全 文 ：收稿日期:2009-06-03
基金项目:“十一五 ”科技支撑 “牧草远缘杂交育种技术研究 ” (2008
BADB3B02);内蒙古自治区重大科技项目 “优质全价草产
品开发 ”(20071923);2010年教育部重点项目 “加拿大披碱
草与老芒麦远缘杂交后代不育机理的研究 ”。
作者简介:李景环(1972-),女 ,内蒙古赤峰市人;讲师, 博士 ,主要从事
牧草植物分子生物学的教学与研究工作。
通讯作者:云锦凤 ,女 ,教授 ,博士生导师 , 主要从事牧草育种的教学与
科研工作
RAPD标记法鉴定加拿大披碱草 ×老芒麦杂种 F1纯度的研究
李景环 1, 2 , 　云锦凤1
(1.内蒙古农业大学生态环境学院 , 　呼和浩特 010019;
2.内蒙古师范大学生命科学与技术学院 , 　呼和浩特 010022)
摘要 :通过 RAPD分子标记方法 , 对加拿大披碱草 ×老芒麦的杂种 F1进行了鉴定 , 结果表明:F1是真杂种 , 而且 F1的遗
传物质偏向母本加拿大披碱草;双亲的亲缘关系相对较远;RAPD可快速灵活检测杂种的纯度。
关键词:　加拿大披碱草;老芒麦;杂种 F1;RAPD
中图分类号:　S543　　　文献标志码:　A　　　文章编号:　1001-4705(2009)11-0065-04
StudyonPurityofHybridF1 ofElymuscanadensisi
andElymussibiricusbyRAPD
LIJing-huan1, 2 , YUNJin-feng1
(1.ColegeofLifeScienceandTechnology, InnerMongoliaNormalUniversity, Hohhot010022, China
2.Colegeofecologyenvironment, InnerMongoliaAgriculturalUniversity, Hohhot010019, China)
Abstract:PurityofhybridF1 ofE.canadensisi×E.sibiricuswasidentifiedbyRAPDmarker.Theresults
showedthatF1 wastruehybrids.AndgeneticmaterialofF1 tendedtothatoffemaleparentE.canadensisi.The
relationshipbetweenmaleparentandfemaleparentwasmorefurther.Purityofhybridcouldbeidentifiedby
RAPDmarkerrapidly.
Keywords:　E.canadensis;E.sibiricus;hybridF1;RAPD
　　加拿大披碱草(Elymuscanadensis)是禾本科披碱
草属多年生草本植物 ,产于北美;茎杆直立 , 疏丛型 ,
叶宽大 ,直立粗壮 ,适应性强 ,抗旱 、抗寒 、耐盐碱 、抗风
沙 ,适口性好 ,是优良的牧草。老芒麦(Elymussibiri-
cus)别名:西伯利亚披碱草 、叶老芒麦 ,是禾本科披碱
草属多年生疏丛型禾草 。根系发达 ,呈须状 , 茎杆直
立 。主要分布于北半球寒温带 ,西伯利亚 、远东以及蒙
古 、日本等国 。在中国东北 、华北 、西北和西藏高原等
地都有分布 ,抗寒力强 ,能耐湿 ,抗旱力稍差 ,土壤适应
性较广 ,分蘖力强 ,适口性好 ,草食家畜喜食 ,最宜调制
干草。因此 ,加拿大披碱草与老芒麦都是生态适应性
强 、综合生产性能好的优良牧草 ,可以作为远缘杂交的
原始材料。我国生态建设和畜牧业发展急需耐寒 、耐
旱 、产量高的优质牧草品种 ,通过远缘杂交育种可以从
根本上改良牧草的综合性能。以加拿披碱草和老芒麦
为亲本进行远缘杂交 ,理论上能够获得具有优良性状
的 F1。可是 ,由于加拿披碱草和老芒麦的自交结实率
都很高(分别为 49%和 32.2%)[ 1] ,属于常异花授粉
植物 ,而且二者的生育期相差 20多天 ,开花期很难相
遇 ,因此很难获得远缘杂交后代 ,所以对 F1真实性的
鉴定具有重要意义。
