全 文 ：花旗松素对人宫颈癌 Hela细胞的体外抗肿瘤活性及其机理研究
翟延君， 程 飞， 王添敏， 初正云， 李 娜
(辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600)
收稿日期:2011-07-01
基金项目:国家自然科学基金项目(30873437)
作者简介:翟延君(1956—) ，女，教授，博士生导师，研究方向:中药品质评价研究。Tel:(0411)87586003，E-mail:lnzyzyj@ sohu． com
摘要:目的 观察和探索花旗松素对人宫颈癌 Hela细胞的体外抗肿瘤活性及其作用机理。方法 结晶紫染色法检测花
旗松素对人宫颈癌 Hela细胞的增殖抑制作用;RT-PCR法检测与肿瘤细胞凋亡相关基因的表达。结果 花旗松素能够
抑制人宫颈癌 Hela细胞的增殖，呈剂量依赖关系;花旗松素不能诱导 Bcl-2 mRNA 和 Bax mRNA 的表达，但能使 P53 和
P21 的 mRNA表达量增加。结论 花旗松素具有良好的体外抑制人宫颈癌 Hela细胞增殖作用;花旗松素诱导 Hela细胞
死亡与细胞凋亡相关，其分子机制可能与升高 P53 和 P21mRNA表达有关，而与 Bcl-2 和 Bax的蛋白转录无关。
关键词:花旗松素;人宫颈癌 Hela细胞;抗肿瘤作用;RT-PCR
中图分类号:R966 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2011)12-2052-04
In vitro anticancer activity of taxifolin on human cervical cancer Hela cells and
its mechanism
ZHAI Yan-jun， CHENG Fei， WANG Tian-min， CHU Zheng-yun， LI Na
(College of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China)
ABSTRACT:AIM To evaluate the in vitro anticancer activity and mechanism of taxifolin，a major constituent of
Polygonum orientale L．，against human cervical cancer Hela cells． METHODS The inhibitory effect of taxifolin
on the proliferation of human cervical cancer Hela cells was detected by crystal violet assay． RT-PCR method was
used to investigate the expression of apoptosis-related genes． RESULTS Taxifolin showed the inhibitory effect on
the proliferation of human cervical cancer Hela cells in a dose-dependent manner． Taxifolin showed no effect on the
expression of Bcl-2 mRNA and Bax mRNA，but increased the expression of P53 mRNA and P21 mRNA． CON-
CLUSION Taxifolin exhibits potent inhibition on the proliferation of human cervical cancer Hela cells in vitro on
and the mechanism of cell death induced by taxifolin is related to cell apoptosis． The molecular mechanism for cell
apoptosis is related to the upregulation of P53 mRNA and P21 mRNA，and independent of Bcl-2 mRNA /Bax mR-
NA apoptosis protein transcription．
KEY WORDS:taxifolin;Hela cells;anticancer activity;RT-PCR
