全 文 ：书麦类作物学报　２０１３，３３（２）：２０９－２１６
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ　Ｃｒｏｐｓ
网络出版时间：２０１３－３－５
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３５９．Ｓ．２０１３０３０５．１１４５．０１１．ｈｔｍｌ
百萨偃麦草ＴｈｂＧＳＫ和ＴｈｂＨＫＴ１基因的同源克隆与表达分析
＊?
郭 杰，庄丽芳，亓增军
（南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，江苏南京２１００９５）
摘　要：百萨偃麦草（Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍ　ｂｅｓｓａｒａｂｉｃｕｍ Ｌｖｅ，２ｎ＝２ｘ＝１４，ＪＪ）是小麦改良的重要亲缘物种。
为了解ＧＳＫ和ＨＫＴ１ 基因在百萨偃麦草耐盐胁迫中的作用，本研究采用同源克隆的方法从百萨偃麦草中扩
增获得了糖原合成酶激酶基因ＴｈｂＧＳＫ及高亲和性钾离子转运蛋白基因ＴｈｂＨＫＴ１ 的全长ｃＤＮＡ，ＴｈｂＧＳＫ
基因全长１　２３３ｂｐ，与水稻、短柄草、小麦等物种的氨基酸一致性为９３．９２％～９９．０２％，表明ＧＳＫ基因在这些
物种间具有较高的保守性；聚类分析表明，ＴｈｂＧＳＫ 与小麦ＴａＧＳＫ 关系最近。ＴｈｂＨＫＴ１ 基因全长１　６０２
ｂｐ，与水稻、小麦、短柄草、大麦等物种的氨基酸一致性为６６．１７％～９２．８７％，说明ＨＫＴ１ 基因在这些物种间
变异较大；聚类分析表明，ＴｈｂＨＫＴ１ 与大麦ＨｖＨＫＴ１ 关系最近。ＲＴ－ＰＣＲ和荧光定量ＰＣＲ分析表明，经
２５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ胁迫处理后，ＧＳＫ 基因在百萨偃麦草和中国春诱导０～２４ｈ的叶片中表现为组成型表
达，而ＨＫＴ１ 基因在百萨偃麦草和中国春中均表现为诱导后上调表达。
关键词：百萨偃麦草；ＧＳＫ基因；ＨＫＴ１ 基因；同源克隆；基因表达
中图分类号：Ｓ５１２．９；Ｓ３３０　　　　文献标识码：Ａ　　　　文章编号：１００９－１０４１（２０１３）０２－０２０９－０８
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｌｙｃｏｇｅｎ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ　Ｋｉｎａｓｅ
ｇｅｎｅ　ＴｈｂＧＳＫａｎｄ　Ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｋ＋Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ
ｇｅｎｅ　ＴｈｂＨＫＴ１　ｏｆ　Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍ　ｂｅｓｓａｒａｂｉｃｕｍ
ＧＵＯ　Ｊｉｅ，ＺＨＵＡＮＧ　Ｌｉ－ｆａｎｇ，ＱＩ　Ｚｅｎｇ－ｊｕｎ
（Ｎａｎｊｉｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｃｒｏｐ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，Ｎａｎｊｉｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ　２１００９５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍ　ｂｅｓｓａｒａｂｉｃｕｍ Ｌｖｅ（２ｎ＝２ｘ＝１４，ＪＪ）ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅ－
ｓｏｕｒｃｅ　ｆｏｒ　ｗｈｅａｔ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ．Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ，ｔｗｏ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　ｇｌｙｃｏｇｅｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ
ｋｉｎａｓｅ（ＧＳＫ）ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ　ＴｈｂＧＳＫａｎｄ　ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｋ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ（ＨＫＴ）ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ　ＴｈｂＨＫＴ１
ｗｅｒｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ｆｒｏｍＴｈ．ｂｅｓｓａｒａｂｉｃｕｍｌｅａｆ　ｃＤＮＡ．Ｉｎ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｒｉｃｅ，Ｂｒａｃｈｙｐｏｎｄｉｕｍ　ｄｉｓ－
ｔａｃｈｙｏｎ　ａｎｄ　ｗｈｅａｔ，ｔｈｅ　ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｖａｒｉｅｄ　ｆｒｏｍ　９３．９２％～９２．０２％，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ
ｈｉｇｈ　ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｔｈｅｓｅ　ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｃｌｕｓｔｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｃｌｏｓｅｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ
ＴｈｂＧＳＫａｎｄ　ＴａＧＳＫ１ ．Ｉｎ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｒｉｃｅ，ｗｈｅａｔ，Ｂｒａｃｈｙｐｏｎｄｉｕｍ　ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ　ａｎｄ　ｂａｒ－
ｌｅｙ，ｔｈｅ　ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ＴｈｂＨＫＴ１　ｖａｒｉｅｄ　ｆｒｏｍ　６６．１７％～９２．８７％，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｖａｒｉａ－
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｔｈｅｓｅ　ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｃｌｕｓｔｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｃｌｏｓｅｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＴｈｂＧＳＫａｎｄ
ＨｖＧＳＫ１ ．Ｓｔｒｅｓｓｅｄ　ｗｉｔｈ　２５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ　ｆｏｒ　０～２４ｈ，ＧＳＫｓｈｏｗｅｄ　ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔ－
ｔｅｒｎｓ　ｂｏｔｈ　ｉｎ　Ｔｈ．ｂｅｓｓａｒａｂｉｃｕｍａｎｄ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｗｈｉｌｅ　ＨＫＴ１ｓｈｏｗｅｄ　ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｓｅｍｉ－ｑｕａｎ－
ｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍ　ｂｅｓｓａｒａｂｉｃｕｍ；ＧＳＫｇｅｎｅ；ＨＫＴ１　ｇｅｎｅ；Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
＊　收稿日期：２０１２－０９－２４　　　修回日期：２０１２－１２－１０
基金项目：国家自然科学基金项目（３１１７０３０２）。
作者简介：郭 杰（１９８８－），男，硕士，主要从事为小麦分子细胞遗传与育种研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｎｘｇｊ１１１５３２６＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者：亓增军（１９６８－），男，博士，教授，主要从事小麦分子细胞遗传与育种研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｊｑｉ＠ｎｊａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
　　土壤盐碱化是影响作物生产的重要因素［１－４］。
发掘和利用植物中的耐盐基因，培育耐盐植物品
