全 文 ：山西农业科学 2011，39（6）：505- 507，511 Journal of Shanxi Agricultural Sciences
简单重复序列（AAG）5在百萨偃麦草染色体上的分布
温辉芹，裴自友，任永康
（山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原 030032）
摘 要：百萨偃麦草是小麦亲缘物种之一，对环境胁迫和生物胁迫具有很强的抗性，是小麦遗传改良的重要
资源。为了对导入的外源染色体及片段进行有效鉴定，利用荧光原位杂交方法，研究了合成的简单重复序列
（AAG）5在百萨偃麦草染色体上的分布情况。结果表明，（AAG）5在百萨偃麦草上有多个位点，利用（AAG）5
作探针可以将百萨偃麦草的各条染色体区分开来。
关键词：简单重复序列；百萨偃麦草；荧光原位杂交（FISH）
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1002- 2481（2011）06- 0505- 03
Distribution of（AAG）5 Sequence on Chromosomes of Thinopyrum bessarabicum
WENHui- qin，PEI Zi- you，RENYong- kang
（Institute of Crop Sciences，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030032，China）
Abstract：Thinopyrum bessarabicum L觟ve is one of wheat relatives with high tolerance to both biotic and abiotic stresses.
FISH techniques were used for locating the synthetic oligonucleotide（AAG）5 sequence to specific chromosomes of Thinopyrum
bessarabicum chromosomes. The results showed that there were many distinctive signals distribution sites of simple sequence re-
peats （AAG）5 on the chromosomes, and using （AAG）5 as probe, each chromosome of Thinopyrum bessarabicum could be well
distinguished.
Key words：simple sequence repeats（SSRs）; Thinopyrum bessarabicum L觟ve; fluorescence in situ hybridization（FISH）
收稿日期：2011- 02- 18
基金项目：山西省自然科学基金项目（2009011038- 1）
作者简介：温辉芹（1966-），女，山西祁县人，研究员，硕士，主要从事小麦遗传育种研究工作。裴自友为通讯作者。
doi:10.3969/j.issn.1002-2481.2011.06.05
百萨偃麦草（Thinopyrum bessarabicum，2n=
2x=14，JJ）为自花授粉的多年生海岸禾草，原产
于黑海和地中海沿岸，是偃麦草属中基因组最简
单的二倍体物种。J染色体是偃麦草属的基本染
色体组，在小麦亲缘物种中，J染色体组仅次于
S，广泛分布于多倍体物种中。百萨偃麦草对环境
胁迫和生物胁迫具有很强的抗性，是小麦遗传改
良的重要资源[1]。
分子原位杂交（In Situ Hybridization，ISH）是
在分子水平上检测外源染色质的一种有效方法，
根据所用探针不同分为物种专化重复序列原位
杂交、基因组原位杂交和单拷贝或寡拷贝序列原
位杂交等。高等植物的基因组内含有大量的重复
DNA序列，根据其拷贝数将重复序列划分为卫星
DNA（高度串联重复序列）、小卫星和微卫星DNA
（中度串联重复序列）、转座子（中度弥散、具转座
功能）[2]。利用重复序列 ISH分子核型的建立对染
色体的识别非常有效。Mukai等[3]根据 pSc119.2
和 pAs1这 2个重复序列的双色原位杂交，建立
了普通小麦的分子核型，可以识别全部 21条染
色体中的 17条。简单重复序列（Simple Sequence
Repeat，SSR） 又称微卫星 DNA（microsatellites
DNA），它是一类由 1～6个碱基组成的基序串联
重复而成的 DNA序列，其长度一般较短，广泛分
布于基因组的不同位置。研究表明，一个基因的
