全 文 ：收稿日期:2011-12-31 接受日期:2012-03-22
基金项目:山西省科技攻关项目(20080311052-1) ;山西省自然科
学基金资助项目(2009011013-1)
* 通讯作者 Tel:86-351-2272277;E-mail:xuehuiqing@ sina． com
天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2012，24:1408-1411
文章编号:1001-6880(2012)10-1408-04
狭苞橐吾中几种倍半萜类化合物的活性筛选
柴 智，樊慧杰，王永辉，薛慧清
*
山西中医学院实验管理中心，太原 030024
摘 要:本文对山西狭苞橐吾中倍半萜类化合物的生物学活性进行了筛选。用不同浓度的 4 种艾里莫芬烷型倍
半萜干预携带有 P53 和 SV40 肿瘤病毒大 T抗原基因的 AH109 菌液，采用酵母双杂交系统的 β-半乳糖苷酶活力
测定方法，分析了 4 种倍半萜对 P53 蛋白与 SV40 大 T抗原之间相互作用力的影响。发现 8β-methoxyeremophil-7
(11)-ene-12，8α(4β，6α)-diolide(1)和 8β-hydroxyl-6β-angloxyeremophil-7(11)-ene-12，8α-olide-15-oic acid(2)对
P53 蛋白及 SV40-大 T抗原相互作用没有显著影响，但是中、高浓度的 furanoeremophilan-4β，6α-olide(3)和低、
中、高浓度的 8β-hydroxyeremophil-7(11)-ene-12，8α (4β，6α)-diolide(4)对 P53 蛋白与 SV40 大 T 抗原之间相互
作用有抑制效应。说明从山西狭苞橐吾中提取出的化合物 3 和 4 对酵母双杂交系统中的 P53 和 SV40-大 T 抗
原的相互作用有生物学抑制活性。
关键词:狭苞橐吾;倍半萜;活性筛选
中图分类号:R284. 2 文献标识码:A
Activity Screening on Sesquiterpene Compounds
from Ligularia intermedia Nakai of Shanxi
CHAI Zhi，FAN Hui-jie，WANG Yong-hui，XUE Hui-qing*
Shanxi College of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan 030024，China
Abstract:To study the biological activity of sesquiterpene compounds from Ligularia intermedia Nakai of Shanxi． With
different concentrations of four kinds of sesquiterpenes intervening AH109 bacteria solution which carries P53 and SV40
tumor virus large T-Antigen genes，we adopted yeast two-hybrid system method for determination of beta-galactose gluco-
side enzyme activity to analyze the interaction effects on P53 protein and SV40 large T-antigen by the four compounds．
The results indicated that 8β-methoxyeremophil-7(11)-ene-12，8α(4β，6α)-diolide (1)and 8β-hydroxyl-6β-angloxyer-
emophil-7(11)-ene-12，8α-olide-15-oic acid (2)had no significant effects on the interaction between P53 protein and
SV40-large T-antigen． However，medium and high concentrations of furanoeremophilan-4β，6α-olide (3) ，low，medium
and high concentration of 8β-hydroxyeremophil-7(11)-ene-12，8α(4β，6α)-diolide (4)had an inhibitory effects on the
interaction between P53 protein and SV40 large T-antigen． It showed that compounds 3 and 4 which extracted from Ligu-
laria intermedia Nakai of Shanxi had biological inhibitory activity effects on the interaction between P53 and SV40-large
T-Antigen of the yeast two-hybrid system．
Key words:Ligularia intermedia;sesquiterpenes;activity screening
菊科橐吾属植物约有 130 余种，分布于我国西
北、西南、华北和东北［1］，其根、茎、叶皆可入药，有
清热解毒、消炎杀菌、化痰止咳和活血止痛等功效，
我国许多地区将多种该属植物的根和根茎作为“紫