中药水红花子为蓼科植物红蓼 Polygonum ori-
entale L．的干燥成熟果实，资源极其丰富。本品性
寒，味咸;具有散血消癥、消积止痛的功效;用于癥瘕
痞块、瘿瘤、肿痛、食积不消、胃脘胀痛等症。水红花
子主要含黄酮类化合物，其中花旗松素是特征性成
分，已作为对照品被 2010 年版《中国药典》收载，为
含量测定的指标成分［1］。根据水红花子具有抗肿
瘤作用的文献报道［2-3］，本课题组进行了花旗松素对
人宫颈癌 Hela细胞形态的影响及 DNA 片段的影响
实验［4］。本实验通过花旗松素对人宫颈癌 Hela 细
胞的增殖抑制作用实验和对凋亡相关基因 Bcl-2
mRNA、Bax mRNA 转录的影响，进一步探讨花旗松
素对人宫颈癌 Hela 细胞的体外抗肿瘤活性及其机
理，为水红花子药效学研究提供参考资料。
1 材料和方法
1． 1 细胞株 人宫颈癌 HeLa 细胞(中国科学院上
海细胞生物所)。
1． 2 药品与试剂 花旗松素(北京百灵威化学技
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术有限公司) ，阳性对照:5 氟尿嘧啶(5-Fu，天津金
耀制药厂)。新生牛血清 NBS(大连生物试剂公
司) ，胰酶(Sigma) ，RPMI1640 培养基(GIBCO，NY，
USA) ，青霉素、链霉素(天津 TBD 公司) ，结晶紫
(Sigma) ，琼脂糖凝胶(Sigma) ，AMV 逆转录酶(Sig-
ma) ，TaqDNA 聚合酶(Sigma) ，扩增引物 β-actin，
P53，P21，Bax，Bcl-2(北京鼎国公司) ，RNA 酶抑制
蛋白(Sigma) ，Trizol 试剂、oligo(dT) (北京鼎国
公司)。
1． 3 仪器与设备 二氧化碳培养箱(REVCO) ，酶
联免疫分析仪(Bio-Rad model 450) ，倒置显微镜(O-
LYMPUS，CK2 China) ，水平式电泳仪(北京六合仪
器厂) ，高速冷冻离心机，PCR 仪(联星公司产品) ，
6-孔板和 96 孔板(NUNCTM Denmark) ，凝胶成像仪
(ELETROPHRESIS DOCUMEN-TATION AND ANAL-
YSIS SYSTEM 120)。
1． 4 细胞复苏与培养 从 － 70 ℃冰箱中取出 Hela
细胞冻存管，迅速放入 37 ℃水浴融化，融化后用吸
管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加 10 倍以上培养
液，混合后 1 000 r /min 离心 5 min，弃上清液，用
RPMI-1640 培养液洗涤 1 次。然后将细胞接种在含
有 10%新生小牛血清及青霉素、链霉素的 RPMI-
1640 培养液的培养瓶中，置于 37 ℃，5% CO2、饱和
湿度的孵箱中培养，维持细胞处于对数生长期备用。
1． 5 肿瘤细胞的体外生长抑制实验 将待测细胞
(2 × 104 个 /孔)接于 96 孔板中(NUNCTM，Den-
mark) ，加入 100 μL的培养液，培养 4 h，待细胞贴壁
后换成 2%小牛血清和不同浓度样品的 RPMI-1640
培养液，继续培养。培养 12、24、36、48 h 后，将含有
不同浓度样品梯度的培养液倒掉，用 50 μL 结晶紫
染色 15 ～ 20 min，然后再将结晶紫倒掉，将未染色的
结晶紫洗掉，由于结晶紫能够将活细胞染色，此时还
未死的细胞贴在培养瓶底壁上，并被染成蓝色。在
36 ℃左右烘干，备用。待测时用 50 μL 的甲醇溶
解，再用酶标仪(ELX 800)测定 595 nm 的吸收值，
根据吸收值计算抑制率。公式为:生长抑制率 =(1
－ A实验组 /A对照组)× 100%，每次实验重复 3 次。
1． 6 RT-PCR 检测 Bcl-2 mRNA、Bax mRNA 及 P53
mRNA、P21 mRNA 的表达 接种 1 × 106 /瓶以上个
待测细胞，加入适量培养液，待细胞贴壁后，将培养
液换成含花旗松素质量浓度为 50 μg /mL 的新培养
液，分别培养 0、12、24、36、48 h 后，将每个培养瓶中
的所有细胞收集起来，细胞用 PBS 反复洗涤数次
后，将细胞沉淀溶于 1 mL的 PBS中，转移至 1． 5 mL
EP管中，2 500 r /min 离心 5 min，收集细胞沉淀;利
用 Trizol 试剂提取细胞内总 RNA。以提取的总