在杂种鉴定中 ,形态学鉴定是早期鉴别杂种 F1植
株真假的重要手段 ,当整组外源染色体导入后 ,新的基
因表达系统 ,使杂种 F1植株在形态上(株高 、分蘖 、叶
形 、叶长 、穗型 、穗长 、芒长等)和育性上发生变化。但
进一步鉴别其真假 ,还需作细胞 、生化与分子生物学鉴
定 。
本试验中的杂种 F1是以加拿大披碱草为母本 ,以
老芒麦为父本 ,经过人工授粉进行远缘杂交得到的 ,其
生长势表现良好 [ 2] 。但是并没有 DNA水平验证此 F1
的真实性。而 RAPD分子标记是 DNA水平的标记 ,
DNA受环境的影响不大。因此 RAPD分子标记作为
一种快速简捷 、有效的检测手段 ,已被广泛应用于植物
种子纯度及杂交后代的鉴定上 [ 3 ～ 6] 。
试验地设在内蒙古农业大学牧草试验站 。东经
111°42′,北纬 40°49′,海拔 1 063m,属典型大陆性气
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研究报告　　李景环 等:RAPD标记法鉴定加拿大披碱草 ×老芒麦杂种 F1纯度的研究
DOI :10.16590/j.cnki.1001-4705.2009.11.054
候 ,年平均降水 400mm左右 ,无霜期 140d。试验地属
暗栗钙土 ,砂壤质 ,肥力条件中等 ,土壤 pH值 7.5左
右 ,具备灌溉条件 。
1　材料与方法
1.1　材　料
表 1　材料的基本情况
材料 来源 染色体数 基本特征
加拿大披碱草
Elymuscanadensis北美 2n=28 高产 叶量大抗寒 抗虫 抗病
老芒麦
Elymussibiricus 中国 2n=28 结实率高 抗寒抗旱 草质好
F1代 2n=28 分蘖能力强 ,生长势好
1.2　方　法
1.2.1　供试材料的准备
材料为加拿大披碱草(母本)、老芒麦(父本)以及
由加拿大披碱草与老芒麦人工授粉杂交得到的 F1代
植株。 2005年 3月将加拿大披碱草(母本)、老芒麦
(父本)播种于内蒙古农业大学生态环境学院温室花
盆中 , F1是通过对田间杂交获得的 F1幼穗的组织培
养得到的大量 F1代植株幼苗 ,也在内蒙古农业大学生
态环境学院温室花盆中培养 。 2005年 5月将加拿大
披碱草(母本)、老芒麦(父本)、F1代植株移栽于内蒙
古农业大学牧草试验站 ,株距和行距都为 60cm,每穴
一株。
1.2.2　DNA的提取与检测
(1)DNA的提取:取加拿大披碱草 10株 、老芒麦
10株 、F1 10株 。(在温室里的)新鲜嫩叶片各 0.5g,
先用自来水洗掉杂质 ,然后用双蒸水冲洗 3次 ,再用无
菌滤纸吸干叶片上的水分 ,剪成 2 ～ 3cm的小段并用
保鲜膜包好 ,放在 -78℃冰箱备用 。
处理好的叶片样品按编号放入 -20 ℃预冷的研
钵中 ,加液氮研磨成粉末 ,转入 10 ml离心管中(以下
均为 5 ml的离心管),迅速加入 3 ml65 ℃预热的
CTAB提取液 , 65℃温浴 90min。
加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)充分混匀 , 4 ℃
12 000r/min离心 10min。
取上清 ,再加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)充
分混匀 , 4℃ 12 000r/min离心 10min。
取上清 ,加 2/3体积 -20℃异丙醇 ,混匀 , 4℃ 12
000r/min离心 10min。
上述沉淀加 1.5ml65℃预热的 CTAB提取液 , 65
℃温浴 30min。
加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)充分混匀 , 4 ℃
12 000r/min离心 10min。
取上清 ,加 2/3体积 -20℃异丙醇 ,混匀 , -20℃
沉淀 2h;4℃ 12 000r/min离心 10min,沉淀用 70%乙
醇洗涤两次 ,干燥;将沉淀用 100μlTE回溶 ,加 RNase
3μl, 37℃放置 1h, 4℃冰箱保存 [ 7, 8] 。