种，是提高盐碱地利用效率的途径之一。
蛋白激酶广泛参与植物对干旱、盐胁迫、
ＡＢＡ诱导和光诱导等应答反应［５］。其中，糖原合
成酶激酶（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｋｉｎａｓｅ，简称ＧＳＫ）
是一种高度保守的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，可能
参与植物的渗透胁迫应答等系列生命活动进
程［６］。Ｐａｙ等［７］在紫花苜蓿中发现了第一个植物
ＧＳＫ 家族成员，此后，在模式植物拟南芥中陆续
发现了１０个ＧＳＫ基因［８－９］。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交显示，
ＡｔＧＳＫ１ 在拟南芥不同组织中表达不同，其中在
花中表达量较高。研究还发现，在幼苗期，ＡｔＧ－
ＳＫ１ 受 ＮａＣｌ诱导表达，且与拟南芥耐盐能力正
相关［１０］。在水稻中鉴定出９个ＧＳＫ 基因，分布
在６条染色体上。实时定量ＰＣＲ分析表明，大多
数ＯｓＧＳＫ 基因在水稻全生育期都有较高的表达
量并且受盐诱导表达，说明该基因在水稻发育和
逆境适应过程中起作用［１１］。在小麦中，ＧＳＫ 基
因首先从耐盐突变体 ＲＨ８７０６－４９中分离到［１２］。
小麦ＧＳＫ 基因目前发现有３个拷贝，分别定位于
染色体 １Ａ、１Ｂ 和 １Ｄ 短臂［１３］。研究表明，转
ＴａＧＳＫ１ 的小麦植株可以提高植物的抗渗透、抗
胁迫能力，且对根的分化具有明显促进作用［１４］。
高亲和性钾离子转运蛋白基因（Ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉ－
ｔｙ　Ｋ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ，简称 ＨＫＴ）控制 Ｋ＋的吸收
和Ｋ＋／Ｎａ＋的选择性运输［１５］，在改善植物耐盐性
方面发挥作用［１６］。无论在物种内还是物种间，大
多数转运蛋白基因都有很多类型，在禾谷类植物
中，ＨＫＴ基因家族尤其明显。ＴａＨＫＴ１ 率先在
小麦中得到了克隆［３］。小麦ＴａＨＫＴ１ 可以催化
高亲和的Ｋ＋／Ｎａ＋同向转运，而当Ｎａ＋浓度升高
时又可催化低亲和的 Ｎａ＋单向转运［１７］。ＨＫＴ１
基因定位在小麦的第七部分同源群［１８］，其中染色
体７Ａ、７Ｂ分别有两个拷贝，７Ｄ有一个拷贝［１９］。
ＨＫＴ基因在小麦耐盐方面具有重要功能［２０］，转
基因研究已经获得了一些小麦ＴａＨＫＴ１ 基因耐
盐性的结果［１８］。在拟南芥中也发现１个 ＨＫＴ
基因［２１］。ＡｔＨＫＴ１ 在维管系统中表达并通过移
除木质部中的Ｎａ＋从而提高植物的耐盐性［２２－２３］，
ＡｔＨＫＴ１ 缺失突变体明显增加了植株对盐害的
敏感程度［２４］。大麦中克隆的ＨｖＨＫＴ１ ［２５］，主要
通过转运根部的 Ｎａ＋发挥作用［２６］。最新报道的
一粒小麦中的ＴｍＨＫＴ１；５－Ａ 基因，表现出很好
的耐盐性并具有明显提高盐碱地小麦产量的效
应［２７］。
百 萨 偃 麦 草 （Ｔｈｉｎｏｐｙｒｕｍ　ｂｅｓｓａｒａｂｉｃｕｍ
Ｌｖｅ，２ｎ＝２ｘ＝１４，ＪＪ）具有很强的耐盐性，是小
麦改良的重要基因资源［２８－２９］。Ｇｏｒｈａｍ等［２８－２９］研
究表明，百萨偃麦草在３５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１的 ＮａＣｌ
中能够生长，在１５０ｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ中百萨偃麦
草叶片中Ｎａ＋浓度比中国春低４０％，同时中 Ｋ＋
含量升高，有很强的排Ｎａ＋能力［２８］。通过普通小
麦中国春与百萨偃麦草杂交获得的双倍体比中国
春的耐盐性明显提高，中国春在 ＮａＣｌ浓度高于
１７５ｍｍｏｌ·Ｌ－１时不能生存，而双倍体在ＮａＣｌ浓
度达到２５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１仍能生长。为转移和利用
百萨偃麦草的耐盐性等基因，南京农业大学从
ＣＩＭＭＹＴ引进中国春－百萨偃麦草双倍体，并进
行了多年鉴定［３０－３１］，结果表明，在２５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１
ＮａＣｌ胁迫条件下，与中国春相比，双倍体的盐害
指数降低，Ｋ＋／Ｎａ＋增加，耐盐性明显改善。为了
解ＧＳＫ 基因和ＨＫＴ１ 基因在百萨偃麦草耐盐胁
迫中的作用，本研究采用同源克隆的方法从百萨
偃麦草中克隆获得了ＴｈｂＧＳＫ 和ＴｈｂＨＫＴ１ 全
长基因，并通过半定量和定量ＰＣＲ对盐胁迫下两
个基因在普通小麦中国春和百萨偃麦草中的表达
特点进行了分析。
１　材料与方法
１．１　材 料
供试材料中国春－百萨偃麦草双倍体（Ｃ．Ｓ－