不同位点的 SSR在调节基因的表达和决定产物
上起着重要作用。SSR标记技术已被广泛用于遗
传图谱的构建、品种指纹图谱的绘制以及目标性
状基因标记筛选、起源进化等领域 [4]。Pedersen
等[5- 6]发现，来自大麦的 pHvG38克隆（GAA- 卫星
序列）可以在大麦、小麦、黑麦以及其他小麦族物
种染色体上产生与 N- 带完全一致的核型图谱，
利用 pHvG38和克隆 pAs1的双色原位杂交建立
了可以区分普通小麦全部 21条染色体的分子核
型。目前，利用标记的简单重复序列进行的原位
杂交开展了对甜菜、鹰嘴豆、六倍体普通小麦、大
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山西农业科学 2011年第 39卷第 6期
麦、黑麦、小黑麦、果蝇和人类染色体上微卫星物
理位点的研究[5，7- 13]。
本研究以简单重复序列（AAG）5为探针，进
行荧光原位杂交，检测其在百萨偃麦草上的位
置，建立百萨偃麦草的（AAG）5荧光核型。
1 材料和方法
1.1 材料
百萨偃麦草由山西省农业科学院作物科学
研究所保存。简单重复序列（AAG）5由日本葛莱
娜有限公司合成、日本鸟取大学农学部植物遗传
育种实验室提供。
1.2 方法
1.2.1 根尖细胞染色体制片 百萨偃麦草种子
发芽前先浸种处理 24 h，然后将种子放在垫有湿
滤纸的培养皿内于 4℃冰箱中处理 1周左右，再
放到 23℃培养箱中发芽，待根长约 1～2 cm时
剪取根尖，在冰水中预处理 22～24 h后，用酒
精 - 冰醋酸（3∶1）固定液固定。用 45%醋酸洋
红制片，- 70℃冰箱冰冻揭片。
1.2.2 探针标记 采用 3′末端标记方法（3′
End labeling method），用 tetramethyl- rhodamine-
5- dUTP标记合成的简单重复序列（AAG）5。反应
液配制：将 1.5 mL离心管置于冰上，依次加入5×
TdT Reaction buffer 4μL，终浓度为 100 pmol/L
的 （AAG）5，CoCl2 （25 mmol/L）4 μL，tetram-
ethyl- rhodamine- 5- dUTP（25 nmol/μL，Roche）
1 μL，Terminal Transferase rec 1 μL，最后加
ddH2O至总体积为 20μL，混合、离心后，37℃温
育 15min，再将离心管置于冰上，加入 Stop buffer
（0.2 mol/L EDTA，pH值为 8.0）2 L，混匀，放入
- 20℃冰箱备用。
1.2.3 荧光原位杂交（FISH）及信号检测 荧光
原位杂交主要参照 Kishii等[14]的程序，具体如下。
（1）制片变性：根尖制片放置于 0.2 mol/L
NaOH/70% Ethanol，室温条件下 5 min，变性后的
制片在 - 20℃的 70%，90%，100%乙醇溶液中各
5 min梯度脱水，杂交前气干备用。
（2）杂交液配制及变性：每 10μL杂交液含
去离子甲酰胺（Formamide）5 μL，50% Dextran
sulfate 2μL，20×SSC1μL，探针（AAG）5 0.5μL，
ddH2O 1.5μL。轻轻混匀，100℃下变性 5 min，
然后立即放置于碎冰中冷却 5 min以上。
（3）杂交：每张制片加 10 μL探针混合液，
用 18 mm×18 mm的盖玻片盖好（胶水封住四
周），放置于有湿润滤纸的塑料盒内，37℃杂交
过夜。
（4）洗片：取出充分杂交的制片，用镊子小心
去掉胶水和盖玻片，在 0.1% TritonX- 100/2×SSC
室温下洗脱 5 min，2×SSC室温浸洗 5 min，用洗
耳球吹干。
（5）染色及镜检：制片加 10μL用 VECTA
shield（Vector）胶配置的 DAPI套染和封片，盖上
盖片（20 mm×20 mm），用 Olympus BX61荧光显
微镜观察、照相。各染色体根据臂比和荧光带型
用 Adobe PhotoShop 6.0软件编辑排列。
2 结果与分析
以简单重复序列（AAG）5为探针，对百萨偃
麦草的荧光原位杂交结果如图 1所示。图 1结果
表明，（AAG）5在百萨偃麦草的绝大部分染色体
上具有明显的荧光带纹，可以很好地将 7对百萨
偃麦草染色体区分开来。荧光信号在不同的百萨
偃麦草染色体上的强弱不同，而且在不同位点也
有变化，信号的强弱反映了拷贝数的多少。
由于百萨偃麦草每条染色体所属的部分同
源群尚不清楚，用 J1～J7表示百萨偃麦草 7对染
色体，建立了百萨偃麦草 7对染色体的（AAG）5
荧光原位杂交核型排列图（图 2）。各染色体
（AAG）5荧光带型特征为：染色体 J1，染色体最
长，有很弱的着丝粒带和长臂中间带；染色体 J2，