RNA为模板，以 Oligo-dT12-18为引物进行反转录，以
反转录后的 cDNA为模板，利用上述合成的引物，进
行 PCR扩增，反应条件为:94 ℃，30 s;55 ℃，40 s;
72 ℃，45 s，30 个循环;72 ℃延伸 5 min，反应完毕，
将样品于 2% 琼脂糖凝胶电泳检测(表 1)。
表 1 RT-PCR实验引物一览表
Tab． 1 Primers of RT-PCR used in the study
基 因 引 物
β-actin 5-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA
5-CTTCCTTATGTCACGCACGATTTC
Bcl-2 5-CAGCTGCAGGTGACG
5-ATGCACCTACCCAGC
Bax 5-ACCAAGAAGCTGAGCGAGTG
5-ACAAAGATGGTCACGGTCTG
P53 5-CACTGATTGCTCTTAGGTCT
5-AGTTGCAAACCAACCTGAGG
P21 5-GTGGACCTGTCACTGTCTTGTAC
5-CTTCCTCTTGGAGAAGATCAGC
1． 7 统计分析 实验数据采用 SPSS 13． 0 统计软
件进行数据处理，各组间均数采用 t 检验，结果以
x ± s表示。
2 结果
2． 1 花旗松素对人宫颈癌 Hela 细胞的增殖抑制实
验 花旗松素有较好的抑瘤效果，细胞死亡率随剂
量的增加而增加。在样品质量浓度为 50 μg /mL，培
养 48 h，5-FU的抑瘤率为 61． 2%，花旗松素抑瘤率
为 88． 2%，比 5-FU效果好(表 2)。
2． 2 花旗松素对凋亡相关基因 Bcl-2 mRNA、Bax
mRNA转录的影响 本实验通过花旗松素诱导 Bcl-
2 mRNA 和 Bax mRNA 的表达变化，从基因转录水
平研究其诱导 HeLa 细胞死亡是否与 Bcl-2 /Bax 途
径相关。实验结果表明:花旗松素 50 μg /mL 培养
0、12、24、36、48 h，Bcl-2 mRNA和 Bax mRNA的表达
均没有变化，说明花旗松素诱导 HeLa 细胞凋亡与
Bcl-2 和 Bax的途径无关(图 1)。
2． 3 花旗松素对凋亡相关基因 P53 mRNA 和 P21
mRNA转录的影响 P21 和 P53 的主要功能是使受
短波紫外辐射、化疗药物诱导等引起 DNA损伤的细
胞，产生细胞周期抑制，进而凋亡，避免错误基因的
复制，是细胞保持基因稳定的重要蛋白。P53 这种
作用主要依赖抑癌基因 P21 来完成。对于有 DNA
损伤的细胞，通过激活P53基因启动P21基因表达
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表 2 花旗松素对人宫颈癌 Hela细胞的增殖抑制作用 (A，x ± s，n =3)
Tab． 2 Inhibitory activity of Taxifolin on the Hela cells proliferation
样品
质量浓度
/(μg /mL)
12 h
A值
抑制
率 /%
24 h
A值
抑制
率 /%
36 h
A值
抑制
率 /%
48 h
A值
抑制
率 /%
对照 0． 199 7 ± 0． 006 9 0． 244 5 ± 0． 006 0 0． 283 9 ± 0． 006 6 0． 376 7 ± 0． 004 0
1 0． 155 4 ± 0． 004 5* 22． 2 0． 134 7 ± 0． 003 9* 44． 9 0． 139 7 ± 0． 005 2＊＊ 50． 8 0． 113 6 ± 0． 007 4＊＊ 69． 84
10 0． 125 8 ± 0． 006 2＊＊＊ 37． 0 0． 102 2 ± 0． 009 7＊＊＊ 58． 2 0． 085 5 ± 0． 006 3＊＊＊ 69． 9 0． 094 9 ± 0． 005 3＊＊＊ 74． 8
花旗松素 50 0． 101 4 ± 0． 003 8＊＊＊ 49． 2 0． 081 2 ± 0． 007 4＊＊＊ 66． 8 0． 069 6 ± 0． 005 3＊＊＊ 75． 5 0． 044 5 ± 0． 002 6＊＊＊ 88． 2
100 0． 088 7 ± 0． 008 0＊＊＊ 55． 6 0． 074 1 ± 0． 006 0＊＊＊ 69． 7 0． 055 6 ± 0． 004 3＊＊＊ 80． 4 0． 039 6 ± 0． 002 4＊＊＊ 89． 5
