全 文 ：书论著 文章编号:1000-5404(2012)18-1844-05
南赤瓟提取物诱导宫颈癌 HeLa细胞凋亡及作用机制研究
石孟琼1，刘 雄2，周继刚2，杨文雁1，罗 涛2，熊兴军3 (443002 湖北 宜昌，三峡大学医学院:基础医学实验中心1，中医
临床医学院内科住院部2;443500 湖北 长阳，长阳县中医院药剂科3)
［摘要］ 目的 观察南赤瓟提取物对宫颈癌 HeLa细胞凋亡的诱导作用，并探讨其可能的作用机制。方法 用不同
浓度的南赤瓟提取物(0． 10、0． 25、0． 50、1． 00、2． 00 mg /ml)于不同作用时间(24、48、72 h)处理宫颈癌 HeLa 细胞后，采用
MTT法检测不同浓度的南赤瓟提取物在不同作用时间下对 HeLa细胞增殖率的影响;用 0． 50 和 1． 00 mg /ml 的南赤瓟提
取物处理宫颈癌 HeLa 细胞 48 h 后 Hoechst33258 染色观察细胞形态变化，Annexin V-FITC /PI 染色测定细胞凋亡率，JC-1
染色法测定细胞线粒体跨膜电位水平，Caspase试剂盒检测 HeLa 细胞中 Caspase-9 和 Caspase-3 的活性，荧光定量 PCR 测
定 Bcl-2 和 Bax mRNA表达，并计算 Bcl-2 与 Bax的比值。结果 南赤瓟提取物对 HeLa细胞的生长抑制作用呈明显的时
间-剂量依赖性;南赤瓟提取物(0． 50 和 1． 00 mg /ml)处理能显著降低 HeLa 细胞线粒体膜电位，促进 HeLa 细胞凋亡(P ＜
0. 05，P ＜ 0. 01) ;上调 Bax mRNA表达，下调 Bcl-2 mRNA表达和 Bcl-2 与 Bax的比值以及增强 Caspase-9 和 Caspase-3 的活
性(P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01)。结论 南赤瓟提取物可诱导 HeLa细胞凋亡，其作用机制与降低 HeLa细胞线粒体膜电位及调节
凋亡相关基因 Bcl-2、Bax和 Caspase-9、Caspase-3 的表达有关。
［关键词］ 南赤瓟;宫颈癌;HeLa细胞;凋亡
［中图法分类号］ R282． 71;R285． 5;R737． 33 ［文献标志码］ A
［基金项目］ 湖北省卫生厅中医药中西医结合科研项目(2010Z-Y09)
［通信作者］ 刘 雄，电话:(0717)6912330，E-mail:13997652561@ 163． com
Apoptosis of cervix cancer HeLa cells induced by Thldiantha nudiflora Hemsl extract
Shi Mengqiong1，Liu Xiong2，Zhou Jigang2，Yang Wenyan1，Luo Tao 2，Xiong Xingjun3(1Experimental Center of Basic Med-
icine，2Department of Internal Medicine，Hospital of Traditional Chinese Medicine，Medical College of Three Gorges University，Yichang，
Hubei Province，443002;3Department of Pharmacy，Changyang Hospital of Traditional Chinese Medicine，Changyang，Hubei Province，
443500，China)
［Abstract］ Objective To investigate the effect of Thldiantha nudiflora Hemsl extract on the apoptosis
in human cervix cancer HeLa cells． Methods HeLa cells were treated with Thldiantha nudiflora Hemsl extract
