全 文 ：收稿日期:2007-04-14
基金项目:高校博士基金(20050086002);国家“973”前期项目(2005CCA01600)
作者简介:刘雅辉(1979-),女 ,河北滦南人 ,硕士 ,主要从事分子植物病理学研究
通讯作者:刘大群(1958-),男 ,河北石家庄人 ,博士 ,博士生导师 ,主要从事植物病害生物防治和分子植物病理学研究。
小麦抗叶锈病基因 Lr19 的 SRAP标记
刘雅辉 ,闫红飞 ,杨文香 ,孟庆芳 ,张　汀 ,刘大群
(河北农业大学植物病理系 ,河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心 ,河北保定　071001)
　　摘要:以 Thatcher和 23 个以 Thatcher 为遗传背景的小麦抗叶锈病近等基因系及 TcLr19与 Thatcher杂交的 F2 植株
为材料 , 首次应用 SRAP技术开展小麦抗叶锈病基因 Lr19 的SRAP 分子标记研究 ,获得一个与小麦抗叶锈病基因连锁
的分子标记 ,命名为 M73 , 与目的基因的遗传连锁距离为 2.6 cM ,为分子辅助育种 、构建密集的遗传图谱和最终实现
Lr19 基因的克隆奠定基础。
关键词:小麦叶锈病;抗病基因;分子标记;SRAP;Lr19
中图分类号:S432　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2007)04-0193-04
Identification of a SRAP Markers Linked to Leaf Rust Resistance
Gene Lr19 in Wheat
LIU Ya-hui ,YAN Hong-fei ,YANG Wen-xiang ,MENG Qing-fang ,
ZHANG Ting , LIU Da-qun
(Department of Plant Pathology ,Agricultural University of Hebei ,Biological Control Center
of Plant Diseases and Plant Pests of Hebei Province ,Baoding　071001 ,China)
Abstract:SRAP analysis was firstly carried on Thatcher , twenty three near-isogenic lines and F2 population of
TcLr19×Thatcher to develop molecular markers for leaf rust resistance gene Lr19 in wheat.A marker linked to Lr19 re-
sistance gene was obtained , and was named as M73with the genetic distance 2.6 cM.The reseach may facilitate establish-
ment of the higher density genetic map ,marker-assisted selection breeding program and eventual cloning of Lr19 gene.
Key words:Wheat leaf rust;Resistance gene;Molecular marker;SRAP;Lr19
　　由小麦叶锈菌(Puccinia recondite f.sp.tirtici )引
起的小麦叶锈病在世界各地产麦区均有发生[ 1] ,严
重时可造成 5%～ 15%甚至更大的产量损失[ 2] 。国
内外的研究和生产实践证明 ,利用抗病品种是防治
该病害最经济 、安全 、有效的方法。小麦抗叶锈病基
因 Lr19 来源于长穗偃麦草 ,是一个十分有效的抗叶
锈病基因 ,1994年墨西哥首次报道有对 Lr19 有毒性
的菌株 ,但至今在南非 、中国等地仍只有少数几个菌
株对之表现毒力 ,寻找与其连锁的分子标记 ,对抗病
