全 文 ：中国农业科学 2007,40(6):1101-1107
Scientia Agricultura Sinica

收稿日期：2006-05-08；接受日期：2006-09-08
基金项目：国家“863”计划（2003AA211010，2004AA222120）
作者简介：唐益苗（1973-），男，安徽枞阳人，博士研究生，研究方向为小麦生物技术。通讯作者张增艳（1963-），女，研究员，博士，研究方向为
植物抗病分子生物学。Tel：010-68918781；E-mail：Zhangzy@mail.caas.net.cn；辛志勇（1942-），男，研究员，研究方向为作物遗传育种。
Tel：010-68918781；E-mail：Xinzhy@mail.caas.net.cn



中间偃麦草 NPR1 同源基因 TiNH1 的分离和特性分析
唐益苗，张增艳，辛志勇
（中国农业科学院作物科学研究所，农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程，农业部作物遗传育种重点开放实验室，北京 100081）

摘要：【目的】NPR1 是调控植物抗病反应的一个关键基因。对中间偃麦草 NPR1 同源基因 TiNH1 进行分离和
特性分析。【方法】利用 RT-PCR 和 RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术获得 TiNH1 全长 cDNA 序
列，利用 Northern 和 Southern 分别研究 TiNH1 表达特性及其在中间偃麦草基因组中存在形式。【结果】获得了
该基因 cDNA 序列，命名为 TiNH1。其编码蛋白 TiNH1 的氨基酸序列分别与水稻、烟草和拟南芥的 NPR1 同源性
为 80%、54%和 46%。Northern 杂交分析结果表明：TiNH1 基因在正常情况下有微量表达，在小麦白粉病菌和纹
枯病菌诱导下，该基因表达水平得到提高。Southern 杂交分析结果表明；该基因以单拷贝形式存在于中间偃麦
草基因组中。【结论】中间偃麦草 NPR1 同源基因 TiNH1 编码由 580 个氨基酸组成的蛋白质 TiNH，具有已知 NPR1
蛋白保守的结构域和功能氨基酸，可能参与寄主对小麦白粉病菌和纹枯病菌的防御反应。
关键词：中间偃麦草；NPR1 同源基因；白粉病菌；纹枯病菌；抗性

Isolation and Characterization of NPR1 Homolog Gene TiNH1 in
Thinopyrum intermedium
TANG Yi-miao, ZHANG Zeng-yan, XIN Zhi-yong
(National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding, Institute
of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