at different concentrations of 0． 10，0． 25，0． 50，1． 00，and 2． 00 mg /ml for different times (24，48，and 72
h)． Cell viability was determined by MTT assay． After HeLa cells were treated with Thldiantha nudiflora Hemsl
extract (0． 5 and 1． 0 mg /ml) ，cell morphology was examined by hoechst33258 through fluorescence microsco-
py． Annexin V /PI double-staining was performed to detect apoptosis of HeLa cells by flow cytometry． The mito-
chondrial membrane potential of HeLa cells was measured by JC-1 staining． The activities of Caspase-9 and
Caspase-3 were measured by Caspase assay kit． The expression of Bcl-2 and Bax at mRNA level was detected
by real-time PCR，and Bcl-2 /Bax ratio was analyzed． Results The inhibitory effect of Thldiantha nudiflora
Hemsl extract on HeLa cells showed a significant time-dose response． Thldiantha nudiflora Hemsl extract (0． 50
and 1． 00 mg /ml)significantly decreased the mitochondrial membrane potential of HeLa cells，promoteed apop-
tosis(P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01，respectively) ，up-regulated the mRNA expression of Bax，down-regulated the ex-
pression of Bcl-2 and Bcl-2 /Bax ratio，and increased the activities of Caspase-9 and Caspase-3，when compared
with the negative control group(P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01)． Conclusion Thldiantha nudiflora Hemsl extract effec-
tively induces the apoptosis in HeLa cells． The mechanism may be related to decreasing the mitochondrial mem-
brane potential of HeLa cells，and regulating the expression of apoptosis-related genes Bcl-2，Bax，Caspase-9，
and Caspase-3．
［Key words］ Thldiantha nudiflora Hemsl;cervix cancer;HeLa cells;apoptosis
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2012 年 9 月 30 日
第 三 军 医 大 学 学 报
J Third Mil Med Univ
Vol． 34，No． 18
Sep． 30 2012
