全 文 ： 中国农业科学 2004,37（2）：163-169
Scientia Agricultura Sinica
中间偃麦草2Ai-2染色体DNA文库构建及特异性序列的克隆
何聪芬1,2，马有志 1，辛志勇1，徐琼芳 1，李连城1
（1中国农业科学院作物育种栽培研究所/农业部作物遗传育种重点开放实验室，北京 100081；
2北京工商大学化学与环境工程学院/北京市植物资源研究开发重点实验室，北京 100037）
摘要：以二体异附加系Z2与其普通小麦亲本宛7107杂交F1的花粉母细胞为材料，用原位杂交方法确定其中的
单价体为中间偃麦草2Ai-2染色体；在此基础上，以显微分离、回收、LA-PCR (Linker-adaptor PCR) 扩增了该
条染色体，扩增产物长度在0.15～3 kb之间，主要分布在0.2～2 kb。以α-32P-dCTP标记的中间偃麦草的基因组
DNA为探针，对LA-PCR扩增产物进行杂交，证实扩增产物来自中间偃麦草。将扩增片段纯化后连接到质粒载体pUC18
上，构建了2Ai-2染色体DNA文库。该文库包含约5×105个克隆。随机选取500个克隆进行分析，发现插入片段长
200～1 500 bp，平均580 bp。点杂交结果表明，56%为低/单拷贝序列，44%为重复序列。从文库筛选到4个中
间偃麦草克隆。RFLP结果表明，3个为多态性低拷贝（Mag065、Mag088、Mag139），1个为高度重复序列克隆（Mag104）。
GISH结果表明，Mag104为中间偃麦草染色体专化重复序列。
关键词：中间偃麦草；染色体微分离及微克隆；LA-PCR；RFLP；特异性DNA序列
Construction of Agropyrum intermedium 2Ai-2 Chromosome DNA
Library and Cloning of Species-specific DNA Sequences
HE Cong-fen1,2, MA You-zhi1, XIN Zhi-yong1, XU Qiong-fang1, LI Lian-cheng1
( 1Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding, Ministry of Agriculture / Institute of Crop Breeding and Culture, Chinese Academy of
Agricultural Sciences, Beijing 100081; 2 Beijing Key laboratory of Plant Resources Research and Development / College of Chemical and
Environmental Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100037)
Abstract: The univalent from the meiosis-metaphase spreads of F
1
(Z
2
×wheat variety Wan7107) was identified to be
Agropyrum intermedium 2Ai-2 chromosome by GISH. The 2Ai-2 chromosomes were microisolated and collected. After two
rounds of PCR amplification, the PCR products were ranged from 150-3　000　bp, with predominant fragments at about 200-
2　000　bp. Using Ag. intermedium genomic DNA as probe, Southern blotting analysis confirmed the products originated
from Ag. intermedium genome. The products were purified, ligated to pUC18 and then transformed into competence
Escherichia coli DH5α to produce a 2Ai-2 chromosome DNA library. The microcloning experiments produced approximately
5 ×105 clones, the size range of the cloned inserts was 200 -1 500 bp, with an average of 580 bp. Using Ag. intermedium
genomic DNA as probe, dot blotting results showed that 56% clones are unique/low copy sequences, 44% are repetitive
sequences in the library. Four Ag. intermedium clones were screened from the library by RFLP, and three clones (Mag065,
Mag088, Mag139) belong to low/single sequences, one clone (Mag104) was repetitive sequence. GISH results indicated
that Mag104 was Ag. intermedium species-specific repetitive DNA sequence.