Abstract: 【Objective】NPR1 is a key regulator in plant defense response. The NPR1 homolog gene TiNH1, named as TiNH1
was isolated from Th. intermedium and characterized. 【Method】The full-length cDNA of TiNH1 gene was isolated by RT-PCR and
RACE (rapid amplification of cDNA ends ) methods. The expression pattern of TiNH1was studied by Northern blot and its copy
numbers in Th. intermedium genome was clarified by Southern blot. 【Result】The full-length cDNA of TiNH1 was obtained from Th.
intermedium. The predicted protein TiNH1 shares high homology with a reported NPR1 from rice (80%), a tobacco NPR1 (54%), a
Arabidopsis NPR1 (46%), respectively. Results of Northern blot suggested that the expression of TiNH1 was very low in normal
condition, but increased when treated with the pathogens of powdery mildew and Rhizoctonia cerealis. Southern blot showed that
TiNH1 was present with signal copy in Th. intermedium genome.【Conclusion】The open reading-frame of NPR1 homolog Gene
TiNH1 in Th. intermedium was 1740bp, encoding the TiNH1 protein consisting of 580 amino acid residues. TiNH1 has two
conservative function domains of the known NPR1 protein. TiNH1 is potentially involved in host defense responses to powdery
mildew and Rhizoctonia cerealis.
Key words: Thinopyrum intermedium; NPR1 homolog gene; Powdery mildew (Blumeria graminis); Rhizoctonia cerealis;
Resistance
0 引言
【研究意义】NPR1（nonexpressor of pathogenesis-
related genes 1）基因是调控植物抗病反应的关键基因
之一，具有广谱抗病作用[1]。【前人研究进展】系统
获得抗性（systemic acquired resistance，SAR）是植物
1102 中 国 农 业 科 学 40卷
一种长期防御反应，对活体营养型病原菌等具有广谱
抗性并调控病程相关蛋白（pathogenesis-related，PR）
表达[1]。在拟南芥中，NPR1是水杨酸（salicylic acid，
SA）介导 SAR 的重要调控基因[1, 2]。拟南芥 AtNPR1
基因编码一个锚蛋白重复序列 ANK（Ankyrin Rpeat
Domain）和一个 BTB/POZ（Broad-Complex，Tramtrack,
and Bric-a-brac/Pox virus and Zinc Finger）结构域，这
两个结构域参与蛋白质之间的相互作用[3]。在非诱导
状态下，AtNPR1蛋白以多聚体形式存在，位于细胞质
内。一旦发生 SAR诱导，NPR1蛋白氧化为单体、并
转移到细胞核内，进而激活 PR（如 PR-1，PR-2等）
基因，最后导致 SAR，使植物产生免疫反应[4]。AtNPR1
的核定位对其功能非常必要[5]。除 SA 途径外，NPR1
在茉莉酮酸（Jasmonic acid，JA），乙烯（Ethylene，
ET）信号传导途径，以及不依赖 SA但依赖 ET和 JA
介导 ISR（induced systemic resistance）中也起着重要
作用[6]。NPR1调节着 ISR和 SAR的防御途径，是必
需的调控基因之一[7]，因此 NPR1在整个防御反应网
络中起着重要的作用。NPR1基因作为植物广谱抗病
性基因已成为国内外研究热点。AtNPR1 在转基因拟
南芥中过量表达，只增强对细菌和线虫抗性、而无其
他显著的有害影响[8]。转 AtNPR1基因的番茄对真菌
和细菌具有广谱抗性[9]。转 AtNPR1基因的水稻植株
提高了对白叶枯病菌的抗性[10]。过量表达水稻 NPR1
基因的水稻也可以提高对白叶枯病菌抗性 [11]。
AtNPR1 过量表达的转基因小麦对赤霉病菌的抗性得