DOI:10.16016/j.1000-5404.2012.18.004
Supported by the Project of Traditional Chinese Medicine and Integration With Western Medicine From Department of Public Health of Hubei Province (2010Z-
Y09)． Corresponding author:Liu Xiong，Tel:86-717-6912330，E-mail:13997652561@ 163． com
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，恶性程度高，易
复发，死亡率高，目前已成为全球性的公共卫生问
题［1］。据 WHO统计数据显示，全球每年新发宫颈癌
病例约有 55． 51 万，其中我国新发病例占 28． 8%，达
到 13． 15 万;全世界每年约有 30． 98 万死于宫颈癌，我
国约有 2 ～ 3 万［2 － 3］。值得关注的是，我国当前宫颈癌
的发病率不仅有上升趋势，而且是发病年龄有明显的
年轻化倾向，因而宫颈癌的防治任务仍十分艰巨［3］。
近年来天然药物以毒性低、安全范围广、药源丰富越来
越受到人们的关注，已成为肿瘤治疗领域的一大特色。
寻找高效低毒中药来改变肿瘤的生物学行为已成为肿
瘤治疗的重要策略。南赤瓟为葫芦科植物 Thldiantha
nudiflora Hemsl的根。民间习称野南瓜、毛土瓜、球子
莲，苗名称四棍汝，具有清热解毒，理气活血，泻热祛
淤，消肿散结，止痢通乳之功效［4］，主要用于治疗痈
肿、肠炎、痢疾、毒蛇咬伤及乳汁不通等症，鄂西、湘西
土家民间有将它用于治疗宫颈癌的传统，但在治疗宫
颈癌的基础研究方面鲜有报道。本实验初步观察南赤
瓟提取物对人宫颈癌 HeLa 细胞株体外生长的影响，
并探讨其作用机制，以期为其临床应用及研究开发提
供理论基础和实验依据。
1 材料与方法
1． 1 实验药物
南赤瓟购自宜昌市中医院，并经三峡大学植物与天然产物
湖北省重点实验室汪鋆植教授鉴定为葫芦科南赤瓟植物南赤
瓟，该药材标本保存于三峡大学国家中医药管理局中药药理科
研三级实验室。南赤瓟提取物制备:取南赤瓟药材 500 g，粉碎
成粗粉，加 10 倍量蒸馏水浸泡 2 h后，加热回流提取 3 次，每次
3 h，合并滤液，3 500 r /min，离心 20 min，得提取液，旋转蒸发器
干燥得南赤瓟浸膏，二甲基亚砜(DMSO)溶解浸膏样品配制成
浓度为 10 mg /ml提取物药液，再以细胞培养液稀释成所需浓
度，经过 0． 22 μm孔径滤膜过滤除菌后供实验用。
1． 2 细胞
宫颈癌 HeLa细胞株由中科院上海细胞生物研究所细胞库
提供。
1． 3 主要试剂与仪器
RPMI1640 细胞培养基、小牛血清、胰酶、DMSO(Gibco 公
司) ;碘化丙啶(PI)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、线粒体膜电位检
测试剂盒(JC-1) (Sigma公司) ;Hoechst33258(凯基生物公司) ;
Annexin V /FITC(晶美生物工程有限公司) ;Caspase-9 和
Caspase-3 活性检测试剂盒(碧云天) ;Bcl-2、Bax 和 GAPDH(上
海生工合成，具体引物序列见表 1) ;Trizol 和 DEPC(上海生
工) ;Prime ScriptTM RT reagent Kit、Taq DNA 聚合酶(大连宝生
物工程有限公司) ;其他试剂均为市售分析纯。GENios 酶标仪
(瑞士 Tecan公司) ，EPICS XL-4 流式细胞仪、荧光检测仪(美国
Backman Coulter公司) ;CKX41 倒置显微镜(日本，奥林巴斯) ;
NU-4750E 型 CO2培养箱(Nu Aire 公司) ;SW-4T-2F 洁净工作
台(上海博讯实业有限公司医疗设备厂) ;LS-B50L立式压力蒸
汽灭菌器(上海华线医用核子仪器有限公司) ;CDF-3220 多元
定量 PCR仪(美国MJ Research 公司) ;Gene Genius凝胶分析系
