全 文 ：Vol． 34 高 等 学 校 化 学 学 报 No． 5
2013 年 5 月 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 1067 ～ 1071
doi:10． 7503 /cjcu20130107
UPLC-MS /MS结合多探针底物方法研究
刺五加叶中黄酮苷类成分对 CYP450 活性的影响%
毕云枫1，2，朱洪彬1，皮子凤1，刘志强1，宋凤瑞1
(1． 中国科学院长春应用化学研究所化学生物学实验室，长春质谱中心，长春 130022;
2． 吉林农业大学食品科学与工程学院，长春 130118)
摘要 利用超高效液相色谱-串联质谱联用(UPLC-MS /MS)的多反应监测(MRM)技术结合多探针底物方法，
研究了刺五加叶中的主要黄酮苷类化合物槲皮苷、金丝桃苷及芦丁对肝细胞色素 P450 酶(CYP450)亚型
CYP1A2，CYP2C，CYP2E1，CYP2D和 CYP3A活性的影响． 结果表明，3 种化合物对各 CYP亚型酶均有抑制
作用，其中金丝桃苷和槲皮苷对 CYP1A2 催化的非那西丁的 O-脱乙基反应抑制的 IC50值分别为 46. 53 和
49. 75 μmol /L，金丝桃苷和芦丁对 CYP2E1 催化的氯唑沙宗的 6-羟基化反应抑制的 IC50值分别为 99. 87 和
86. 36 μmol /L． 机理性抑制实验结果表明，3 种化合物对 2 种亚型酶的抑制作用是随着预孵时间延长而增强
的机理性抑制．
关键词 刺五加叶;黄酮苷;肝细胞色素 P450 酶(CYP450) ;超高效液相色谱-串联质谱联用
中图分类号 O657． 6 文献标志码 A
收稿日期:2013-01-30．
基金项目:国家自然科学基金(批准号:81073040)及国家博士后基金(批准号:2011M500625)资助．
联系人简介:宋凤瑞，女，博士，研究员，博士生导师，主要从事天然产物质谱及代谢方面的研究． E-mail:songfr@ ciac． jl． cn
刺五加 Acanthopanax senticosus(Rupr． et Maxim．)Harms来源于五加科五加属，广泛分布于黑龙江、
吉林地区的长白山脉和小兴安岭等地区，其主要活性成分为黄酮和皂苷类化合物，其中槲皮苷、金丝
桃苷和芦丁是刺五加叶中含有的主要黄酮苷类成分［1］． 刺五加具有益气健脾和补肾安神等功能，临床
常用于治疗脾肾阳虚、体虚乏力、食欲不振、腰膝酸痛及失眠多梦等症［2］． 研究［3］证明，药物代谢酶
与药物之间的作用是其药代动力学参数改变的最主要原因． 由于肝细胞色素 P450 酶(CYP450)是代谢
酶中最为重要的酶系，药物对 CYP450 活性的影响是导致药物相互作用的主要机制． 因此，研究药物
对 CYP450 活性的影响对于预测药物在人体内的代谢和清除率以及在临床上发生药物相互作用的可能
性均具有重要意义［4］． 中药成分复杂，许多成分的作用机制尚不明确． 临床上也常有一些不良反应的
报道，这些不良反应不仅来自中药本身的毒性，还来自于其对药物代谢酶活性的影响所导致的药物相
互作用，目前还缺乏此方面深入系统的研究数据． 多探针底物(N in one或 Cocktail)方法是近年来发展
的体内确定药物与 CYP450 作用的分析方法［5］，已发展成为一种可同时检测多种 CYP450 亚型酶的体
外高通量筛选方法［6，7］． 电喷雾电离(ESI)作为软电离质谱技术，被广泛应用于生物分析及药物代谢等
研究领域［8 ～ 11］． 将特异性强、灵敏度及准确度高且重现性好的多反应监测(MRM)技术与 ESI 技术相
结合，已成为药物代谢、药代动力学及定量蛋白质组学等研究领域不可或缺的有力工具［12］． MRM 方
法是根据化合物准分子离子及特征碎片离子的质荷比，选择母离子 /子离子对，允许符合设定的母离
子进入碰撞室，碰撞完全后，只记录设定离子信号． 通过母离子和子离子的 2 次选择，可去除干扰离
子，降低化学背景，提高灵敏度［13］．
本文利用 UPLC-MS /MS的 MRM技术结合 Cocktail方法，系统研究了刺五加叶中的主要黄酮苷类
成分槲皮苷、金丝桃苷及芦丁对几种大鼠肝 CYP450 亚型酶活性的影响，对临床上刺五加与其它中药、
西药共用时可能发生的药物相互作用进行了预测，避免引起的不良反应和毒副作用，为刺五加的临床
合理用药提供科学依据．
1 实验部分
1． 1 试剂与仪器