菀”的替代品使用［2］，习称为“山紫菀”或“川紫菀”
等。故民间主要用于治疗痈肿、风湿感冒、咽喉炎、
肺结核咯血、小便不利及跌打损伤等症［3］。另有研
究报道，本属蓝灰组植物网脉橐吾、侧茎橐吾中的倍
半萜成分具有抗肿瘤、抗菌等生物学活性［4］。山西
有 7 种菊科橐吾属植物［5］，其中包括狭苞橐吾。本
研究小组对采自山西关帝山的狭苞橐吾进行了较为
系统的化学成分研究，从中分离鉴定出 28 个化合
物，其中 13 个为倍半萜类化合物［6-8］。本文对分离
得到的 4 个含量较高的艾里莫芬烷型倍半萜的生物
学活性进行了研究，采用酵母双杂交系统的 β-半乳
糖苷酶活力测定方法，以 P53 蛋白与 SV40 大 T 抗
DOI:10.16333/j.1001-6880.2012.10.021
原之间的相互作用作为药物分子靶标，测定 4 个倍
半萜类化合物对它们之间相互作用的影响，初步对
4 个倍半萜进行活性筛选。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 菌株、质粒和试剂
MATCHMAKER双杂交系统 3(包括 pGBKBT7
质粒包含 Trp 营养选择和 APR 抗生素标记，pG-
BADT7 质粒包含 Leu营养选择和 Kanr抗生素标记，
pGBADT7-SV40，pGBKBT7-P53，pGBADT7-Lam 质
粒，酵母菌 AH109) (美国 Clontech 公司) ;携带人
P53 蛋白与 SV40 大 T 抗原相互作用的阳性克隆菌
株 AH109(本实验室自制)。YPD 培养基(美国
Clontech公司) ;邻硝基苯-β-半乳吡喃糖苷(o-nitro-
phyl-β-D-galactopyranoside，ONPG;美 国 Sigma 公
司) ;其余均为国产试剂。
1． 1． 2 阳性药物顺铂(香港 Faulding 公司)，临用
前用无菌生理盐水配制为 l mg /mL的工作液。
1． 1． 3 倍半萜样品
参考文献［9］，对 4 种倍半萜进行了分离，并分别
鉴定为:8β-methoxyeremophil-7(11)-ene-12，8α(4β，
6α)-diolide (1)、8β-hydroxyl-6β-angloxyeremophil-7
(11)-ene-12，8α-olide-15-oic acid (2)、furanoere-
mophilan-4β，6α-olide (3)、8β-hydroxyeremophil-7
(11)-ene-12，8α(4β，6α)-diolide(4)。实验时称取
一定量的样品，溶于二甲亚砜(DMSO)中，浓度为 10
mg /mL，4 ℃保存备用。
1． 1． 4 仪器
ESCO Opti-MAIR ACB-A 型超净工作台(新加
坡艺思高科技有限公司) ;HZQ-F160 全温震荡培养
箱(上海安亭科学仪器制造厂) ;721 型紫外分光广
度计(上海第三分析仪器厂)。
1． 2 方法
1． 2． 1 样品的毒性检测
分别将 50、100、150 μL 待测样品溶液加入 5
mL含酵母菌 AH109 菌株的 YPD 培养基中，体积差
用溶剂补齐;以加入 150 μL YPD 培养液，不加入待
测样品溶液为空白对照组。30 ℃、180 rpm 振摇过
夜。经过 16 ～ 18 h的培养，在波长 600 nm处测定 A
值以判断四种倍半萜类化合物对酵母生长的影响，
实验平行三次。
1． 2． 2 系统检测及样品的活性筛选
在 SD /-Leu /-Trp /-Ade /-His液体培养基中活化
携带有 P53 和 SV40 肿瘤病毒大 T 抗原基因的
AH109 菌株(空白对照组) ，在 SD /-Leu /-Trp液体培
养基中活化携带有层粘连蛋白 Lam 和 SV40 肿瘤病
毒大 T抗原基因的 AH109 菌株(阴性对照组) ;将药
品顺铂(阳性对照组)和 4 种倍半萜类化合物(实验
组)分别按三个浓度接种于携带有 P53 和 SV40 肿
瘤病毒大 T抗原基因的 AH109 菌株的液体中，体积
差用溶剂补齐，每个浓度接种三管(见表 1)。30 ℃
振摇(180 rpm)16 ～ 18 h后取出，以 ONPG为反应底
物分析检测 β-半乳糖苷酶的活力。
表 1 接种条件
Table 1 Inoculation conditions
组别
Group
YPDA
(mL)
三蒸水
Three distilled
water (μL)
待测组分溶液
Pending test components
solution (μL)
共转化菌液
Co-transformation
of bacteria (μL)
空白对照组 Control 5 150 0 50
阴性对照组 Negative control 5 150 0 50
低浓度实验组 Low concentration 5 100 50 50
中浓度实验组 Middle concentration 5 50 100 50
高浓度实验组 High concentration 5 0 150 50
低浓度阳性对照组 Low concentration of positive control 5 100 50 50
中浓度阳性对照组 Middle concentration of positive control 5 50 100 50
高浓度阳性对照组 High concentration of positive control 5 0 150 50
1． 2． 3 β-半乳糖苷酶测定及计算方法［10］
将菌液离心后，用 Z-buffer 清洗一次，再离心，
弃上清，然后用 0． 3 mL Z-buffer 重悬细胞。向 1． 5
mL微量离心管中加入 0． 1 mL 菌液，在液氮中裂解