统(英国 SYNGNE公司)。
表 1 荧光定量 PCR引物序列
基因
名称
上游 下游
片段长
度 (bp)
Bcl-2 5-TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3 5-TCACTTGTGGCTCAGATAGG-3 280
Bax 5-GCGTCCACCAAGAAGCTGAG-3 5-ACCACCCTGGTCTTGGATCC-3 311
GAPDH 5-GGGAGCCAAAAGGGTCATCTC-3 5-CCATGCCAGTGAGCTTCCGTTC-3 353
1． 4 方法
1． 4． 1 HeLa细胞培养 用含 10%小牛血清的 RPMI1640 培
养基，置 37 ℃、CO2体积分数为 5%的饱和湿度条件下培养。
HeLa细胞贴壁生长，取对数生长期细胞用于实验。
1． 4． 2 南赤瓟提取物对 HeLa 细胞的生长抑制检测 取对
数期生长的 HeLa细胞配制成细胞密度为 1 × 105 /ml的细胞悬
浮液，接种于 96 孔板中，每孔 100 μl，5% CO2、37 ℃孵育，待细
胞贴壁后，更换培养液，分别设阴性对照孔(不加南赤瓟提取物
而加等量的培养液)、空白对照孔(不加细胞，其他条件与前相
同)和南赤瓟提取物实验组，实验组加入不同质量浓度的南赤
瓟提取物 100μl，根据预实验的实验结果，使其终质量浓度分别
为 0． 10、0． 25、0． 50、1． 00、2． 00 mg /ml，每组设 4 个复孔。将培
养板移入 CO2孵箱中继续培养，分别于 24、48 和 72 h后取出培
养板，每次加入新配制的 5 mg /ml MTT液 20 μl，37 ℃避光孵育
4 h，终止培养。吸去上清液，每孔加入 DMSO 150 μl，置摇床上
低速振荡 10 min后，用酶标仪于 490 nm 处测量各孔的光密度
值 D(490) ，根据公式计算:细胞抑制率 =［1 －实验组 D(490)/
对照组 D(490) ］× 100%。
1． 4． 3 南赤瓟提取物对 HeLa 细胞形态学变化观察 取对
数生长期的 HeLa细胞，接种于 6 孔板中，每个孔中分别接种 1
× 105 /ml细胞。培养 24 h待细胞完全贴壁展开，更换培养液，
实验分别设阴性对照孔和 0． 50 和 1． 00 mg /ml的南赤瓟提取物
培养孔，各 3 个复孔，继续培养 48 h 后，终止培养。弃去培养
基，用 4 ℃预冷的 PBS缓冲液洗涤 3 次，4%多聚甲醛 4 ℃固定
30 min，弃固定液，PBS 冲洗 3 次，加入适量 1 μg /ml 的荧光染
液 Hochest 33258，避光染色 15 min，弃掉，用 PBS 洗涤，自然晾
干，在荧光显微镜下观察凋亡细胞形态学变化。
1． 4． 4 南赤瓟提取物对 HeLa 细胞凋亡分析 阴性对照组
和南赤瓟提取物组(0． 50 和 1． 00 mg /ml)HeLa 细胞分别用相
应浓度的药物处理，于培养箱内继续培养 48 h 后，收集细胞，
2 000 r /min，离心 5 min，用 PBS以洗涤 2 次，然后加入 Annexin
V-FITC试剂盒中 500 μl 的 Binding Buffer 悬浮细胞，调节细胞
浓度为 1 × 106 /ml，取 100 μl上述细胞，分别按试剂盒说明加入
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PI和 AnnexinⅤ-FITC，混匀后室温避光 15 min 后，用流式细胞
仪检测细胞凋亡。
1． 4． 5 南赤瓟提取物对 HeLa 细胞线粒体的跨膜电位分析
阴性对照组和南赤瓟提取物组(0． 50 和 1． 00 mg /ml)HeLa
细胞分别用相应浓度的药物处理，于培养箱内继续培养 48 h
后，收集细胞，2 000 r /min，离心 5 min，用 PBS以洗涤 2 次，调节
细胞浓度为 1 × 106 /ml，取 100 μl 上述细胞，加入 JC-1(1 mg/L)
10 μl，37 ℃避光孵育 10 min，上机检测。