到了提高[12]。由于 NPR1及其同源基因在植物抗病基
因工程中具有广泛的应用前景，因此该基因的研究与
应用引起了国际上的极大关注。目前有关拟南芥
NPR1及其同源基因（专利号：6091004；5986082）
已经申请专利 2 次、水稻的（专利号：6995306），
小麦的（专利号：WO0070069）和玉米的（专利号：
WO0065037）也各申请专利 1 次。中国也展开了对
NPR1及其同源基因的研究工作。邓晓玲[13]等克隆了
甘蓝型油菜 NPR1基因。【本研究的切入点】小麦近
缘植物中间偃麦草具有抗小麦锈病[14]、白粉病[15]、
病毒病[16]、纹枯病（Li S S 私人通讯）等多种抗性。
因此，分离与研究中间偃麦草中 NPR1同源基因，不
仅有利于揭示麦类植物的抗病机制，还可促进小麦广
谱抗病分子育种，具有重要的理论和实际意义。【拟
解决的关键问题】本文拟从中间偃麦草克隆 NPR1同
源基因 TiNH1全长 cDNA序列，并对 TiNH1特性进
行研究。
1 材料与方法
1.1 植物材料
中间偃麦草（Th. intermedium, 2n = 42, E1E1E2E2St
St）由本研究所李立会研究员提供。小麦白粉病菌由
中国农业科学院植物保护研究所提供，小麦纹枯病菌
由江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所提供。
1.2 方法
1.2.1 材料处理 生长 4周左右的中间偃麦草叶片分
别用小麦白粉病菌和纹枯病菌诱导处理 0、5、10 和
24 h，收集材料，用于 RT-PCR和 Northern杂交分析。
1.2.2 总 RNA 提取 总 RNA 提取利用 TRIZol kit
（天为时代），并根据其提供方法进行。
1.2.3 TiNH1 保守区段及其 cDNA 全长的获得 利
用接种小麦白粉病菌 24 h 的中间偃麦草叶片提取总
RNA，按照宝生物公司提供的方法（RNA PCR Kit Ver
3.0）合成 cDNA第 1条链，并用其作为模板进行 PCR
扩增。根据 NPR1保守序列（QRHLLD和 KAFSED）
设计引物，通过 RT-PCR 方法扩增 NPR1 片段。PCR
反应总体积为 50 µl，包括 1 µl cDNA，50 µmol·L-1
dNTP，1 µmol·L-1引物，1U Taq酶及缓冲液（1×）。
PCR反应程序为：95℃预变性 5 min；95℃，30 s，56
℃，1 min，72℃，1 min，30个循环；72℃，10 min
补平末端。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收并
克隆到 pGEM-T载体（Promega）上，进行测序分析。
根据获得 NPR1保守区段设计 5′-RACE和 3′-RACE的
特异性引物，RACE 程序按照 Invitrogen 公司提供
5′-RACE和 3′-RACE试剂盒的说明书进行。5′-RACE
特异性引物 GSP：TTGATCTTATCCGTTGCAAACT；
Nest GSP：GAGAGATGCCTGGAGATGGTAG；3′-
RACE：特异性引物 GSP：ACCTGCAAGATACGC
TTCTGA扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收并克
隆到 pGEM-T载体上，进行测序分析。
1.2.4 序列分析 将获得的全长序列在 Genbank 进
行 BLASTP比较，用 DNAMAN软件分析。
1.2.5 Northern 杂交和 Southern 杂交 根据安玛西
亚公司 Hybond-N+手册提供相关方法进行。利用
Quantity One软件进行表达水平分析。
2 结果与分析
2.1 中间偃麦草的 TiNH1 基因全长 cDNA 序列的分离
和氨基酸结构分析
根据水稻、拟南芥和烟草 NPR1 基因保守区段
6期 唐益苗等：中间偃麦草 NPR1同源基因 TiNH1的分离和特性分析 1103
（QRHLLD和 KAFSED）设计 1对引物 NPR1-F：CAG
CGGCATCTCCTTGAT 和 NPR1-R：GTCCTCGCT
GAACGCCTT，从白粉病菌处理的中间偃麦草叶片
cDNA中扩增出 1条大约 1.2 kb带，克隆并进行序列
分析，结果表明：所获得的扩增片段是预想的 NPR1
基因片段。
通过 5′-RACE和 3′-RACE的方法，使用特异性引
物获得该基因的全长 cDNA 序列，命名为 TiNH1
（Thinopyrum intermedium NPR1 homolog 1）。TiNH1
基因开放阅读框含有 1 740个核苷酸，编码 580个氨
基酸。在 53～199和在 282～377氨基酸之间分别含有
BTB/POZ和 ANR结构域（图 1）。利用 GenBank的
BLASTP对 TiNH1的氨基酸比较发现：TiNH1与水稻
NPR1（OsNPR1，登陆号：NM_189701.1）一致性最
高，达 80%；其次是烟草 NPR1（NtNPR1，登陆号：
AF480488）一致性为 54%；拟南芥 NPR1（AtNPR1，
登 陆 号 ： AY088183 ） 一 致 性 为 46% ； 玉 米
NPR1(ZyNPR1，专利号：WO0065037）一致性为
40.7%；小麦 TaNPR1（专利号：WO0070069）一致性
为 39.8%，但与克隆的小麦另一个 NPR1 同源基因编
码的蛋白 TaNH1一致性达 98.3%（未发表）。