9041Vol. 24 柴 智等:狭苞橐吾中几种倍半萜类化合物的活性筛选
2 次以上，加入 0． 7 mL Z-buffer 巯基乙醇、0． 16 mL
ONPG(4 mg /mL)，混匀后 30 ℃保温记时至溶液变
黄，加入 0． 4 mL 1 M Na2CO3，混匀，14，000 rpm 离
心 10 min ，取上清液，比色法测定 A420值。
β-半乳糖苷酶单位数［11］ = 1000 × A420 / (t × V
× A600)。其中:
t =反应开始到溶液变黄的时间;V = 0． 1 mL ×
浓缩因子。
1． 3 统计学分析
文中数据以(x ± s)表示，采用 SPSS 17． 0 统计
软件进行单因素方差分析，P ＜ 0． 05 为差异有统计
学意义。
2 结果
2． 1 系统检测
β-半乳糖甘酶活力(IU )在阴性对照组为 1． 10
± 0． 23，低浓度阳性对照组为 22． 35 ± 0． 57，而空白
对照组为 41． 35 ± 0． 68，表明作者构建的酵母双杂
交系统工作正常，可以定量检测出目标蛋白之间存
在的相互作用。
2． 2 样品的毒性检测结果
将不同浓度的 4 种倍半萜样品加入含有 AH109
菌株的 YPD培养基中，培养 16 ～ 18 h，测定各培养
基的 A600 nm值。4 种倍半萜的不同浓度组与空白对
照组相比，均无统计学差异，即四个倍半萜类化合物
均未显示出对酵母生长有显著性影响作用，同时排
除了溶剂 DMSO 对酵母生长的影响。样品可以用
于后续活性筛选实验。
2． 3 样品的活性筛选结果
30 ℃保温，180 rpm振摇过夜，在细胞生长 16 ～
18h后通过测定 β-半乳糖苷酶活力反映酵母体内
P53 蛋白与 SV40 大 T 抗原之间相互作用力的大小，
进而进行样品活性的筛选(见表 2)。实验观察到化
合物 1 和化合物 2 与空白对照组相比，对 P53 合
SV40-大 T抗原的相互作用没有显著性差异。化合
物 3 在 50 μL时对 P53 和 SV40-大 T 抗原之间的相
互作用无明显影响，在 100 μL 和 150 μL 时对两蛋
白的相互作用有明显影响，但两个体积之间比较无
显著性差异。化合物 4 在 50、100、150 μL不同体积
情况下，对两蛋白的相互作用均有明显抑制作用，抑
制作用呈现增高趋势，但无统计学差异。
表 2 不同样品对 β-半乳糖苷酶活力的影响
Table 2 Effects of differenrt samples on β-Galactose glucoside enzyme activity
样品 Sample
梅活
Enzyme activity
加药量 D osage(μL)
50 100 150
顺 铂 Cisplatin 41． 35 ± 0． 68 22． 35 ± 0． 57 20． 67 ± 0． 58 16． 75 ± 0． 72
化合物 1 compound 1 40． 56 ± 0． 73 41． 20 ± 0． 75 40． 98 ± 0． 85 41． 86 ± 1． 04
化合物 2 compound 2 39． 61 ± 0． 84 40． 46 ± 1． 19 40． 84 ± 1． 51 42． 99 ± 0． 61
化合物 3 compound 3 39． 95 ± 0． 87 35． 78 ± 1． 94 30． 21 ± 1． 79* 29． 15 ± 1． 58＊＊
化合物 4 compound 4 42． 84 ± 0． 91 31． 18 ± 1． 73* 29． 98 ± 1． 64* 27． 41 ± 0． 84＊＊
注:与空白对照组比较:* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01
Note:Compared with control group:* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01
3 讨论
橐吾属植物在我国分布广泛，我国是在 80 年代
中期开始对其化学成分进行研究。为了增强疗效、
减小毒性，本课题组前期分离纯化了其中的化学成
分倍半萜，本实验为进一步对这类化合物进行活性
筛选研究。
酵母双杂交系统是一种在酵母体内研究蛋白
质-蛋白质之间相互作用的快速灵敏的方法［12］，其
在小分子化合物药物筛选方面，具有巨大潜力。
P53 蛋白是一种抑癌基因产物，当 P53 蛋白与病毒
癌蛋白 SV40 大 T 抗原之间相互作用时会导致其功
能的丧失从而引起多种癌变的发生［13］，本课题选择
携带人 P53 蛋白与 SV40 大 T 抗原为酵母双杂交系
统的靶蛋白对，通过分析 β-半乳糖苷酶活力来明确
4 种倍半萜对酵母体内 P53 蛋白与 SV40 大 T 抗原
之间相互作用力的大小。
本课题应用酵母双杂交系统的 β-半乳糖苷酶
活力测定方法，研究来自于山西关帝山狭苞橐吾的
4 个倍半萜类化合物。结果发现中、高剂量的化合
0141 天然产物研究与开发 Vol. 24
物 3 和低、中、高剂量的化合物 4 对于 P53 蛋白与
SV40 大 T抗原之间的相互作用力有影响，分别在一
定程度上降低这两个蛋白之间的相互作用力;其中，
化合物 4 随着样品量得增加，对两蛋白相互作用的
抑制作用呈轻微增高趋势。虽然不同剂量的化合物
1 和化合物 2 对 P53 和 SV40-大 T 抗原之间的相互
作用均没有显著影响，但不排除它们可以与加强或
抑制作用的组分起协同作用。这些仍需要进一步的
深入研究。本课题结果从分子水平阐明倍半萜的生
物学活性，并为采自山西关帝山狭苞橐吾中提取的
倍半萜类化合物的潜在抗肿瘤药物机理提供了一些
启示。
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