1． 4． 6 南赤瓟提取物对 HeLa 细胞 DNA ladder 分析 阴性
对照组和南赤瓟提取物组(0． 50 和 1． 00 mg /ml)HeLa 细胞分
别用相应浓度的药物处理，于培养箱内继续培养 48 h 后，收集
细胞，按如下步骤操作:用 PBS 洗 2 遍加入 50 μl 细胞裂解液，
混匀，37 ℃水浴保温至混合物变得清亮，然后 13 000 r /min，离
心 5 min，收集上清液于另一微量离心管中;依次用等体积酚 ∶
氯仿∶异戊醇(25∶ 24∶ 1)和氯仿抽提 1 次;然后收集上清液加入
1 /10 体积 3 mol /L醋酸钠和 2 倍体积冷乙醇，于 － 20 ℃沉淀过
夜;次日于 4 ℃，12 000 r /min，离心 10 min，弃上清液室温晾干，
加入 20 μl TE缓冲液，1 μl RNA 酶，37 ℃保温 1 h;然后加入
4 μl 样品缓冲液，混匀，于 2． 0%琼脂糖凝胶上电泳，100 V 电
压下电泳 1． 0 h，凝胶成像系统观察结果。
1． 4． 7 南赤瓟提取物对 HeLa细胞 Caspase活性检测 阴性
对照组和南赤瓟提取物组(0． 50 和 1． 00 mg /ml)HeLa 细胞分
别用相应浓度的药物处理，于培养箱内继续培养 48 h 后，收集
细胞，用 PBS以洗涤 2 次，离心(2 000 × g，5 min) ，收集沉淀细
胞加入 50 μl 冰冷的裂解缓冲液，反复吹打，于冰浴中裂解
60 min，离心(4 ℃，10 000 × g，5 min) ，吸取上清液至 EP 管
中，进行 Caspase活性检测，具体方法按照试剂盒说明书进行。
1． 4． 8 荧光定量 PCR 测定 Bcl-2、Bax mRNA 表达 阴性对
照组和南赤瓟提取物组(0． 50 和 1． 00 mg /ml)HeLa 细胞分别
用相应浓度的药物处理，于培养箱内继续培养 48 h 后，收集细
胞，用 PBS以洗涤 2 次，离心，收集沉淀细胞。用 Trizol 试剂提
取心肌细胞总 RNA，按说明书操作。总 RNA 经紫外分光光度
计测定 260 nm与 280 nm处光密度比值［D(260)/D(280) ］为
1． 8 ～ 2． 0。将提取的 RNA反转录为 cDNA(按照反转录试剂盒
严格操作) ;在 RNase Free 处理过的反应管中加入 SYBR
Premix Ex TaqTM Ⅱ (2 × ) 12． 5 μl，PCR Forward Primer
(10 μmol /L)1 μl，PCR Reverse Primer(10 μmol /L)1 μl，DNA
模板 2 μl，dH2O(灭菌蒸馏水)8． 5 μl，最终反应体系为 25 μl。
将样品放入实时定量 PCR扩增仪中按 95 ℃预变性 30 s、95 ℃
变性 5 s、退火 30 s、72 ℃延伸 20 s条件扩增 30 次。利用 PCR
仪汇出扩增曲线，进行结果分析。
1． 5 统计学分析
每项实验至少重复 3 次，所有实验数据以 珋x ± s 表示，在
SPSS 13． 0 统计软件上进行单因素方差分析及 LSD-t检验。
2 结果
2． 1 南赤瓟提取物对 HeLa细胞的生长抑制作用
由表 2 可知:南赤瓟提取物实验组在不同作用时间(24、
48、72 h)点和不同浓度(0． 10 ～ 2． 00 mg /ml)时对 HeLa细胞生
长均有抑制作用，与阴性对照组比较，差异具有显著性(P ＜
0. 01) ;而且同一浓度的南赤瓟提取物对 HeLa细胞的生长抑制
率随作用时间的延长而提高，与作用 24 h 时间比较，差异具有
显著性(P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01)。实验结果显示，南赤瓟提取物对
HeLa细胞的生长抑制作用呈明显的时间-剂量依赖性。
表 2 南赤瓟提取物对宫颈癌 HeLa细胞生长抑制率的影响
(%，n = 4，珋x ± s)
浓度(mg /ml)
作用时间(h)
24 48 72
0(阴性对照组) 0． 00 ± 0． 00 0． 00 ± 0． 00 0． 00 ± 0． 00