非那西丁、氯唑沙宗、睾酮、甲苯磺胺丁脲、右美沙芬及其对应的代表性代谢产物(对乙酰氨基
酚、6-羟基氯唑沙宗、6-羟基睾酮、甲苯磺胺、去甲右美沙芬)、内标安替比林、G-6-P、G-6-PDH 及
β-NADP均购自美国 Sigma公司;乙腈、甲醇及磷酸(色谱纯)均购自美国 Fisher公司;实验用水为二次
去离子水． 金丝桃苷(批号 1521-200202)、芦丁(批号 0080-9705)和槲皮苷(批号 111538-200302)对照
品购自中国药品生物制品检定所． 实验动物清洁级雄性 SD大鼠［体重(200 ± 20)g］由吉林大学实验动
物中心提供［合格证号: (吉)2008-0005］．
Xevo-TQ三级四极杆质谱仪配备 Acquity UPLC 系统(美国 Waters 公司) ，配有 Waters Masslynx
V4． 1数据工作站;Sanorius BSl10S 分析天平(北京赛多利斯有限公司) ;Optima L-100 × P制备型超速离
心机［贝克曼库尔特实验系统(苏州)有限公司］;DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份
有限公司) ;Eppendorf 5810R型台式高速冷冻离心机(德国 Eppendorf公司) ;MDF-382E型超低温冰箱
(日本 Sanyo公司)．
1． 2 实验过程
1． 2． 1 肝微粒体的制备 在 12 h明暗交替条件下，将雄性 SD大鼠在实验环境下适应 5 d以上． 实验
前动物禁食 24 h，将所用器具和试剂置于 4 ℃下预冷． 将动物脱臼处死，迅速剪开心脏，用注射器将
4 ℃生理盐水由门静脉注入，灌洗至肝脏呈土黄色． 将肝脏剪碎，按每克肝组织 4 mL加入 TMS缓冲液
(含 0. 05 mol /L Tris-HCl，3 mmol /L MgCl2，0. 2 mol /L 蔗糖，pH = 7. 5) ，于冰浴中匀浆，再超声分散
30 s． 于 4 ℃下以 20000g 离心 20 min，将上清液用 4 层纱布过滤除去漂浮脂类物，再于 4 ℃下以
105000g离心 60 min，弃去上清液，沉淀部分即为微粒体． 按初始匀浆时每克肝组织加入 1 mL 含有
20%(体积分数)甘油的 Tris-HCl储存液(pH = 7. 5) ，重悬微粒体，冰浴，用玻璃匀浆管手动研磨，使
微粒体均匀分散后分装于 － 80 ℃下保存． 以小牛血清白蛋白为标准品，采用 Lowry 法测定微粒体的蛋
白含量［14］．
1． 2． 2 微粒体孵育反应体系 微粒体孵育采用 500 μL 酶反应体系，由 pH = 7. 4 的 100 mmol /L 磷酸
钾缓冲溶液(含 0. 5 mg /mL 微粒体蛋白) ，NADPH 生产系统［10 mmol /L 葡萄糖-6-磷酸 +
1 U /(mmol·L －1)葡糖-6-磷酸脱氢酶 + 1 mmol /L NADP + + 4 mmol /L 氯化镁］及混合探针底物
(0. 4 mmol /L甲苯磺丁脲 + 0. 02 mmol /L 右美沙芬 + 0. 6 mmol /L 氯唑沙宗 + 0. 1 mmol /L 睾酮 + 20
mmol /L非那西丁)构成［15］，于 37 ℃预孵 5 min． 孵育反应分为对照组和抑制组进行，对照组加入等体
积的水或甲醇． 抑制组分别加入终浓度分别为 100，10，1，0. 1 及 0. 01 μmol /L的芦丁、金丝桃苷和槲
皮苷(芦丁用水溶解，金丝桃苷和槲皮苷溶解于甲醇)． 于 37 ℃下孵育反应 30 min 后，加入含有内标
安替比林(终浓度 5 μmol /L)的 500 μL冰乙腈溶液终止反应，然后将孵育混合物于 12000g 下离心 30
min． 取上清液用于 UPLC-MS /MS分析［16］，每组平行进行 3 次．
1． 2． 3 机理性抑制实验 将 200 μL微粒体酶反应体系及混合探针底物分别于 37 ℃预孵 0 和 30 min
后，加入不同浓度的抑制剂于 37 ℃再反应 30 min．
1． 2． 4 UPLC-MS /MS条件 UPLC  BEH Shield RP18 色谱柱(50 mm × 2. 1 mm i． d．，1. 7 μm;美国
Waters公司) ;流动相 A为甲醇 /乙腈(体积比 1∶ 1) ，流动相 B 为含 0. 1%(体积分数)甲酸的水溶液;