Ｔｈ．ｂｅｓｓａｒａｂｉｃｕｍａｍｐｈｉｐｌｏｉｄ）由国际玉米小麦
改良中心（ＣＩＭＭＹＴ）Ｍｕｊｅｅｂ－Ｋａｚｉ博士惠赠，百
萨偃麦草由四川农业大学小麦研究所提供，中国
春由本实验室保存。
ｐＭＤ１８－Ｔ载体购于ＴａＫａＲａ生物公司。
１．２　方 法
为了解ＧＳＫ 基因和ＨＫＴ１ 基因在百萨偃麦
草、中国春中的表达特点，将供试材料分别在２５０
ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ溶液胁迫处理后，分别提取胁
迫处理０、３、６、１２、２４ｈ的叶片总ＲＮＡ，总ＲＮＡ
的抽提采用上海Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ生物公司的Ｔｒｉｚｏｌ试
剂。基因组ＤＮＡ提取参照采用酚／氯仿法提取
总 ＤＮＡ［３２］。总 ＲＮＡ 用 ＡＭＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎ－
ｓｃｒｉｐｔａｓｅ　ＸＬ（ＴａＫａＲａ公司）反转录成ｃＤＮＡ第
·０１２· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３３卷
一链。
引物设计采用Ｐｒｉｍｅｒ　３．０软件（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．
ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．Ｅｄｕ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｃｇｉ）进
行在线设计，引物由上海Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ生物公司合
成。根据水稻、拟南芥及小麦ＧＳＫ 同源基因的
比较结果，在小麦ＴａＧＳＫ１ 基因ｃＤＮＡ序列的５′－
ＯＲＦ（开放读码框）区域和３′－ＵＴＲ（非翻译区）区
域设计扩增基因全长的引物，ＧＳＫ－Ｆ：５′－ＡＴＧ－
ＧＣＣＴＣＧＧＴＴＧＧＴＧＣＧＧＴＧＣ－３′，ＧＳＫ－Ｒ：５′－
ＣＧＣＣＣＧＧＧＧＧＧＧＧＣＣＴＣＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＣ－３′。
ＰＣＲ扩增程序为９４℃ ３ｍｉｎ，预变性后，９４℃
３０ｓ，５５℃４５ｓ，７２℃１．５ｍｉｎ，３３个循环，最后
７２℃延伸１０ｍｉｎ。根据水稻、小麦及大麦ＨＫＴ１
同源基因的比较结果，在大麦ＨｖＨＫＴ１ 基因ｃＤ－
ＮＡ序列的５′－ＵＴＲ区域和３′－ＵＴＲ区域设计扩
增基因全长的引物，ＨＫＴ１ －Ｆ：５′－ＴＣＧＣＡＣＴ－
ＣＡＴＡＴＡＴＡＧＣＡＣＣ－３′，ＨＫＴ１ －Ｒ：５′－ＡＡＧＣ－
ＧＣＡＡＣＡＴＣＣＡＣＡＡＡＣＴ－３′。ＰＣＲ扩增程序为
９４℃３ｍｉｎ，预变性后，９４℃３０ｓ，５０℃４５ｓ，７２℃
２ｍｉｎ，３３个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。
ＤＮＡ片段的回收采用杭州爱思进生物技术
公司生产的回收试剂盒，ＰＣＲ回收产物的连接所
需Ｔ４ 连接酶购于 ＴａＫａＲａ公司，大肠杆菌感受
态细胞ＤＨ５α的制备参照《分子克隆实验指南》
（第三版）中的方法，测序由华大基因科技股份有
限公司完成。
以调整浓度后的各诱导时期的ｃＤＮＡ第一
链为模板，以所选基因的特异引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，
分析基因的表达情况，ＰＣＲ 扩增程序为９４℃
３ｍｉｎ，预变性后９４℃３０ｓ，５５℃５０ｓ，７２℃５０ｓ，
３３个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ，１０℃保存。Ｑ－ＰＣＲ
反应体系及扩增程序参照ＴＡＫＡＲＡ公司试剂说
明书。
利用美国国立生物信息中心 ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）开放阅读框预测ＯＲＦ
Ｆｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／
ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌ），利用ＤＮＡＭＡＮ软件（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．
ｌｙｎｎｏｎ．ｃｏｍ／）进行生物信息学分析、序列比较及
进化关系分析。
２　结果与分析
２．１　百萨偃麦草ＴｈｂＧＳＫ 和ＴｈｂＨＫＴ１ 基因的
同源克隆
用百萨偃麦草叶片的总ＲＮＡ（Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ）