0． 10 17． 90 ± 2． 46 a 20． 23 ± 3． 75 a 25． 33 ± 4． 48 ab
0． 25 26． 43 ± 4． 31 a 33． 10 ± 4． 98 a 35． 35 ± 5． 61 ab
0． 50 36． 55 ± 2． 75 a 44． 23 ± 3． 03 ac 50． 25 ± 3． 93 ac
1． 00 54． 13 ± 4． 04 a 63． 28 ± 2． 70 ac 65． 78 ± 3． 90 ac
2． 00 63． 98 ± 2． 98 a 68． 83 ± 2． 10 ab 72． 95 ± 3． 27 ac
a:P ＜ 0. 01，与阴性对照组比较;b:P ＜ 0. 05，c:P ＜ 0. 01，与同一浓
度南赤瓟提取物作用 24h比较
2． 2 南赤瓟提取物对 HeLa细胞形态学变化的影响
经 Hoechst33258 荧光染色后，荧光显微镜下可见阴性对照
组细胞膜完整、胞核圆形或椭圆形，核形态饱满，核质着色深，
密度均匀一致(图 1A) ;用南赤瓟提取物(0． 50 和 1． 00 mg /ml)
处理 48 h后，可见部分细胞膜皱缩，表面粗糙，核变小，染色质
浓集，荧光增强，并产生形似块状的细胞碎片，出现凋亡小体，
呈现典型的凋亡形态特征，以 1． 0 mg /ml南赤瓟提取物处理组
更为明显(图 1B、C)。
A B C
50 μm 50 μm 50 μm
A:阴性对照组;B:0． 50 mg /ml南赤瓟提取物组;C:1． 00 mg /ml南赤瓟提取物组
图 1 各组南赤瓟提取物对 HeLa细胞形态学变化的影响
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2． 3 南赤瓟提取物对 HeLa细胞凋亡的影响
HeLa 细胞经南赤瓟提取物(0． 50、1． 00 mg /ml)处理 48 h
后出现了明显的凋亡，而且随着南赤瓟提取物浓度增加凋亡率
提高，与阴性对照组比较，具有显著性差异(P ＜ 0. 01) ，见表 3。
实验表明南赤瓟提取物能诱导宫颈癌 HeLa细胞发生凋亡。
表 3 各组南赤瓟提取物对 HeLa细胞凋亡率、线粒体膜电位的影响
(n = 5，珋x ± s)
组别 剂量(mg /ml) 凋亡率(%) 膜电位(mV)
阴性对照组 － 2． 54 ± 0． 80 154． 90 ± 21． 17
南赤瓟提取物组 0． 50 22． 31 ± 2． 49 b 124． 81 ± 18． 72a
南赤瓟提取物组 1． 00 30． 88 ± 3． 43 b 117． 75 ± 19． 37 b
a:P ＜ 0. 05，b:P ＜ 0. 01，与阴性对照组比较
2． 4 南赤瓟提取物对HeLa细胞线粒体膜电位的影响
如表 3 所示，南赤瓟提取物可使 HeLa 细胞线粒体膜电位
快速下降，与阴性对照组比较，具有显著性差异(P ＜ 0. 01) ，且
随着南赤瓟提取物给药浓度的升高而增强。实验结果表明南
赤瓟提取物对 HeLa细胞线粒体具有毒性作用。
2． 5 南赤瓟提取物对 HeLa细胞 DNA ladder的影响
细胞凋亡时主要的生化特征是染色质 DNA在核小体单位
之间的连接处断裂，形成 50 ～ 300 kb 的 DNA 大片段，或 180 ～
200 bp整数倍的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯形电泳
图谱。脂糖凝胶电泳结果显示，南赤瓟提取物处理组出现典型
的凋亡细胞 DNA 梯级格局，并且随着用药浓度的增加，DNA
ladder的数目增加(图 2)。
M 1 2 3
2 000 bp→
1 000 bp→
750 bp→
500 bp→
250 bp→
100 bp→
M:标准;1:阴性对照组;2:0． 50 mg /ml南赤瓟提取物组;3:1． 00 mg /ml
南赤瓟提取物组
图 2 各组南赤瓟提取物对 HeLa细胞 DNA ladder的影响
2． 6 南赤瓟提取物对 HeLa 细胞 Caspase-9、Caspase-3
活性的影响
由表 4可知，HeLa细胞用南赤瓟提取物(0． 5 和 1． 0 mg/ml)