洗脱条件:0 ～ 5 min，10% ～ 40% A;5 ～ 5. 5 min，40% ～ 50% A;5. 5 ～ 6 min，50% A;6 ～ 6. 5 min，
50% ～100%A;6. 5 ～ 8 min，100%A;流速 0. 3 mL /min;柱温 28 ℃ ．
质谱采用 MRM方式定量，毛细管电压 3. 0 kV，离子源温度 350 ℃，脱溶剂气(N2)流速 700 L /h，
锥孔气(N2)流速 50 L /h，碰撞气(Ar)流速 0. 15 mL /min．
1． 2． 5 统计分析 抑制率 I(%)参照文献［17］方法计算． IC50值用 GraphPad Prism v5． 0 软件拟合求
得． 对于机理性抑制实验结果，分别用配对 t检验分析预孵 0 min 组与预孵 30 min 组之间各酶的活性
差异，用统计学软件 SPSSV 13． 0 进行统计，各酶的活性变化用均值(95%置信区间)表示．
8601 高 等 学 校 化 学 学 报 Vol． 34
2 结果与讨论
2． 1 特异性底物的代表性代谢产物及内标的色谱-质谱行为
对所有探针底物的代表性代谢产物及内标进行母离子及产物离子扫描，选择丰度最大的子离子进
行 MRM监测，其中 6-羟基氯唑沙宗在采用负离子模式时其灵敏度最高，其它化合物采用正离子模式
进行检测． 各化合物的 MRM参数见表 1．
Table 1 MRM transitions and their parameters for marker metabolite of each substrate by UPLC-MS/MS
Compd． Corresponding CYP450 isozmye MRM transition(m / z) Ion mode Cone voltage /V Collision engery /eV
Antipyrine(ISTD) 189→104 ESI + 38 26
Acetaminophen CYP1A2 152→70 ESI + 28 16
Dextrorphan CYP2D 258→171 ESI + 34 36
6-Hydroxy testosterone CYP3A 305→184 ESI + 94 10
4-Hydroxy tolbutamide CYP2C 287→202 ESI + 90 32
6-Hydroxy chlorzoxazoe CYP2E1 184→120 ESI － 28 20
对混合探针底物在大鼠肝微粒体孵育后的样品进行了分析，相应代谢产物及内标的 MRM 离子流
图见图 1． 各 MRM定量离子对见表 1． 可见，安替比林、对乙酰氨基酚、6-羟基氯唑沙宗、6-羟基睾酮、
4-羟基甲苯磺胺丁脲及去甲右美沙芬的保留时间分别为 1. 85，4. 16，2. 71，4. 15，2. 94 及 3. 01 min．
Fig． 1 MRM chromatogram by UPLC-MS/MS method for marker metabolite of each substrate and
internal standard antipyrine from a normal assay sample
(A)Antipyrine(ISTD) ; (B)4-hydroxy tolbutamide(CYP2C) ; (C)acetaminophen(CYP1A2) ; (D)6-hydroxy chlorzoxazoe(CYP2E1) ;
(E)6-hydroxy testosterone(CYP3A) ; (F)dextrorphan(CYP2D)．
2． 2 刺五加叶中黄酮苷类对细胞色素 CYP450 的作用
表 2 列出了刺五加叶中黄酮苷类化合物芦丁、金丝桃苷和槲皮苷在酶反应体系中预孵 5 min 后对
Table 2 IC50 values of three flavonoides for different
CYP450 isozymes
CYP isozyme Metabolite
IC50 /(μmol·L －1)
Hyperoside Quercitrin Rutin
CYP1A2 Acetaminophen 46． 53 ± 0． 96 49． 75 ± 1． 26 ＞ 100
CYP3A 6-Hydroxy testosterone ＞ 100 ＞ 100 ＞ 100
CYP2C 4-Hydroxy tolbutamide ＞ 100 ＞ 100 ＞ 100