(2)DNA检测:将上述提取到的每一种群体的每
一份 DNA样品等量混合 ,形成每种群体的混合基因
池 ,进行琼脂糖凝胶电泳 ,稳压 80V,以 1kbpluslad-
der为 marker,利用天能凝胶成像系统检测是否提取到
目的 DNA,照相 ,并用紫外分光光度仪确定其浓度 。
1.2.3　PCR反应条件与反应体系
参照 Wiliams等 [ 8]方法 ,进行 PCR试验 。
聚合酶链式反应(PCR)的条件设置为:94℃预变
性 3min, 94℃变性 1min, 37℃退火 1min, 72℃延伸
1.5min, 40次循环 ,最后 72℃延伸 5min, 4℃保存。
反应体系 12μl:20ng/μl的基因组 DNA1μl(混合
样), 10×PCRBufer1.5μl(已包含 Mg2+,其原浓度为
15mmol), 0.2μmol/μl引物 0.5μl, 5U/μlTaq酶 0.1
μl, 10mmol/LdNTPS1μl, d2H2O7.9μl。 RAPD反应在
Biometrer热循环仪上进行 。每次 PCR做一个阴性对
照(不加模板)。
电泳及照相:PCR产物在 1.2%的琼脂糖凝胶上
电泳 ,以 1kbplusladder为 Marker,稳压 80V,然后在
天能凝胶成像系统下照相 。
1.2.4　种群间的遗传距离和遗传一致度分析方法
Nei定义的遗传距离为:D=-㏑(I);I=2Nxy/
(Nx+Ny)。
式中:I为遗传一致度;
Nx为 X种群中出现的 RAPD标记数;
Ny为 Y种群中出现的 RAPD标记数;
Nxy为 X, Y两个种群中共同拥有的 RAPD标记
数 。
2　结果与分析
从 20个 RAPD引物中筛选出 3个可以很好鉴别
杂种的引物(S140, S318, S442),对材料的基因组进
行正式的 PCR扩增 ,扩增的结果见图 1、2和图 3(图片
中 1表示加拿大披碱草 , 2表示老芒麦 , 3表示 F1),从
图 1可知 , F1出现了母本加拿大披碱草的 3条特异性
条带 ,分子量大约为 1 100、900bp和 700 bp,同时 F1
也出现了父本老芒麦的特异性条带 , 分子量分别
为 2 000bp的一条条带 ,其他条带为 F1和亲本共有的
条带。图 2中显示 , F1有 2条母本加拿大披碱草的特
异性条带 ,带分子量大约为 1 000bp和 600bp,同时扩
增出了一条父本老芒麦的特异性条带 ,分子量大约为
3 000bp;在图 3中 , F1扩增出双亲的特异性条带各一条 ,
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第 28卷　第 11期　2009年 11月　　　　　 　 　　　　种　子　(Seed)　　　　　　 　 　　　 Vol.28　No.11　Nov.　2009
图 1　引物 S140扩增结果　　　　图 2　引物 S318扩增结果　　　　图 3　引物 S442扩增结果
分子量分别为 1 000bp(父本老芒麦的特异性条带)和
300bp(母本加拿大披碱草的特异性条带)。在 3个引
物的扩增图谱中 , F1都出现了双亲没有的条带 。
表 2　引物及其序列和扩增结果
引物 序列(5′-3′) 总扩增带数 多态性扩增带数
多态位点
百分率(%)
S140 GGTCTAGAGG 20 17 85.00
S318 GACTAGGTGG 18 15 82.22
S442 ACGTAGCGTC 16 12 75.00
Total 3 54 44 80.00
　　由表 2可知 , 3个引物共产生 54条可区分的 DNA
条带。引物 S140、S318、S442分别扩增出 20条 、18
条和 16条条带 ,多态性条带 44条 ,引物 S140、S318、
S442分别扩增出 17条 、15条和 12条多态性条带。扩
增结果见图 1、2、3。
54条带中有 8条为共有带 ,存在于各个样本中。
3个引物中加拿大披碱草与老芒麦的共有条带为 11
条 ,在 S140中有 3条 ,在 S318中有 3条 ,在 S442中
友 5条;F1和母本加拿大披碱草共有的条带为 15条 ,
