右。 观察小鼠的睡眠时间(从翻
正反射消失至恢复的间隔时间)。
2.2　Lfe对大鼠 CYP450含量及各亚型酶活性的影响 大鼠随机
分为 2组 , 每组 8只。药物组灌胃给予 Lfe250 mg· kg-1 , 对照
组 ig同体积生理盐水 , 1次 /d,连续 3 d。
2.2.1　大鼠肝微粒体的制备 末次给药后 24 h将大鼠处死 , 采
用差速离心法制备肝微粒体。取肝脏 , 漂洗 、吸干 、称重后剪碎 ,
按 1∶3(W/V)比例加入 TMS缓冲液(含 0.05mol· L-1 Tris, 3
mmol· L-1 MgCl2 , 0.2 mol· L-1蔗糖 , pH 7.4)匀浆后于 4℃, 10
000g, 离心 30 min, 取上清液转移至超速离心管内 , 4 ℃离心 ,
100 000 g, 60 min,沉淀即为肝微粒体。重悬后分装 ,置 -80℃冰
箱内保存备用。微粒体蛋白浓度采用 Bradford法测定 [ 10] 。
2.2.2　CYP450含量及肝脏指数的测定 采用 Omura和 Sato的
方法测定 CYP450含量 [ 11] 。 P450(nmol· mg-1蛋白) =[ Δ A
(450 nm -490nm)×1000] /91×蛋白浓度(mg· ml-1)。计算肝脏指
数 , 肝脏指数(g/100g体质量)=(肝重 /体质量)×100%。
2.2.3　肝微粒体体外温孵实验 将 Lfe给药组 8只大鼠的微粒
体蛋白稀释至相同浓度后等体积混合 ,分装至各管。对照组大鼠
微粒体亦作相同处理 。将探针药香豆素(CYP2A6底物)、右美沙
芬(CYP2D6 底物)、双氯酚酸 (CYP2C9 底 物)、奥美拉 唑
(CYP2C19底物)、氨苯砜(CYP3A4底物)、非那西汀(CYP1A2底
物)、氯唑沙宗(CYP2E1底物)分别与给药组或对照组大鼠的肝
微粒体于 37℃温孵。以 pH7.4的 Tris-Hcl缓冲液 0.5 ml为总
反应体系 ,其中肝微粒体蛋白浓度 1 mg· ml-1 , NADPH生成系
统(NADP1 mmol· L-1 ,葡萄糖 -6-磷酸 10mmol· L-1 , 葡萄糖
-6-磷酸脱氢酶 1U· ml-1), MgCl2 4 mmol· L-1。探针药浓度
及温孵时间见表 1。反应体系中有机溶剂终浓度不超过 0.5%
(V/V)。
表 1　各探针药浓度 、温孵时间及色谱条件
探
针
探针浓度 /
μmol·L-1
温孵时间 /
min 流动相
流速 /
ml· min-1
检测波
长 /nm
柱温 /
℃
香豆素 10 10 乙腈-水(60∶40) 0.8 249 30
右美
沙芬 4 5
乙腈-水(35∶65)
(含 0.02mol·L-1
KH
2
PO
4
, 0.1%三乙
胺 , H3PO4调pH3.4)
0.8 202 30
双氯
酚酸 4 5
甲醇-水(75∶25)
(含 0.5%HAC) 0.8 276 25
奥美
拉唑 10 5
乙腈 -水(32∶68)
(含 0.05 mol· L-1
NH4Ac)
1.0 301 25
氨苯
砜 10 20
乙腈 -水(30∶70)
(含 0.02mol·L-1 1.0 294 30
非那
西汀 6 20
KH2PO4和 0.02 mol
· L-1三乙胺, H3PO4
调
248 30
氯唑
沙宗 6 20 pH6.5) 281 30
2.2.4　肝微粒体温孵样品的处理及 HPLC测定 各反应管温孵
一定时间后加入 3 mL甲醇终止反应 ,涡旋振荡 1min,离心 , 取上
清 3 mL, 35℃减压蒸干 ,残渣用 100μl流动相复溶 ,离心 10 000 r
· min-1 , 10 min, 取上清 , 进样 20 μl。应用 HPLC测定上述探针
药的代谢率 ,与对照组比较 , 以反映 Lfe对上述 CYP450各亚型是
否有诱导作用。其中氨苯砜 , 非那西汀 , 氯唑沙宗的测定采用
“鸡尾酒”(cocktail)法。
2.3　统计处理 实验结果以 x±s表示 , 采用 SPSS13.0统计软件
进行方差分析。
3　结果
3.1　Lfe对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响 与对照组相
比 , Lfe连续给药 3 d,戊巴比妥钠诱导小鼠的睡眠时间无显著性差
异(P>0.05),表明 Lfe对小鼠肝药酶无诱导作用。结果见表 2。
表 2　Lfe对戊巴比妥钠诱导
小鼠睡眠时间的影响( x±s) min
组别 睡眠时间
对照 25.6±5.2
给药 24.7±4.9＊
　　与对照组相比 , ＊P>0.05;n=10
3.2　Lfe对大鼠肝 CYP450含量及肝脏指数的影响 结果显示 ,
Lfe连续给药 3d后 , 大鼠 CYP450含量及肝脏指数与对照组相比
均无显著性差异(P>0.05), 表明 Lfe对大鼠 CYP450无诱导作
用。结果见表 3。
3.3　Lfe对大鼠 CYP450各亚型酶活性的影响
3.3.1　色谱行为 如图 1所示 ,在选定的 HPLC条件下各探针药
峰形较好 , 肝微粒体内源性物质对其测定无干扰 , 可作为各探针
·1263·
LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.5 时珍国医国药 2010年第 21卷第 5期
药定量分析的条件。
表 3　Lfe对大鼠肝 CYP450含量及肝脏指数的影响( x±s)
组别 CYP450含量 /nmol· mg-1蛋白 肝脏指数(%)