CYP2D Dextrorphan ＞ 100 ＞ 100 ＞ 100
CYP2E1 6-Hydroxy chlorzoxazoe 99． 87 ± 2． 39 ＞ 100 86． 36 ± 1． 82
各 CYP450 亚型酶抑制作用的 IC50值． 可
见，3 种化合物对 CYP1A2 催化的非那西
丁的 O-脱乙基反应均有抑制作用，其中金
丝桃苷和槲皮苷对 CYP1A2 抑制的 IC50值
分别为 46. 53 和 49. 75 μmol /L;而芦丁的
抑制能力最弱，IC50 ＞ 100 μmol /L． 3 种化
合物对 CYP3A，CYP2C 及 CYP2D 的抑制
能力均很弱，IC50值均大于 100 μmol /L．
而对于 CYP2E1 催化的氯唑沙宗的 6-羟基化反应，槲皮苷的抑制能力很弱，IC50 ＞ 100 μmol /L． 金丝桃
苷和芦丁对 CYP2E1 的 IC50值分别为 99. 87 和 86. 36 μmol /L，抑制能力也较弱．
将混合探针底物加入对乙酰氨基酚和 6-羟基氯唑沙宗的微粒体酶反应体系中，分别于 37 ℃预孵
0 和 30 min，然后加入不同浓度的 3 种黄酮苷类化合物，检测各化合物对特异性底物的抑制情况．
9601No． 5 毕云枫等: UPLC-MS /MS结合多探针底物方法研究……成分对 CYP450 活性的影响%
结果表明，预孵 30 min后，槲皮苷和金丝桃苷在浓度分别为 5，10，20 和 50 μmol /L时，对 CYP1A2 的
抑制均有很大提高;浓度为 50 μmol /L 时，抑制能力分别提高了 29. 08% 和 27. 69% ． 浓度为 50
μmol /L时，金丝桃苷和芦丁对 CYP2E1 的抑制能力在预孵 30 min后也分别提高了 13. 27%和 11. 81%，
并且抑制能力随着化合物浓度的增加而增大(图 2)． 上述结果表明，芦丁、金丝桃苷和槲皮苷对大鼠
CYP1A2 和 CYP2E1 的抑制是一种随着预孵时间延长而增强的机理性抑制．
Fig． 2 Effect of quercitrin(a，c)and hype-roside(b，d)on the activity of CYP1A2(A)and effect of
hyperoside(a，c)and rutin(b，d)on the activity of CYP2E1(B)before (a，b)and after 30 min
preincubation(c，d)
随着刺五加在临床上广泛用于心脑血管疾病的治疗，近年来有关其不良反应的报道越来越多． 这
些不良反应多是与其它药物，尤其是西药合用后产生的［18］． 主要原因是其主要活性成分的 CYP450 反
应机制不明确． 本研究对刺五加叶中的主要黄酮苷类成分对 CYP450 的几类亚型酶的影响进行了系统
的研究． 在大鼠肝微粒体中，金丝桃苷和槲皮苷预孵 5 min 后，对 CYP1A2 催化的非那西丁的 O-脱乙
基反应的 IC50值分别为 46. 53 和 49. 75 μmol /L． 芦丁、和金丝桃苷预孵 5 min后，对 CYP2E1 催化的氯
唑沙宗的 6-羟基化反应的 IC50值分别为 99. 87 和 86. 36 μmol /L． 虽然抑制能力较弱，但机理性抑制实
验结果表明，这 3 种化合物对 CYP1A2 和 CYP2E1 的抑制能力随着底物预孵时间的延长而增强，所以
这种抑制作用不容忽视． CYP2E1 虽然只占 CYP450 总量的 7%，但对药物及毒物的活性转化至关重
要，在体内负责 6 大类、70 余种化学物质的代谢，其中大部分为前致癌物和前毒物，小部分为临床药
物［19］． 刺五加叶黄酮苷类化合物抑制 CYP2E1 的活力，可能影响其催化的药物代谢，从而导致药物不
良反应和毒性的加重． CYP1A2 主要在肝脏中表达，约占肝脏 CYP 酶总量的 13%，仅次于 CYP3A 和
CYP2C亚家族，代谢临床 5% ～10%的常规应用药物［20］． 临床上主要代谢的药物有利多卡因、美西津、
咖啡因、茶碱和他克林等药物［21］及激活芳香胺、多环芳烃、杂环胺和黄曲霉素等致癌物． 当刺五加与
由 CYP1A2 代谢的药物合用时，即可通过抑制 CYP1A2 的活性而延长其体内作用时间，增高血药浓度，
增强药物治疗效应，同时也会增高其毒副反应的发生率．
综上所述，采用 UPLC-MS /MS(MRM)及多探针底物的方法，对 CYP450 各亚型酶特异性底物的产