样品反转录成ｃＤＮＡ后作为模板进行全长基因
的扩增（图１）。
图１　ＧＳＫ（Ａ）和ＨＫＴ１ （Ｂ）全长基因在百萨偃麦草叶片ｃＤＮＡ中的扩增（箭头示目标片段）
Ｆｉｇ．１　Ｆｕｌ　ｌｅｎｇｔｈ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ＧＳＫ（Ａ）ａｎｄ　ＨＫＴ１ （Ｂ）ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃＤＮＡ　ｏｆ
Ｔｈ．ｂｅｓｓａｒａｂｉｃｕｍ（Ｔｈｅ　ａｒｒｏｗ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｔａｒｇｅｔ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）
　　利用ＧＳＫ 全长基因引物从百萨偃麦草中扩
增出一条１　２００ｂｐ左右的片段。将这个目标片
段回收并克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ载体中，转化 ＤＨ５α
感受态细胞，挑选含有目的片段的单克隆进行测
序。将克隆得到的全长序列进行比对分析，结果
显示，该序列是一个全长基因，ＯＲＦ全长１　２３３
ｂｐ，编码４１０个氨基酸，编号为ＴｈｂＧＳＫ。
利用ＨＫＴ１ 全长基因引物从百萨偃麦草中
扩增出一条２　０００ｂｐ左右的片段，回收并克隆该
序列，测序分析显示：该序列是一个全长基因，
ＯＲＦ全长１　６０２ｂｐ，编码５３３个氨基酸，编号为
ＴｈｂＨＫＴ１ 。
２．２　ＴｈｂＧＳＫ 和ＴｈｂＨＫＴ１ 基因及与其他物种
的比对分析
百萨偃麦草ＴｈｂＧＳＫ 基因与小麦、一粒小
麦、水稻、短柄草等物种的ＧＳＫ 基因碱基序列
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）比对分析表
明，ＴｈｂＧＳＫ 与普通小麦Ｂ基因组基因的一致性
·１１２·第２期　　　　　　　　　郭 杰等：百萨偃麦草ＴｈｂＧＳＫ和ＴｈｂＨＫＴ１ 基因的同源克隆与表达分析
最高，相似性为９８．３０％；与Ａ基因组基因的一致
性为 ９７．４９％，与 Ｄ 基因组基因的一致性为
９６．９２％，与一粒小麦的一致性为９６．８４％，与短
柄草的一致性为９３．０４％，与水稻的一致性为最
低，相似性为８８．９２％。蛋白序列（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．
ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）比对分析（图２）表明，百萨偃
麦草与小麦 Ａ 族的一致性最高，相似性为
９９．０２％，与Ｂ族的一致性为９８．２９％，Ｄ族的一
致性为９８．５４％，与一粒小麦的一致性为９８．５４％，
与短柄草的一致性为９６．５９％，与水稻的一致性
最低，相似性为９３．９２％，说明ＧＳＫ 基因在这些
物种间具有较高的保守性。
图２　ＴｈｂＧＳＫ与普通小麦、一粒小麦、水稻和短柄草同源基因的氨基酸序列比较
Ｆｉｇ．２　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＴｈｂＧＳＫａｎｄ　ｉｔｓ　ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ，
Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ，Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　ａｎｄ　Ｂｒａｃｈｙｐｏｎｄｉｕｍ　ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ
　　百萨偃麦草ＴｈｂＨＫＴ１ 基因与短柄草、大
麦、小麦、水稻等物种的ＨＫＴ１ 基因的碱基序列
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）比对分析表
明，ＴｈｂＨＫＴ１ 与大麦基因组基因的一致，性最
高，相 似 性 为 ９５．２６％；与 小 麦 的 一 致 性 为
９３．５７％，短柄草的一致性为８３．１８％，与水稻的
一致性为最低，相似性为７５．５０％。蛋白序列（ｈｔ－
ｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）比对分析（图３）
发现，ＴｈｂＨＫＴ１ 与大麦的一致性最高，相似性
为９２．８７％；与小麦的一致性为９１．３７％，与短柄
草的一致性为７９．１０％，与水稻的一致性最低，相
似性为６６．１７％，说明ＨＫＴ１ 基因在这些物种间
存在较大的变异。
用ＤＮＡＭＡＮ软件对四个物种的ＧＳＫ 进行