图中的数字表示氨基酸的位置
The number represents amino acid positions in TiNH1 protein

图 1 TiNH1 蛋白的 BTB 和 ANK 保守域
Fig. 1 The positions of the BTB and ANK domains in TiNH1
sequence

利用 DNAMAN软件，对拟南芥、烟草、小麦、
玉米NPR1和中间偃麦草 TiNH1编码的蛋白进行了比
较（图 2）。结果表明：对 NPR1 的功能起关键作用
的氨基酸具有保守性，如 npr1-1（H），npr1-2（C），
nim1-4（R），在上述 4个物种 NPR1及中间偃麦草同
源蛋白 TiNH1中完全相同。
2.2 TiNH1 的 GC 含量分析及来自不同的物种的 NPR1
基因片段进化分析
对 TiNH1cDNA序列中GC含量分析表明，TiNH1
5′端核苷酸平均 GC含量（1～570个核苷酸平均 GC
含量为 72%）明显高于 3′端的 GC含量（571～1174
个核苷酸平均 GC含量为 44%）。这与水稻 NPR1 5′
端 GC含量比 3′端 GC含量高约 25%的报道一致[17]。
然而，拟南芥 AtNPR1的 5′端类似区域GC含量（50%）
低于 TiNH1 GC含量（72%）， AtNPR1与 TiNH1基
因 3′端类似区域核苷酸平均 GC含量为 50%。
利用 DNAMAN软件，对拟南芥、烟草、小麦、
玉米NPR1和中间偃麦草编码蛋白 TiNH1进行了进化
树分析（图 3）。结果表明：TiNH1 与水稻 OsNPR1
关系比较密切，与小麦 TaNPR1（WO0070069）关系
比较远。与本文氨基酸序列同源性比较结果一致。
2.3 TiNH1 基因的表达特性
以 TiNH1为探针，与不同病原处理的中间偃麦草
总 RNA进行 Northern杂交分析（图 4，5）。结果表
明：TiNH1 正常情况下有微量表达，但在小麦白粉病
菌诱导下表达增强（图 4A），图 4A信号带位置不一
致与电泳过程有关。通过 Quantity One软件分析得到
TiNH1 表达量曲线图（图 4B），其中纵轴是 TiNH1
表达量与 18S rDNA的比值，横轴是接种病原物时间。
从 4B曲线图知，TiNH1在白粉病菌诱导 10 h到 24 h
表达量最高。同样，TiNH1 在小麦纹枯病菌诱导情况
下表达增强（图 5A，图 5B），以纹枯病菌处理 5 h
的表达量最高，随后降低。这些结果表明：小麦白粉
病菌和纹枯病菌诱导下 TiNH1表达模式有所不同。
2.4 TiNH1 拷贝数分析
为了解 TiNH1在中间偃麦草基因组中的分布情况，
以 TiNH1全长 cDNA序列为探针与 DarI，BamHI限制
内切酶消化的中间偃麦草基因组 DNA进行 Southern
杂交分析（图 6）。结果表明 TiNH1以单拷贝的形式
存在于中间偃麦草基因组中。
3 讨论
最早从拟南芥中克隆的 NPR1基因是调控植物抗
病反应的一个关键基因。它不仅对植物 SAR[3]和 ISR[18]
起核心调控作用，而且是植物基础抗性（ basic
resistance）[3]以及由抗病基因（resistance gene，R）决
定的抗性反应网络[19]的重要调控因子。NPR1 通过与
TGA 转录因子相互作用调控 PR 基因表达[20]。NPR1
作为多种信号途径的交叉点，与某些 WRKY 转录因
子和 NPR4（与 NPR1同源）一起，在调节、平衡 SA
与 JA 信号传导途径中起关键作用[21]。在许多重要经
济作物中都存在 NPR1及其同源基因[8]，NPR1及其同
1104 中 国 农 业 科 学 40卷
源基因介导的抗性可能是多种植物共同的保守途径，
并具有广谱抗病作用[8, 22]。因此，本研究从具有多种
抗性的小麦近缘植物中间偃麦草中分离 TiNH1，可为
小麦广谱抗病育种打下良好的工作基础。
本研究利用自己设计的简并引物，以中间偃麦草
cDNA 为模板，采用 RT-PCR 技术，获得了与已知
NPR1 基因序列高度保守的片段，其氨基酸序列与水
稻 NPR1平均相似性达到 84%，可认为该片段确实是
NPR1基因同源序列。根据该段序列，重新设计引物，
通过 RACE技术获得了 TiNH1全长 cDNA序列。分析
表明：TiNH1全长氨基酸序列与水稻 OsNPR1的平均
相似性达到 80%，并具有已知 NPR1蛋白的 BTB/POZ
和 ANK保守域（图 1）。对拟南芥和水稻 NPR1研究
表明，ANK保守域结构是 NPR1与 TGA转录因子相