Key words: Agropyrum intermedium; Microisolation and microcloning of chromosome ; LA-PCR; RFLP; Species-
specific DNA Sequences
构建特定染色体或染色体区段的DNA文库，对
收稿日期：2003-06-02
基金项目：国家“863”计划资助项目（101-04-03-03-97）
作者简介：何聪芬(1966-)，女，河北无极人，副教授，博士，主要从事植物分子生物学研究，E-mail:hecf@th.btbu.edu.
cn。马有志为通讯作者，Tel: 010-68919765; Fax:010-689752 2, E-mail: mayzh@mail.caas.net.cn
建立高密度的分子标记及图位克隆特定基因均具有重
164 中 国 农 业 科 学 37卷
要意义。目前，该技术已成功应用于甜菜[1]、大
麦[2]、燕麦[3]、小麦[4]、玉米[5]、黑麦[6]、大豆
[7]等作物的染色体DNA文库构建、遗传图谱绘制、
特异性探针筛选等方面。
小麦-中间偃麦草二体异附加系Z2（2n=44）是
通过部分双二倍体无芒中4（2n=56）与普通小麦亲
本宛7107杂交、回交选育而成的[8]，高抗由大麦黄
矮病毒（barley yellow dwarf virus，BYDV）
引起的小麦黄矮病。由于Z2的小麦亲本不抗BYDV，
Z2的BYDV抗性基因来自附加的中间偃麦草染色体。
同工酶及RFLP分析证明，其附加的中间偃麦草染色
体与小麦的第2同源群染色体部分同源，该染色体
被命名为2Ai-2[9]。利用微切割、微克隆技术构建
2Ai-2染色体DNA文库，可为分子标记的富集及抗
病基因的克隆提供一个良好的技术操作平台，本文
报道中间偃麦草2Ai-2染色体DNA文库构建及特异性
DNA序列的克隆。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料中间偃麦草、无芒中4（2n=56）、
二体异附加系Z1、Z2、普通小麦品种中国春、宛
7107、黑麦等，均由中国农业科学院作物育种栽
培研究所小麦生物技术课题组提供。
1.2 方法
1.2.1 染色体原位杂交 采用马有志等[10]的方法，
以biotin-16-dUTP标记的中间偃麦草基因组DNA为
探针，与Z2×宛7107杂种F1的花粉母细胞中期I
（PMC MⅠ）染色体进行原位杂交，以确定2Ai-2
中间偃麦草染色体。
1.2.2 单条染色体的分离及体外扩增 染色体标本
的制作、染色体微操作及微分离、单条染色体的蛋
白酶消化、染色体DNA的酶切、连接接头及2轮PCR
反应过程参照何聪芬等[11]的方法。以α-32P-dCTP标
记的中间偃麦草基因组DNA为探针对LA-PCR扩增产
物进行杂交，来确定扩增产物是否来自中间偃麦草。
1.2.3 2Ai-2染色体DNA文库的构建 用Pharmacia
公司的Sureclone试剂盒，参照公司提供的说明书，
将纯化后的PCR产物连接到pUC18质粒载体上，转
化大肠杆菌DH5α，并涂布于LB/Amp/X-gal/IPTG平
板上，培养过夜后挑选白色菌落,制备菌落原位杂交
膜[11]。
1.2.4 重组质粒分析 参照文献[11]进行菌落原位
杂交。利用载体上的M13正/反通用引物进行PCR
扩增，电泳分析插入片段大小。
1.2.5 重组质粒的点杂交 根据重组质粒浓度不
同，分别用1～5μl依次排列在硝酸纤维素膜上，
经碱变性、中和处理及干燥,保鲜膜包好置4℃冰箱
保存备用。以α-32P-dCTP标记的中间偃麦草基因组
DNA为探针对重组质粒进行点杂交。
1.2.6 2Ai-2染色体特异性克隆的筛选 提取中间
偃麦草、无芒中4、Z2、Z1、中国春、宛7107以
及黑麦等基因组DNA。样品各取10μg经EcoRI,
EcoRV，BamHI，DraI或HindⅢ酶切、电泳、转
膜，分别用点杂交筛选的低拷贝和重复序列DNA克
隆为探针，进行Southern杂交。用点杂交和Southern
杂交筛选的重复序列DNA克隆为探针，与Z2×宛7107
的F1花粉母细胞中期染色体进行原位杂交，以确定
重复序列DNA的特异性。
2 结果与分析
2.1 目标染色体的微分离和LA-PCR扩增
由于（Z2×宛7107）F1PMC MⅠ的中间偃麦草
2Ai-2染色体以单价体形式存在，不与小麦染色体
配对，使得其很容易被区分（图1）。对（Z2×宛7107）