聚类分析（图４Ａ）发现，百萨偃麦草和小麦Ｂ族
ＧＳＫ 基因关系最近。对ＨＫＴ１ 进行聚类分析
（图４Ｂ）发现，百萨偃麦草和大麦落在一个独立的
分支上，因此二者关系较近。
２．３　百萨偃麦草ＴｈｂＧＳＫ 基因和ＴｈｂＨＫＴ１ 基
因的半定量和定量表达分析
为了解ＧＳＫ 基因和ＨＫＴ１ 基因在百萨偃麦
草和中国春中的表达特点，将供试材料分别在
２５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ溶液胁迫处理，分别提取胁
迫处理０、３、６、１２、２４ｈ的叶片总 ＲＮＡ，将总
ＲＮＡ反转录后得到ｃＤＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ和荧光
定量ＰＣＲ分析，以非诱导的材料作为阴性对照，
以Ｔｕｂｌｉｎ基因作为内参。ＲＴ－ＰＣＲ分析表明，
ＧＳＫ基因在中国春和百萨偃麦草诱导前导后表
·２１２· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３３卷
图３　ＴｈｂＨＫＴ１ 与普通小麦、大麦、水稻和短柄草同源基因的氨基酸序列比较
Ｆｉｇ．３　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＴｈｂＨＫＴ１　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ
Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ，Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ，Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　ａｎｄ　Ｂｒａｃｈｙｐｏｎｄｉｕｍ　ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ
图４　ＧＳＫ基因（Ａ）和ＨＫＴ１ 基因（Ｂ）在不同物种的系统进化关系分析
Ｆｉｇ．４　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＧＳＫ（Ａ）ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ＨＫＴ１ （Ｂ）ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ
图５　ＧＳＫ基因在２５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ诱导后的表达分析（Ａ为半定量分析，Ｂ为荧光定量分析）
Ｆｉｇ．５　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＧＳＫｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｓｐｒｉｎｇ　ａｎｄ　Ｔｈ．ｂｅｓｓａｒａｂｉｃｕｍｉｎｄｕｃｅｄ
ｂｙ　２５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ（Ａ：ＲＴ－ＰＣＲ；Ｂ：ｑＰＣＲ）
·３１２·第２期　　　　　　　　　郭 杰等：百萨偃麦草ＴｈｂＧＳＫ和ＴｈｂＨＫＴ１ 基因的同源克隆与表达分析
达水平没有明显变化（图５Ａ）；以Ａｃｔｉｎ基因作为
内参，进一步通过荧光定量ＰＣＲ分析发现，ＧＳＫ
基因在中国春叶片中０～１２ｈ表达量差异不显
著，在百萨偃麦草叶片中表达量差异也不显著（图
５Ｂ），说明该基因在中国春和百萨偃麦草叶片中
均为组成型表达。
　　ＲＴ－ＰＣＲ分析表明，ＨＫＴ１ 基因在中国春和
百萨偃麦草中均有明显的上调表达（图６Ａ），在中
国春中，诱导前仅有较弱的表达，３ｈ后表达量最
高，６ｈ后表达量降低，而１２ｈ后仅有微弱的表
达；在百萨偃麦草中，诱导０、３、６ｈ仅有微弱表
达，但在１２ｈ后表达量明显上升，２４ｈ后又表现
下降。荧光定量ＰＣＲ分析发现二个材料有相似
的表达特点，其中在中国春中诱导３ｈ、６ｈ后表
达量明显上升，随后明显降低；在百萨偃麦草中诱
导１．５ｈ表达量开始上升，１２ｈ表达量最高，随后
下降（图６Ｂ）。综合以上两个分析结果表明，
ＨＫＴ１ 基因在中国春和百萨偃麦草叶片均受盐
胁迫诱导上调表达。
图６　ＨＫＴ１ 基因在２５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ诱导后的表达分析（Ａ为半定量分析，Ｂ为荧光定量分析）
Ｆｉｇ．６　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ＨＫＴ１ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　２５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ（Ａ：ＲＴ－ＰＣＲ；Ｂ：ｑＰＣＲ）