500 0． 075 7 ± 0． 006 6＊＊＊ 62． 1 0． 048 4 ± 0． 002 3＊＊＊ 80． 2 0． 033 2 ± 0． 004 5＊＊＊ 88． 3 0． 011 3 ± 0． 006 1＊＊＊ 97． 00
1 0． 199 7 ± 0． 005 － 0． 01 0． 243 9 ± 0． 009 6 0． 23 0． 281 7 ± 0． 005 7 0． 79 0． 370 7 ± 0． 007 6 1． 60
10 0． 174 9 ± 0． 004 9＊＊ 12． 4 0． 200 2 ± 0． 004 8＊＊ 18． 1 0． 208 7 ± 0． 003 4＊＊＊ 26． 5 0． 241 8 ± 0． 005 1＊＊＊ 35． 85-FU
50 0． 134 6 ± 0． 006 1＊＊＊ 32． 6 0． 123 0 ± 0． 006 1＊＊＊ 49． 7 0． 132 3 ± 0． 005 6＊＊＊ 53． 4 0． 146 2 ± 0． 004 1＊＊＊ 97． 4
100 0． 099 3 ± 0． 009 7＊＊＊ 50． 3 0． 069 2 ± 0． 004 0＊＊＊ 71． 7 0． 045 7 ± 0． 006 3＊＊＊ 83． 9 0． 009 8 ± 0． 000 7＊＊＊ 61． 2
与对照组比较，* P ＜0． 05，＊＊P ＜0． 01，＊＊＊P ＜0． 001。
* P ＜0． 05，＊＊P ＜0． 01，＊＊＊P ＜0． 001 vs control group．
图 1 花旗松素对凋亡相关基因转录影响
Fig． 1 Effect of Taxifolin on the transcription of
apoptosis-related genes
1 － 5． 50 μg /mL花旗松素分别作用 0，12，24，36，48 h
来诱导细胞凋亡。本实验结果表明:花旗松素
50 μg /mL培养 0、12 h时表达没有明显变化，而 24、
36、48 h诱导 P53 mRNA 和 P21 mRNA 的表达增加
(图 1)。
3 讨论
3． 1 花旗松素是水红花子的特征性成分，已作为对
照品被 2010 年版《中国药典》收载，水红花子现代
研究报道具有抗肿瘤作用，对原发性肝癌及子宫肌
瘤的治疗有较好的效果。宫颈癌是女性生殖系统常
见的恶性肿瘤之一，其发病率占女性恶性肿瘤第二
位。探讨花旗松素抗肿瘤作用及其作用机理，对开
发新的抗肿瘤药物有一定意义。本实验通过花旗松
素对人宫颈癌 Hela 细胞的体外抗肿瘤活性及其机
理研究，可为水红花子抗肿瘤作用药效学研究提供
参考资料。
3． 2 体外抗肿瘤实验结果可知:花旗松素有良好的
体外抑制人宫颈癌 Hela细胞作用，抑制率随着剂量
的增加及时间的延长而增大。前期的形态学检验结
果［3］表明，用花旗松素处理 12 h 后，人宫颈癌 Hela
细胞变圆并从培养瓶壁上逐渐脱落下来，24 h 后细
胞膜发泡并呈现细胞核迸裂，大部分细胞逐渐形成
凋亡小体，说明人宫颈癌 HeLa 细胞死亡与细胞凋
亡途径有关。
3． 3 本实验选择两种途径探讨了花旗松素诱导
Hela细胞凋亡机理，一种是与线粒体有关的 Bcl-2 /
Bax途径，另一种是与细胞周期相关的 P53 /P21 途
径。实验结果显示，Bax的 mRNA和 Bcl-2 的 mRNA
的表达水平均没有变化，说明花旗松素诱导 HeLa
细胞凋亡与 Bcl-2 /Bax的转录途径无关;P53 的 mR-
NA表达量升高，而 P21 的 mRNA 的表达量也表现
为升高，说明花期松素能够诱导 P53 mRNA 和 P21
mRNA的表达增加，诱导 HeLa 细胞凋亡与细胞
DNA损伤和细胞周期的抑制有关。
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黄芩苷对 RSV转录、复制及融合效应的影响
徐建亚， 徐 珊， 陈 超， 李佳曦， 汪受传* ， 单进军
(南京中医药大学第一临床医学院儿科研究所，江苏 南京 210046)
收稿日期:2011-04-12
基金项目:国家自然科学基金项目(81072840) ;江苏省中医药局科技项目(LB09021) ;南京中医药大学基础研究项目(10XJC04)
作者简介:徐建亚(1980—) ，女，硕士，助理研究员，研究方向:中药的细胞分子生物学作用机理。Tel: (025)85811146，E-mail:jianyaxu@
126． com