基因的克隆 、分子标记辅助育种等有重要意义 。
到目前为止 ,人们已经找到了与 Lr19 紧密连锁
的生化标记[ 3] 、RFLP 标记[ 4] 、SSR标记[ 5]和AFLP标
记[ 6 ,7] ,且 AFLP 标记已成功转化为 STS标记[ 6] 。
SRAP(Sequence related amplified polymorphism)即
相关序列扩增多态性 ,是一种新型的基于 PCR的分
子标记技术 ,通过独特的引物设计对开放阅读框
ORFs(Open reading frames)进行扩增。正反引物分别
是针对序列相对保守的编码区与变异大的内含子 、
启动子和间隔序列设计的。正向引物长 17 bp(5′端
的10 bp填充序列+CCGG+3′端的 3个选择性碱
基),对外显子进行特异扩增;反向引物长 18 bp(5′
端的 11 bp填充序列+AATT +3′端的 3个选择性碱
基),对内含子区域 、启动子区域进行特异扩增 ,因个
体不同及物种的内含子 、启动子与间隔长度不等而
产生多态性。该标记具有简便 、稳定 、中等产率 、在
基因组中分布均匀 、便于克隆测序目标片段的特点 ,
适合于基因定位 、基因克隆 、图谱构建 、cDNA 指纹
分析 、生物多样性研究 、比较基因组学等诸多研究领
华北农学报·2007 , 22(4):193-196
域[ 8-11] 。本研究首次采用 SRAP技术对小麦抗叶锈
病基因 Lr19 进行标记 , 以寻求更多的 、更近的与
Lr19 连锁的分子标记 ,构建更密集的遗传连锁图
谱 ,提高分子辅助育种的准确性 ,为最终实现该基因
的克隆奠定基础 。
1　材料和方法
1.1　材料
供试的小麦抗叶锈病近等基因系 TcLr1 ,TcLr9 ,
TcLr13 ,TcLrl5 ,TcLrl7 ,TcLr18 ,TcLr19 , TcLr25 ,TcLr28 ,
TcLr29 , TcLr30 , TcLr32 , TcLr33 , TcLr34 , TcLr36 , Tc
Lr37 ,TcLr38 , TcLr39 , TcLr41 , TcLr42 , TcLr43 , TcLr44 ,
TcLr45 , 感病对照 Thatcher 以及其 F2(TcLr19 ×
Thatcher)单株均来自河北农业大学小麦锈病研究
室;供试的小麦叶锈菌菌株 02-5-17 ,对 Thatcher表现
高侵染型(4),对 TcLr19表现免疫(0)。
1.2　小麦试材抗叶锈性鉴定
种植抗病亲本TcLr19和感病亲本Thatcher及F2
小麦 ,小麦一心一叶时按 Seyfarth等[ 12]的方法接种
叶锈菌02-5-17 ,幼苗接菌后在黑暗条件下保湿 24
h ,再移入温室内培养 , 14 d后按 Roelfs[ 13] 的标准记
载小麦叶片的侵染型 ,用χ2测验法检测所得 F2群体
抗感分离比例的适合度。
1.3　小麦基因组 DNA的提取
参照Gill等[ 14]提供的 CTAB法 ,稍作修改后提
取小麦亲本及 F2分离群体单株小麦叶片基因组
DNA ,然后用 0.8%的琼脂糖凝胶电泳并通过凝胶成
像系统拍照分析 ,检测样品的浓度和纯度。
1.4　SRAP分析
引物采用 Li等[ 15] 发表的引物及在此基础上通
过改变引物 3′端 3 个选择性碱基随机组合共组成
128 对引物 ,由上海生物工程技术服务公司合成。
引物序列如表 1所示 。
PCR反应总体积为20μL ,DNA(20 ng/μL)2μL ,
10×PCR Buffer 2 μL ,dNTP(10 mmol/L)0.7μL ,引物
(50 ng/μL)各0.8μL ,TaKaRa Taq(5U/μL)0.3μL ,其
余用蒸馏水补齐。扩增程序为94℃预变性5min ,接
着 94℃变性 1 min ,35℃退火 1 min ,72℃延伸 1 min ,
共 5个循环;然后将退火变为 50℃,再进行 30个循
环 ,最后 72℃延伸 10 min , 4℃保存 。扩增产物在
5%聚丙烯酰胺凝胶上电泳 , 65 W 恒定功率电泳至
第一条 Loading buffer 溴芬蓝带到达胶板的另一边