３　讨 论
百萨偃麦草具有很强的耐盐性，但对其耐盐
基因研究较少。本研究根据禾谷类作物中已经克
隆的耐盐相关基因ＧＳＫ 和ＨＫＴ１ 设计扩增基因
全长的特异引物，采用同源克隆的方法从百萨偃
麦草叶片中获得了同源基因ＴｈｂＧＳＫ 和ＴｈｂＨ－
ＫＴ１ 。在小麦中，ＧＳＫ１ 基因分别定位在染色体
１Ａ、１Ｂ、１Ｄ［１３］，各有１个拷贝；在拟南芥中，ＧＳＫ
基因有１０个拷贝［８］，在水稻中具有９个拷贝［１１］。
本研究利用一套小麦－百萨偃麦草异染色体系对
ＴｈｂＧＳＫ 基因进行了定位分析，但由于扩增产物
无多态性，因此未能获得染色体定位结果。笔者
等根据ＴｈｂＧＳＫ 基因与小麦基因间存在ＳＮＰ的
区域设计了１０对不同的引物，但是无论ＰＣＲ扩
增产物，还是扩增产物酶切后的电泳结果，亦均没
有产生多态性，说明ＴｈｂＧＳＫ 与ＴａＧＳＫ 基因具
有较高的保守性，并可能还具有更多的同源基因，
因此很难利用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法进行区
分。在水稻中，盐诱导后，ＧＳＫ 基因家族不同成
员在植物不同部位的表达情况不尽相同，其中
ＯｓＧＳＫ１ 基因在叶片中属于组成型表达，但在根
部却属于诱导表达［１１］。在小麦中，用１％ＮａＣ１
胁迫后，ＴａＧＳＫ１ 在根部的表达量比胁迫前提高
６倍，说明该基因在根部为诱导表达且与小麦耐
盐性相关［１９］。本研究表明，盐胁迫诱导后，ＧＳＫ
基因在中国春和百萨偃麦草叶片组织中均为组成
型表达，与水稻ＯｓＧＳＫ１ 基因在叶片中的表达模
式相似［１１］，但在中国春－百萨偃麦草双倍体中，
ＧＳＫ 基因在盐诱导３ｈ后表达量明显最高，与未
经诱导的对照相比增加了约１９倍，然后下降，明
显不同于中国春和百萨偃麦草的表达模式。前人
研究表明，人工合成物种的多倍体化过程中常常
发生基因和重复序列的修饰和变化，从而导致某
·４１２· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３３卷
些基因的沉默或激活。本研究所利用的双倍体
中，ＧＳＫ 基因是否发生了类似变化值得进一步分
析。由于本文设计的ＰＣＲ引物源自ＧＳＫ 基因的
保守区段，因此无法区分在双倍体中扩增出的目
的片段属于哪个物种以及是否是相同的基因成
员。但ＧＳＫ 基因在双倍体中的差异表达提示我
们，ＧＳＫ 家族的某些成员可能与双倍体的耐盐性
相关，这与过量表达ＴａＧＳＫ１ 能够提高小麦的抗
胁迫能力相吻合［１４］。本研究启示我们需要进一
步克隆更多的ＧＳＫ 基因成员，并通过表达分析
揭示不同成员的功能。
小麦ＨＫＴ１ 基因定位于第七部分同源群染
色体［１８］，其中７Ａ、７Ｂ各有两个拷贝，７Ｄ有一个
拷贝［１９］。在水稻中 ＨＫＴ 基因家族中有８个基
因，根据功能不同，可以分为两类［３３－３４］。水稻中发
现的编码 ＨＫＴ型转运蛋白的ＱＴＬ位点ＳＫＣ１，
具有选择性转运Ｎａ＋的功能，有助于维持高盐条
件下植株中Ｋ＋的含量［３５］。特别是从一粒小麦中
发现的ＴｍＨＫＴ１；５－Ａ 基因，在盐碱地中能使小
麦产量提高约２５％［２７］，充分说明了这类基因在植
物耐盐中的作用。本研究利用一套小麦－百萨偃
麦草异染色体系将ＴｈｂＨＫＴ１ 基因定位在百萨
偃麦草染色体７Ｊ，但对于其拷贝数尚不清楚。
ＲＴ－ＰＣＲ分析表明，在盐生植物盐地碱蓬中，
ＳｓＨＫＴ１ 在叶中的表达量明显高于根部，且在
Ｋ＋饥饿及盐胁迫时，ＳｓＨＫＴ１ 表达量明显上
调［３６］。本研究表明，ＨＫＴ１ 在中国春、百萨偃麦
草和双倍体叶片中均表现为诱导后上调表达，与
上述研究相似，在中国春和双倍体中，诱导３ｈ后
表达量达到峰值，但在百萨偃麦草中诱导１２ｈ后
才达到峰值。由于定量分析时使用的引物同样源
于ＨＫＴ１ 基因的保守区，因此同样无法区分双倍
体中基因的来源，但百萨偃麦草中该基因的上调
表达时间明显慢于中国春和双倍体，说明百萨偃
麦草中可能还有其他基因的快速响应来抵御盐胁
迫。笔者前期的研究也发现，虽然包含ＴｈｂＨ－
ＫＴ１ 的中国春－百萨偃麦草二体附加系ＤＡ７Ｊ具
有一定的耐盐性［３０］，但同时在其他染色体上也发
现耐盐基因，例如５Ｊ染色体可能具有更强的耐盐
基因［３１］。因此，下一步研究应在明确本文已经克
隆基因的功能前提下继续发掘ＨＫＴ基因家族的
其他成员以及其他耐盐基因，并结合染色体工程
将百萨偃麦草的耐盐基因转移进栽培小麦，培育
小麦新种质。
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·６１２· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３３卷