在 3个引物中各出现 5条;F1与父本老芒麦共有的条
带为 14,引物 S318和引物 S442都为 5条 ,引物 S140
为 4条 。
F1共获得 21条多态性带 ,其中仅与母本相同的
有 15条 ,仅与父本相同的为 14条 ,还有 3条特异性的
条带;F1丢失了父本的 2条带 ,没有丢失母本的条带 ,
但是 F1出现了双亲的互补条带。从电泳图中看出 ,引
物 S140, S318, S442,扩增的结果再一次在 DNA水平
上证明了 F1是双亲的真杂种 。
　　从表 3可以看出 ,加拿大披碱草与老芒麦的遗传
一致度为 0.725 0(最小), F1与母本加拿大披碱草及
父本老芒麦的遗传一致度为分别为 0.810 8(最大)和
0.738 8,这进一步证明 F1是真杂种。
表 3　双亲及 F
1
, C
1
Ⅱ代遗传一致度和遗传距离的计算结果
种群 加拿大披碱草E.canadensis 老芒麦 E.sibiricus F1代
加拿大披碱草 — 0.725 0 0.810 8
老芒麦 0.321 6 — 0.736 8
F1代 0.209 7 0.3054 —
3　讨　论
利用杂交优势选育良种 ,是植物遗传改良中常用
的技术策略 。利用具有优良性状的两个种进行远缘杂
交是获得高产优质新品系的主要途径 。但是杂种的真
假至关重要 ,因此鉴定真假杂种成为杂交育种的重要
环节。在杂交后代的鉴定工作中 ,可以通过植株形态
特征 、细胞染色体分析和同工酶等方法来鉴别 ,尽管这
些方法在某种程度上是有效的 ,但也存在着一些缺点。
植株形态特征易受环境的影响 ,同工酶是基因表达的
产物 ,它的表达要受生物生长发育调控 ,因此在不同的
生育期 ,可能会有不同的表达特征。而 RAPD分子标
记是 DNA水平的标记 , DNA受环境的影响不大 ,也不
受生育期的影响 。因此 RAPD分子标记作为一种快速
简捷 、有效的检测手段 ,已被广泛应用于植物种子纯度
及杂交后代的鉴定上 ,如烟草 、水稻 、蕃茄 、玉米 、柑桔 、
唐菖蒲属植物和阿月浑子树等 [ 3 ～ 6] 。
4　结　论
通过 RAPD标记结果进一步证明 , 加拿大披碱
草 ×老芒麦杂种 F1是真杂种 。而且遗传物质偏向于
母本加拿大披碱草。
(下转第 70页)
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研究报告　　李景环 等:RAPD标记法鉴定加拿大披碱草 ×老芒麦杂种 F1纯度的研究
(上接第 67页)
参考文献:
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图 4　黄褐毛忍冬茎中导管分子(×500)
2.4.3　髓
髓位于茎的中央 ,其周围包围着维管组织(图 5
所示),排列疏松 ,由比较一致的薄壁细胞组成 ,具有
储水功能。连接髓和皮层之间的薄壁细胞称为髓射
线 ,髓至皮层薄壁细胞之间的物质由此运输 ,并兼有贮
藏的功能。
图 5　黄褐毛忍冬茎中髓和射线(×500)
3　结论与讨论
3.1　黄褐毛忍冬在医药 、食物添加剂 、抗氧化剂 、日用
品以及生态建设等方面都具有多种功效 ,不仅是一类
重要的具有经济价值的植物 ,而且还是一种典型的喀
斯特适生经济植物 ,作为新兴的资源植物 ,具有巨大的
开发潜力。
3.2　黄褐毛忍冬分枝能力强 ,茎的年生长量 30 ～ 300
cm。调查资料显示 , 9月份移栽的黄褐毛忍冬 ,次年 1
月新生茎可达 57cm,长势良好者能达到 10 ～ 15个分
枝 。据报道 , 10龄以上黄褐毛忍冬冠幅最大可达 24
m2 ,地径可达 8cm。茎中含有发育良好的周皮和输导
组织 ,周皮上发育有皮孔 ,有进行气体交换的作用 ,导
管的密度大 ,横截面宽 ,导管的结构与水分运输的有效
性和安全性有关 ,宽的导管对水分的输导效率高。
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第 28卷　第 11期　2009年 11月　 　 　　 　　 　　 　种　子　(Seed)　　 　 　　 　　　 　 Vol.28　No.11　Nov.　2009