* 通信作者:汪受传(1946—) ，男，硕士，教授，研究方向:中医儿科学肺系疾病治疗。Tel:(025)86798182，E-mail:wscnj@ 126． com
摘要:目的 研究黄芩苷对呼吸道合胞病毒(RSV)复制、转录及融合效应的影响，探讨临床验方金欣口服液的药效物质
基础。方法 构建 RSV感染的 Hep-2 细胞模型，黄芩苷干预后采用体外转录法、实时荧光定量 PCR 法及免疫荧光显微
法分别检测黄芩苷对 RSV的 RNA聚合酶活性、核酸复制及 RSV 介导的细胞融合作用。结果 在 50 μmol /L 的最大无
毒浓度下，黄芩苷对 RSV的 RNA依赖的 RNA聚合酶活性、核酸复制、F融合蛋白表达及其介导的细胞融合效应无显著
作用。结论 黄芩苷不能抑制 RSV的转录、复制及融合。金欣口服液治疗 RSV肺炎的主要药效成分可能非黄芩苷而为
其他含量较低成分或黄芩苷代谢产物，有待进一步确定。
关键词:呼吸道合胞病毒;黄芩苷;RNA依赖的 RNA聚合酶;F融合蛋白
中图分类号:R966 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2011)12-2055-04
Effects of baicalin on transcription and duplication of RSV as well as fusion in-
duced by RSV
XU Jian-ya， XU Shan， CHEN Chao， LI Jia-xi， WANG Shou-chuan* ， SHAN Jin-jun
(First Clinical College，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046，China)
ABSTRACT:AIM To study whether the effects of baicalin (main component of Jinxin Oral Liquid)on tran-
scription and duplication of respiratory syncytial virus (RSV)as well as cell fusion induced by RSV will occur．
METHODS RSV-infected Hep-2 cell model was constructed and experimental methods，such as transcription in
vitro，real time quantitive PCR and immunofluorescence microscopy were used respectively to detect the RNA poly-
merase activity，nucleic acid duplication and cell fusion induced by RSV． RESULTS There was no significant
effect of baicalin at the maximum nontoxic concentration of 50 μmol /L on the observed index above． CONCLU-
SION Baicalin can not inhibit the transcription and duplication of RSV as well as cell fusion induced by RSV． A-
mong the curative effects of Jinxin Oral Liquid for RSV pneumonia，whether the antiviral activity of other low-con-
tent components，such as wogonin or metabolic products of baicalin remains to be determined．
KEY WORDS:respiratory syncyntial virus(RSV) ;baicalin;RNA dependent RNA polymerase;fusion protein
人呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncyntial Vi- rus，RSV)是目前全球范围内婴幼儿下呼吸道感染
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