缘 ,然后进行银染显色。
1.5　与 Lr19 连锁的 SRAP分子标记的筛选
以23个以 Thatcher 为遗传背景的小麦抗叶锈
病近等基因系为试材 ,寻找 TcLr19与其他小麦近等
基因系之间扩增谱带的差异条带 。利用筛选到的具
有多态性的引物组合扩增 456 个 TcLr19×Thatcher
杂交的 F2单株 ,以验证该多态性与目标基因连锁的
程度 ,从而确定与目的基因紧密连锁的分子标记 。
1.6　连锁分析
用Mapmanager作图软件进行目的基因和分子标
记位点的遗传连锁分析 ,计算遗传距离 ,用 Kosambi
函数将重组率转化为遗传图距(Centimorgan , cM)。
表 1　试验所用正反引物的序列
Tab.1　Sequences of forward and reverse primers used in this study
正向引物
Forward primer
反向引物
Reverse primer
反向引物
Reverse primer
me1:5′TGAGTCCAAACCGGATA 3′ em1:5′GACTGCGTACGAATTAAT 3′ em9:5′GACTGCGTACGAATTCGA 3′
me2:5′TGAGTCCAAACCGGAGC 3′ em2:5′GACTGCGTACGAATTTGC3′ em10:5′GACTGCGTACGAATTCAG3′
me3:5′TGAGTCCAAACCGGAAT 3′ em3:5′GACTGCGTACGAATTGAC 3′ em11:5′GACTGCGTACGAATTCCA3′
me4:5′TGAGTCCAAACCGGACC 3′ em4:5′GACTGCGTACGAATTTGA3′ em12:5′GACTGCGTACGAATTATT 3′
me5:5′TGAGTCCAAACCGGAAG 3′ em5:5′GACTGCGTACGAATTAAC 3′ em13:5′GACTGCGTACGAATTACG3′
me6:5′TGAGTCCAAACCGGTAA 3′ em6:5′GACTGCGTACGAATTGCA 3′ em14:5′GACTGCGTACGAATTATG3′
me7:5′TGAGTCCAAACCGGTCC 3′ em7:5′GACTGCGTACGAATTCAA 3′ em15:5′GACTGCGTACGAATTCGG3′
me8:5′TGAGTCCAAACCGGTGC 3′ em8:5′GACTGCGTACGAATTCTG3′ em16:5′GACTGCGTACGAATTGAT3′
2　结果与分析
2.1　TcLr19抗叶锈性遗传分析
对双亲及其杂交后代抗病性鉴定结果表明 ,
TcLr19对菌株 02-5-17抗病(免疫),Thatcher 感病(高
度侵染),在其456株F2单株中 ,有336株表现抗病 ,
120株表现感病 ,适合性测验得出χ2C=0.35<χ20.05=
3.84 ,群体抗感比例符合 3∶1分离规律 ,表明 TcLr19
×Thatcher F2 的抗叶锈性由 1对等位基因控制。
2.2　与 Lr19 连锁的 SRAP标记
采用8个正向引物和 16个反向引物组合成 128
个引物组合 ,对 23个小麦抗叶锈病近等基因系进行
了分析 ,选出 5对能够揭示小麦抗叶锈病基因 Lr19
多态性的引物 ,然后用 TcLr19×Thatcher杂交的 F2群
体验证 ,得到1对能够区分 F2中的抗感群体的引物组
合ME7-EM3。在亲本及F2抗病群体中能扩增出 1条
约为 300 bp的特异条带(图 1),在336个抗病个体中
194　 华　北　农　学　报 22卷
有333个可扩增出此条带 ,3个缺失该条带;120个感
病个体中 117个缺失该条带 ,3个含有该条带 。
2.3　遗传连锁分析
所得数据用 Mapmanager 软件进行分析 ,获得一
个与抗叶锈性状连锁的分子标记 ,命名为M73 ,与目
的基因的遗传距离为2.6 cM ,可以用于分子辅助选
择 ,也可与其他分子标记 ,构建更为密集的遗传连锁
图 ,对 Lr19 基因的克隆具有重要意义 。