F1花药进行不同的固定时间处理发现，固定10～15 min
即可用酶解的方法制成适宜分离目标染色体的标本。
对独立的 2个离心管（各含1条2Ai-2染色体）及
阳性对照（100 ng的中间偃麦草基因组DNA）经2
次PCR扩增，得到0.15～3 kb的扩增产物，主要
图1 Z2×宛7107的F1减数分裂中期1 (箭头示中间偃麦草
染色体)
Fig.1 Meiotic metaphase I in F1 hybrid of Z2×
Wan7107 (Arrow indicating the 2Ai-2 chromosome)
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图6 以α-32P-dCTP标记的中间偃麦草基因组DNA为探针
的点杂交部分结果
Fig.6 Dot hybridization of some plasmids cloned
using a probe of Ag.intermedium g nomic DNA
labeled by α-32P-dCTP
2.3 2Ai-2染色体DNA文库中特异性探针的筛选
分别以30个低拷贝克隆和5个重复序列为探
针，与经内切酶消化的基因组DNA进行RFLP分析。
筛选到3个多态性低拷贝探针（Mag065、Mag088、
Mag139）和1个中间偃麦草专化高度重复序列
（Mag104）。
在Mag065/EcoRV 组合中(Mag065为克隆编号)，
中间偃麦草、无芒中4、Z1、Z2、（Z2×宛7107）
F1均在2.0～2.8 kb处具有3条杂交带，而中国春、
宛7107、黑麦等不含中间偃麦草染色体的材料缺失
这些条带（图7）。表明Mag065为中间偃麦草特异
M. λ DNA/HindⅢ+EcoRI
1.中间偃麦草; 2.无芒中4; 3. Z1；4. Z2; 5.（Z2×宛7107）
F1; 6.中国春; 7.宛7107；8.黑麦
1. Ag.intermedium; 2. Awnless Zhong4; 3. Z1; 4. Z2; 5.
（Z2×Wan7107）F1; 6. (T.aestivum) Chinese Spring; 7.
(T.aestivum) wan7107; 8. (S.cereale) rye.
图7 Mag065为探针与EcoRV酶切的基因组DNA杂交结果
Fig.7 Southern hybridization patterns of combination
genomic DNAs/EcoRV using Mag065 as a probe
性寡拷贝序列。在Mag088/HindⅢ 组合中，中间
偃麦草、无芒中4、Z2在4.0 kb处具有1条杂交
带，而宛7107缺失此带（图8）。在Mag139/
EcoRI组合中，中间偃麦草、无芒中4、Z2在3.
2 kb处具有1条杂交带，而宛7107缺失此带，但
宛7107在2.9 kb处有1条杂交带（图9）。表明
Mag088，Mag139为中间偃麦草-小麦多态性寡拷贝
序列。
M.λDNA/HindⅢ+EcoRI; 1～4. EcoRI; 5～8. EcoRV; 9～
12. DraI;13～16.HindⅢ; 1、5、9、13.中间偃麦草; 2、
6、10、14.无芒中4; 3、7、11、15.Z2;4、8、12、16.宛
7107
1,5,9,13. Ag.intermedium; 2,6,10,14. Awnless Zhong4;
3,7,11,15. Z2; 4,8,12,16. Wan7107
图8 Mag088为探针的基因组DNA Southern 杂交结果
Fig.8 Southern hybridization patterns of combination
of Mag088
M.λDNA/HindⅢ+EcoRI；1.中间偃麦草; 2.无芒中4; 3.Z2;
4.（Z2×宛7107）F1; 5.宛7107
1.Ag.intermedium; 2.Awnless Zhong4; 3.Z2；4.(Z2×
Wan7107)F1; 5. Wan7107
图9 Mag139为探针与EcoRI酶切的基因组DNA Southern杂
交结果
Fig.9 Southern hybrid zation patterns of combination
of Mag139
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（责任编辑 孙雷心）