染色体短臂无带、具长臂中间带；染色体 J3，无明
显带纹；染色体 J4，有较强的着丝粒带，长臂具近
着丝粒带；染色体 J5，长、短臂均有强的近着丝粒
带；染色体 J6，具有着丝粒带、长臂近着丝粒带和
中间带；染色体 J7，具有着丝粒带。
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3 讨论
简单重复序列分布于编码区和非编码区，通
常与异染色质相关联。许多重复序列在小麦近缘
种甚至不同属间是共享的，但在不同基因组中分
布模式是不同的[2]。简单重复序列的 FISH结果表
明，SSR在染色体上有成簇分布的，也有弥散分
布的[15]。目前，利用的有单碱基、2个碱基、3个碱
基和 4个碱基重复的长度在 15～20 bp 的简单
重复序列，并建立了在有丝分裂、减数分裂染色
体和线性染色体上鉴定目的简单重复序列富集
区的非变性荧光原位杂交方法[16]，这将有益于基
因组分析和简单重复序列在染色体上的结构功
能的研究。合成的寡核苷酸探针（简单重复序列）
由于链短，其序列复杂度低，相对分子质量小，杂
交效率明显高于长探针；寡核苷酸探针可识别靶
序列内 1个碱基的变化，具有可大量人工合成、
价格低廉等独特的优点。通过高度重复序列与简
单重复序列作探针的多色 FISH和多重 FISH技
术已被广泛应用于构建染色体物理图谱，进行基
因组分析、核型关系、遗传多样性和进化的研究，
还可发现进化过程中的染色体重排。
已有 45SrDNA在百萨偃麦草染色体上的分
布研究[17- 18]，今后应进一步结合其他的重复序列，
如 pAs1，pSc119，pTa794（5SrDNA）和简单重复序
列的荧光原位杂交相结合对同一个有丝分裂中
期细胞的染色体进行连续、多色 FISH，建立每条
染色体的综合荧光核型。本研究表明，（AAG）5在
供试的百萨偃麦草的各染色体间存在很大的差
别，百萨偃麦草（AAG）5位点的鉴定，为在分子水
平上研究小麦族的物种起源与进化提供了新的
信息。本研究中发现用荧光素（Fluorescein- 12-
dUTP）标记（AAG）5的效果（荧光信号强度）要差
些，因此，在采用荧光素标记作探针时，杂交液中
要适当加大探针的用量，以获得理想的效果。这
与王苏玲和庄丽芳等[19- 20]的研究结果一致。本研
究未发现百萨偃麦草有明显的随体染色体，而
Endo等[21]的结果却显示百萨偃麦草具有 2对随
体染色体。具体各同源群的百萨偃麦草染色体荧
光带型的确定还需要利用全套的中国春 - 百萨
偃麦草二体异附加系作进一步研究，但研究发现
导入小麦背景的百萨偃麦草染色体存在染色体
重排现象[22]，因为染色体结构的微小变化往往表
现为带型的多态性。说明在百萨偃麦草的进化过
程中经历了较多的变化，为今后的鉴定带来了一
定的难度。
不同物种的染色体 C- 分带带型有明显的差
异，因而可用作鉴别物种的依据[19]。染色体分带
作为常用的细胞学鉴定手段，其效果受染色体制
片质量和吉姆萨（Giemsa）染液的影响较大。利用
重复序列的染色体识别技术是分带技术的有益
补充。分带大多只能在组成性异染色质区产生带
纹，对于异染色质少的染色体的鉴定往往成效不
大。利用不同的重复序列探针可以产生不同的分
子核型，基因组原位杂交（GISH）、多个重复序列
探针相结合的双色或多色 FISH技术以及分子标
记等多种技术相结合可以更高效地识别染色体
的身份。
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2.6 日本薯蓣试管苗的移栽
当薯蓣试管苗长至 5～6片叶时进行移栽，
在培养间 28℃左右的条件下，打开瓶盖，逐渐降
低湿度，进行炼苗，2～3 d后洗净试管苗根部培
养基，移栽到装有沙、蛭石、泥炭土混合基质的营
养钵或移栽盘中，用 800～1 000倍移栽液浇灌，
并采取适当的保湿措施，移栽成活率达 85.5%。
同时，移栽时期以春、秋、冬三季为好，植株成活
率高；夏季由于高温高湿，细菌繁殖速度较快，容
易造成污染，移栽成活率降低。
3 结论和讨论
本研究得出，标准的脱毒快繁程序为：消毒
的茎段在培养上产生无菌苗，切取无菌苗 0.2～
0.4 mm 茎尖接种到 MS＋0.5 mg/L 6- BA＋1.5
mg/L NAA，进行病毒检测并剔除带毒茎尖苗，脱
毒茎段接种到 MS＋1.5 mg/L 6- BA＋0.5 mg/L
NAA进行诱导多芽体快繁，多芽体分割成单芽
在MS＋2.0 mg/LKT＋0.02 mg/LNAA上进行诱根
和生长，生根的再生植株移栽到大田。
本试验只是确定了脱毒的流程，获得了移栽
到大田的脱毒植株，在生产上的应用和表现以及
推广工作还有待于进一步研究。
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