处理后可使细胞中 Caspase-9、Caspase-3 活性分别提高 56. 2%、
74． 7%和 49． 8%、85． 0%，与阴性对照组比较具有显著性差异
(P ＜ 0. 01) ，且随着南赤瓟提取物给药浓度的升高而增强。
表 4 各组南赤瓟提取物对 HeLa细胞 Caspase-9、Caspase-3 活性
的影响 (n = 5，珋x ± s)
组别 剂量(mg /ml)Caspase-3(U /ml) Caspase-9(U /ml)
阴性对照组 － 61． 46 ± 9． 80 69． 37 ± 8． 61
南赤瓟提取物组 0． 50 92． 06 ± 10． 77 a 108． 38 ± 10． 27 a
南赤瓟提取物组 1． 00 113． 68 ± 14． 67 a 121． 18 ± 9． 28a
a:P ＜ 0. 01，与阴性对照组比较
2． 7 南赤瓟提取物对 HeLa 细胞 Bcl-2、Bax mRNA 表
达的影响
如表 5和图 3、4所示，用南赤瓟提取物(0． 5 和 1． 0 mg /ml)
处理后可使 HeLa细胞中 Bcl-2 mRNA 表达量降低，Bax mRNA
表达量升高，Bcl-2 /Bax的比值降低，与阴性对照组比较具有显
著性差异(P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，且随着南赤瓟提取物给药浓度
的升高而增强。
表 5 各组南赤瓟提取物对 HeLa细胞 Bcl-2、Bax mRNA表达的
影响 (珋x ± s，n = 3)
组别
剂量
(mg /ml)
Bcl-2 /GAPDH Bax /GAPDH Bcl-2 /Bax
阴性对照组 － 0． 643 ± 0． 031 0． 442 ± 0． 033 1． 460 ± 0． 081
南赤瓟提取物组 0． 5 0． 537 ± 0． 040a 0． 512 ± 0． 023a 1． 048 ± 0． 033b
南赤瓟提取物组 1． 0 0． 387 ± 0． 021b 0． 611 ± 0． 039b 0． 636 ± 0． 070b
a:P ＜ 0. 05，b:P ＜ 0. 01，与阴性对照组比较
1 2 3 M
353 bp311 bp→280 bp→
←500 bp←400 bp←300 bp
←200 bp
→
1:Bcl-2;2:Bax;3:GAPDH;M:标准
图 3 Bcl-2、Bax和 GAPDH mRNA电泳结果
1 2 3
Bax→
Bcl鄄2→
GAPDH→
←311 bp
←280 bp
←353 bp
1:阴性对照组;2:0． 50 mg /ml南赤瓟提取物组;3:1． 00 mg /ml南赤
瓟提取物组
图 4 各组南赤瓟提取物对 HeLa细胞 Bcl-2、Bax mRNA表达的影响
3 讨论
近年来从天然药物中寻找疗效确切且副作用小的
抗肿瘤药已成为国内外重要的课题，围绕天然药物抗
肿瘤的机制研究方兴未艾，先后研究开发了鬼臼毒素、
长春新碱、紫杉醇、三尖杉酯碱等系列天然抗肿瘤药物
及制剂，广泛应用于临床各种类型肿瘤疾病的防治，取
得了较好的疗效。南赤瓟为我国土家族民间习用的传
统药物，具有清热解毒，理气活血，泻热祛淤，消肿散
结，止痢通乳之功效［4］，主要用于治疗痈肿、肠炎、痢
疾、毒蛇咬伤及乳汁不通等症，并有将它用于宫颈癌防
治的传统，然而有关其抗肿瘤的分子机制方面研究未
见报道。本实验将在其临床疗效得以充分肯定的基础
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第 34 卷第 18 期
2012 年 9 月 30 日
第 三 军 医 大 学 学 报
J Third Mil Med Univ
Vol． 34，No． 18
Sep． 30 2012
上，从细胞水平进一步证实其对诱导宫颈癌 HeLa 细
胞凋亡及作用机制，为此我们进行了本实验。实验结
果表明，南赤瓟提取物在不同作用时间(24、48、72 h)
点和不同浓度(0． 10 ～ 2． 00 mg /ml)时对 HeLa 细胞生
长均有抑制作用，随着南赤瓟提取物浓度的增加和作
用时间的延长，其抑制作用更加明显，表明南赤瓟提取