物进行检测，将 UPLC-MS /MS技术的高分离度、高灵敏度及高分辨率与多探针底物的特异性结合，大
大缩短了药物对 CYP450 亚型抑制或诱导能力的分析时间，是一种快速灵敏的研究药物对 CYP450 活
性影响的分析方法．
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Effects of Flavonoides from the Leaves of Acanthopanax on the Activity of
CYP450 Isozymes in Rat Liver Microsomes by a UPLC-MS /MS and
Cocktail Probe Substrates Method
BI Yun-Feng1，2，ZHU Hong-Bin1，PI Zi-Feng1，LIU Zhi-Qiang1，SONG Feng-Rui1*
(1． Chemical Biology Laboratory，Changchun Center of Mass Spectrometry，Changchun Institute of Applied Chemistry，
Chinese Academy of Sciences，Changchun 130022，China;
2． College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China)
Abstract Effects of flavonoides including quercitrin，hyperoside and rutin from the leaves of Acanthopanax
on the activity of hepatic microsomal CYP450 isozymes(CYP1A2，CYP2C，CYP2E1，CYP2D and CYP3A)
in rat liver microsomes were analyzed by a ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
(multiple reaction monitoring) ［UPLC-MS /MS(MRM) ］combined with cocktail probe substrates method． The
results showed that three compounds on the activities of some CYP450 isozymes were the inhibitory effects
using rat liver microsomes，in which the IC50 values of quercitrin and hyperoside to the inhibition of rat micro-
somal CYP1A2 activity were 46. 53 and 49. 75 μmol /L，respectively，the IC50 values of hyperoside and rutin
for the inhibition of CYP2E1 activity were 99. 87 and 86. 36 μmol /L，respectively． Mechanism of inhibition
experimental results show that three compounds on each CYP450 isozymes inhibiting ability was increased with
the increasing of the preincubation time，therefore，the inhibitory effects was a mechanism-based inhibition．
Keywords Leaves of Acanthopanax;Flavonoides;Cytochrome P450;Ultra performance liquid chromatogra-
phy-tandem mass spectrometry(UPLC-MS /MS)
( Ed． : I，K)
1701No． 5 毕云枫等: UPLC-MS /MS结合多探针底物方法研究……成分对 CYP450 活性的影响%