对照 0.93±0.22 3.18±0.46
给药 1.01±0.26＊ 3.09±0.37＊
　　与对照组相比 , ＊P>0.05;n=8
3.3.2　各探针药代谢率的测定结果 结果表明 , Lfe口服给药 3
次后 CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, 3A4, 2A6等 7种 CYP450
亚型特异性底物的代谢率与对照组相比均无显著性差异 , 表明
Lfe对上述 7种 CYP450亚型酶无诱导作用。结果见图 2。与表 3
结果 -Lfe对 CYP450含量及肝脏指数无明显影响相一致。
1.香豆素　2.右美沙芬　 3.双氯酚酸　4.奥美拉唑
5.氨苯砜　6.非那西汀　 7.氯唑沙宗
图 1　7种探针药的HPLC图
Lfe给药组各探针药的代谢率与对照组相比 , P>0.05
图 2　Lfe对大鼠 CYP450各亚型酶活性的影响
4　讨论
药物相互作用最常见的原因是 CYP450的诱导和抑制。 药
酶的诱导可增加生物转化率 ,从而降低药物浓度 , 使药效减弱 , 如
果代谢形成活性产物则会增强药物的作用或毒性。在药物代谢
性相互作用中 ,酶诱导引起的相互作用约占 23%, 因此揭示蹄叶
橐吾地上部分乙醇提取物(Lfe)对肝 CYP450的影响对于其临床
合理用药具有重要意义。
为了解 Lfe是否存在潜在的代谢性相互作用 ,本实验观察了
Lfe对药物代谢酶 CYP450的影响。戊巴比妥钠由肝脏代谢 , 其
诱导小鼠睡眠时间的长短可反映肝药酶的活性。以戊巴比妥钠
诱导小鼠的睡眠时间作为观测肝药酶体内活性变化的生物学指
标 , 并利用整体动物多次给予 Lfe后肝微粒体 CYP450含量 、肝脏
指数 、肝 CYP450酶活性的变化观察其对 CYP450酶是否有诱导
作用。
Lfe250 mg· kg-1连续给药 3 d, 对戊巴比妥钠诱导小鼠的
睡眠时间无影响 , 间接提示 Lfe对小鼠肝药酶无诱导作用。 Lfe
250 mg· kg-1连续给药 3 d后 ,大鼠肝 CYP450总量和肝脏指数
无显著变化 ,提示 Lfe对大鼠肝药酶无诱导作用。但上述作用是
否系 Lfe对 CYP450多种亚型酶诱导和抑制作用的综合结果尚不
能确定 。因此 , 我们进一步研究了 Lfe对 CYP450多种亚型酶活
性的影响 ,主要是 7种参与临床常用药物代谢的 CYP450同工
酶。研究结果显示 , 大鼠连续口服 Lfe后的肝微粒体对 CYP1A2,
2C9, 2C19, 2D6, 2E1, 3A4, 2A6等 7种亚型酶的特异性探针药的
代谢率均无影响 ,表明 Lfe对上述 7种 CYP450亚型酶活性均无
明显影响。综合上述结果 , Lfe对肝药酶无诱导作用。提示在将
来临床试用时与同服的其他药物可能不致会因肝药酶的诱导作
用而影响有关药物的药效或毒性。关于 Lfe对肝 CYP450是否具
有抑制作用尚需进一步实验证实。
参考文献:
[ 1 ] 　吉林省卫生局.吉林省药品标准 [ S] , 1997:238.
[ 2 ] 　李　茁 ,樊变兰 ,于庆海 , 等.山紫菀与紫菀镇咳祛痰作用的实验
研究 [ J] .沈阳药学院学报 , 1987, 4(2):136.
[ 3 ] 　ChoiEM.Ligulariafischerileafextractpreventstheoxidativestressin
DBA/1JmicewithtypeIcolagen-inducedarthritis[ J] .Journalof
AppliedToxicology, 2007, 27(2):176.
[ 4 ] 　洪承权 ,秘效媛 , 朴香兰 ,等.蹄叶橐吾抗氧化作用研究 [ J] .中央
民族大学学报(自然科学版), 2009, 18(1):14.
[ 5 ] 　李丽波 ,王玉祥 ,孙连平 , 等.蹄叶橐吾乙醇提取物抗炎作用的实
验研究 [ J] .中国中医药科技 , 2004, 11(5):285.
[ 6 ] 　李丽波 , 王玉祥.蹄叶橐吾乙醇提取物对小鼠免疫功能的影响
[ J] .齐齐哈尔医学院学报 , 2009, 30(16):1953.
[ 7 ] 　曲香芝 , 于海玲.蹄叶橐吾乙醇提取物抗溃疡作用研究 [ J] .时珍
国医国药 , 2006, 17(7):1190.
[ 8 ] 　赵显国 ,王峥涛 ,林鸽 ,等.山紫菀类药材的原植物及其毒性考证
[ J] .中国中药杂志 , 1998, 23(3):131.
[ 9 ] 　李丽波.蹄叶橐吾的研究进展 [ J] .中国野生植物资源 , 2001, 20
(1):8.
[ 10]　BradfordMM.Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmi-
crogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dye
binding[ J] .AnalBiochem.1976, 72:248.
[ 11]　OmuraT, SatoR.Thecarbonmonoxide-bindingpigmentoflivermi-
crosomes.Ⅰ .Evidenceforitshemoproteinnature[ J].JBiolChem,
1964, 239(7):2370.
·1264·
时珍国医国药 2010年第 21卷第 5期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2010VOL.21NO.5