物对 HeLa细胞生长的抑制作用与药物浓度和作用时
间有密切关系。
肿瘤的发生、发展是由于细胞增殖和凋亡失调而
导致细胞无限增殖所致，因此抑制肿瘤细胞增殖及促
进其凋亡成为评估抗癌药物作用能力的重要指标［5］。
本实验用 Hoechst33258 染色和细胞 DNA 片段化及流
式细胞术分析后发现 HeLa 细胞经南赤瓟提取物处理
后细胞膜皱缩，染色质浓集，荧光增强，出现凋亡小体
和 DNA片断化等典型的细胞凋亡特征及凋亡率提高，
表明南赤瓟提取物抑制 HeLa 细胞增殖的机制之一是
通过诱导细胞凋亡而实现的。
目前认为细胞凋亡的触发是一个有多种基因参与
的级联式表达的结果，药物诱导肿瘤细胞凋亡受一个
或多个基因的调控［6］。在细胞凋亡调的诸多控因素
中，Bcl-2 家族基因备受瞩目，Bcl-2 与 Bax 基因均属于
Bcl-2 家族。Bcl-2 基因与 Bax 基因结合形成异二聚
体，当 Bax表达增强时，Bax 同源二聚体形成增多，细
胞凋亡加速;当 Bcl-2 表达增多时，Bax 同源二聚体解
离，形成 Bcl-2 /Bax异源二聚体，抑制 Bax /Bax 二聚体
诱导的细胞凋亡作用，因此 Bcl-2 /Bax 的比例是细胞
凋亡发生与否的关键因素。本研究中，我们用荧光定
量 PCR检测了 HeLa细胞在南赤瓟提取物处理后 Bcl-
2、Bax mRNA表达，结果发现用南赤瓟提取物处理后
Bax mRNA 表达水平明显增加，Bcl-2 mRNA 表达和
Bcl-2 与 Bax 的比值显著降低。实验提示南赤瓟提取
物对 HeLa 细胞凋亡促进作用可能与其调节 Bcl-2 和
Bax表达有关。
在细胞凋亡信号传导通路中最重要的酶是
Caspases，在许多凋亡过程中，Caspases 是凋亡信号转
导网络的核心［7］。现已公认，只要细胞的死亡是依赖
Caspase的激活，那么这种细胞死亡就一定是凋亡［8］。
Bcl-2 家族在细胞凋亡的线粒体信号通路上游过程发
挥作用，而 Caspase 蛋白激酶家族则在下游发挥作用，
在这一过程中有多种促凋亡和抗凋亡的蛋白相互作
用，两者失调导致细胞凋亡;同时 Bcl-2 基因亦可直接
或间接抑制线粒体膜渗透性转移孔道复合物的开放，
其表达降低可使线粒体膜电位下降，进而导致膜质子
转运异常，通透性增加，引起细胞色素 C 从线粒体中
释放到胞浆中，与凋亡蛋白酶活化因子-1、Caspase-9
前体形成凋亡小体，激活 Caspase-9;Caspase-9 再酶解
Caspase-3 前体，释放出 C 末端小肽片段，从而活化
Caspase-3，活化的 Caspase-3 再瀑布式激活 Caspase-2，
6，8，10 等。这些激活的 Caspases 最终激活脱氧核糖
核酸酶，水解核酸和细胞骨架蛋白，导致细胞凋
亡［9 ～ 10］。因此激活 Caspase-9 及 Caspase-3 是细胞凋
亡的必经之路。本研究中，我们发现南赤瓟提取物可
显著降低 HeLa 细胞线粒体膜电位，并且随着剂量的
增加而增强;在 Caspase 活性分析中，南赤瓟提取物可
使 HeLa 细胞中 Caspase-9 和 Caspase-3 的活性显著升
高。实验结果提示南赤瓟提取物对 HeLa 细胞凋亡的
促进作用不但与其调节 Bcl-2 家族的 Bcl-2 和 Bax 表
达水平有关，而且与其激活下游的 Caspase 蛋白激酶
家族的 Caspase-9 及 Caspase-3 表达有关。
综上所述，本研究证实南赤瓟提取物有显著的诱
导 HeLa细胞凋亡作用，其机制可能是通过降低 HeLa
细胞线粒体膜电位，上调 Bax mRNA 表达，下调 Bcl-2
mRNA表达和 Bcl-2 与 Bax 的比值以及增强 Caspase-9
和 Caspase-3 的活性，从而抑制 HeLa 细胞生长、诱导
肿瘤细胞凋亡。
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(收稿:2012-03-17;修回:2012-04-16)
(编辑 张 维)
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