T.Thatcher;Pr.TcLr19;S.F2中感病个体;R.F2 中抗病个体;M.PBR322/MspI marker
S.Susceptible individual of F2 Progeny;R.Resistant individual of F2 Progeny
图 1　引物ME7-EM3 在 F2(TcLr19×Thatcher)中扩增出的特异条带
Fig.1　The specific band amplified with ME7-EM3 in F2 generation
3　讨论与结论
目前 ,常用的分子标记有 RFLP , RAPD ,AFLP ,
SSR , ISSR等 ,这些分子标记在小麦抗叶锈病基因研
究中发挥了重要作用 。然而 ,由于小麦的基因组庞
大 ,重复序列多 ,小麦的 RFLP 和 RAPD多态性较差;
SSR扩增多产生共显性标记 ,是目前较好的一种方
法 ,但是其引物的开发费时昂贵 , 完成标记成本很
高;AFLP 技术虽然多态性高 ,但假阳性高而且步骤
复杂 ,也使其应用受到限制。SRAP标记是一种基于
PCR的新型标记系统 ,它的引物设计简单 ,具有通用
性 ,而且改变引物3′端 3个选择性碱基可以设计多
种引物 ,通过正向引物和反向引物的自由组合 ,可以
在较少的引物基数中进行多种组合 ,大大减少了引
物合成成本 ,提高了引物的使用率。该标记采用复
性变温扩增法 ,考虑到较低的退火温度有利于两引
物与 DNA上靶位点的结合 ,所以 ,前 5 个循环退火
温度设为 35℃。随后的循环中退火温度升到 50℃,
可以保证前5个循环的扩增产物在余下的循环中进
行指数扩增 ,提高扩增条带的重复性 。本研究在 Li
等[ 14] PCR程序的基础上进行调整 ,将后边的 35个
循环改为 30个循环 ,不仅缩短了扩增时间 ,还保证
了扩增的稳定性 ,研究结果表明减少 5个循环的扩
增 ,其产物量影响不大 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳图中的
条带数量 、质量与 35个循环一样 。该标记试验操作
过程简单 ,扩增谱带清晰 ,结果稳定 ,是一种吸收了
RFLP ,RAPD ,SSR ,AFLP 标记的优点 ,又克服了它们
缺点的有效而可靠 ,简单又经济的分子标记系统。
虽然前人已经利用 RFLP ,SSR技术对小麦抗叶
锈病基因 Lr19 进行了成功标记 ,而且将 AFLP 标记
转化为稳定的 STS 标记 ,为了寻找更多的与该基因
紧密连锁的标记 ,构建更加密集的遗传图谱和物理
图谱 ,提高分子辅助育种的准确性 ,并最终实现抗病
基因的克隆 ,本研究首次将 SRAP 标记应用到小麦
抗叶锈病基因的分子标记中 ,并获得了一个与 Lr19
基因连锁的分子标记 M73 ,距目的基因遗传距离为
2.6 cM ,由于 SRAP 标记是对 ORFs进行扩增 ,因而
对着丝粒附近以及端粒的扩增会较少 ,如果结合
SSR标记 ,将可获得覆盖整个基因组的连锁图。因
此 ,标记 M73对于小麦抗叶锈病抗病基因 Lr19 的
分子辅助选择及克隆具有十分重要的价值 。
本研究首次采用 SRAP 技术 ,以 Thatcher 和 23
个以 Thatcher为遗传背景的小麦抗叶锈病近等基因
系及 TcLr19与 Thatcher杂交的 F2植株为材料 ,开展
了小麦抗叶锈病基因 Lr19 的分子标记研究 。用 128
对 SRAP 引物扩增 23个小麦抗叶锈病近等基因系
和感病对照 Thatcher 的基因组 DNA ,分析了小麦抗
叶锈病基因 Lr19 与小麦抗叶锈病近等基因系间的
多态性。经过初次筛选 ,得到 5对能揭示小麦抗叶
锈病基因 Lr19 多态性的引物组合 。经 TcLr19 F2
(TcLr19×Thatcher)抗感小群体验证 ,得到引物组合
ME7-EM3在 F2抗感单株中存在差异 ,然后用 456个
F2 抗感单株验证 ,找到 1个与 Lr19 基因连锁的标
记 ,命名为M73 ,与目的基因遗传距离为 2.6 cM。
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