AtNPR1
NtNPR1
OsNPR1
TiNH1
Consensus
.
.
M
M
.
.
E
E
.
.
P
A
.
.
P
P
M
M
T
S
D
D
S
S
T
N
H
H
T
S
V
V
I
R
T
T
D
T
N
T
G
A
A
S
f
F
F
F
F
A
S
S
S
d
D
D
D
D
S
S
S
C
Y
N
D
D
E
D
S
S
I
I
A
V
s
S
S
S
S
S
G
V
M
T
S
E
E
S
S
E
D
F
S
G
.
V
I
G
.
A
C
A
A
T
C
D
A
D
I
A
P
N
G
D
D
T
G
A
A
D
G
D
D
S
M
V
V
S
T
E
E
I
E
A
A
V
F
L
L
Y
F
R
R
L
S
R
R
A
P
L
L
A
E
S
S
E
T
D
D
Q
S
N
N
V
P
L
L
L
A
A
A
T
E
A
A
G
I
A
A
P
T
F
F
D
S
R
R
V
L
S
S
S
K
P
P
A
R
E
D
L
L
D
E
Q
S
F
F
L
E
A
A
L
T
F
F
S
L
L
L
N
E
A
A
S
S
D
D
F
I
A
A
E
F
R
I
S
D
I
V
V
A
A
A
F
S
V
V
D
L
P
P
S
P
G
.
P
E
G
.
D
F
G
.
D
D
G
.
F
Y
G
G
Y
F
G
E
S
A
G
P
d
D
D
D
D
A
A
L
L
K
K
L
R
L
L
V
V
V
V
H
H
L
V
R
R
S
S
C
C
AtNPR1
NtNPR1
OsNPR1
TiNH1
Consensus
D
G
V
V
G
P
L
L
R
C
S
S
.
K
A
A
E
E
R
R
V
I
S
S
S
P
P
P
F
V
F
F
H
H
L
L
r
R
R
R
R
C
C
G
A
V
I
V
V
L
L
F
F
S
S
A
K
A
A
R
R
r
R
R
R
R
S
S
A
A
S
P
A
A
F
F
A
A
F
F
A
A
K
K
A
A
S
N
G
A
A
.
.
.
L
L
G
G
A
F
G
G
A
C
G
G
A
G
E
S
K
K
D
A
K
K
G
G
.
.
G
G
E
E
E
A
K
K
R
E
D
N
L
G
S
S
E
N
N
S
L
R
N
.
.
.
T
.
.
.
A
.
.
.
A
.
.
.
V
.
.
.
K
K
R
A
L
V
E
E
E
E
L
L
L
L
L
R
K
K
G
E
E
E
G
L
I
V
G
L
A
M
G
G
K
K
E
E
D
E
E
E
Y
H
V
V
e
E
E
E
E
v
V
V
V
V
G
S
G
G
F
Y
Y
Y
D
D
E
E
S
A
A
A
V
V
L
L
V
M
R
Q
T
S
L
L
v
V
V
V
V
l
L
L
L
L
A
A
D
D
y
Y
Y
Y
Y
V
L
L
P
y
Y
Y
Y
Y
s
S
S
S
S
S
G
G
G
R
K
R
R
v
V
V
V
V
R
R
G
R
P
P
D
D
P
S
L
L
p
P
P
P
P
k
K
K
K
K
G
D
A
S
AtNPR1
NtNPR1
OsNPR1
TiNH1
Consensus
V
V
A
A
S
C
C
C
E
V
L
A
c
C
C
C
C
A
V
V
V
d
D
D
D
D
E
N
E
V
N
D
D
D
C
C
C
G
C
S
A
C
.
.
.
P
h
H
H
H
H
v
V
V
V
V
A
A
G
G
c
C
C
C
C
R
R
H
H
p
P
P
P
P
a
A
A
A
A
v
V
V
V
V
D
A
A
S
f
F
F
F
F
M
L
M
M
L
V
A
A
E
E
Q
Q
v
V
V
V
V
l
L
L
L
L
Y
Y
F
F
L
T
A
A
A
S
A
A
F
F
S
S
I
T
T
T
f
F
F
F
F
R
Q
Q
Q
I
I
V
V
P
S
A
G
e
E
E
E
E
l
L
L
L
L
V
V
T
A
T
D
N
N
L
K
L
L
Y
F
F
F
q
Q
Q
Q
Q
r
R
R
R
R
H
H
R
H
l
L
L
L
L
l
L
L
L
L
d
D
D
D
D
V
I
V
F
V
L
L
L
d
D
D
D
D
k
K
K
K
K
V
T
V
V
V
A
E
E
I
A
V
V
E
D
D
D
D
D
N
N
T
V
L
L
L
M
L
P
V
M
L
L
I
V
I
I
l
L
L
L
L
K
S
S
S
L
V
V
V
a
A
A
A
A
n
N
N
N
N
I
I
L
L
c
C
C
C
C
G
G
N
N
k
K
K
K
K
A
A
S
S
c
C
C
C
C
M
E
M
M
K
R
K
K
l
L
L
L
L
L
L
L
F
D
S
E
E
AtNPR1
NtNPR1
OsNPR1
TiNH1
Consensus
R
S
R
R
c
C
C
C
C
K
I
L
L
E
E
D
E
I
I
M
M
I
I
V
V
v
V
V
V
V
K
K
R
R
s
S
S
S
S
n
N
N
N
N
V
V
L
L
d
D
D
D
D
M
I
M
M
V
I
I
I
S
T
T
T
l
L
L
L
L
E
D
E
E
k
K
K
K
K
S
A
S
A
l
L
L
L
L
p
P
P
P
P
E
H
P
E
E
D
D
D
L
I
V
V
V
V
I
I
k
K
K
K
K
E
Q
Q
Q
i
I
I
I
I
I
T
I
I
D
D
D
H
R
S
A
S
r
R
R
R
R
K
A
L
I
E
E
S
T
l
L
L
L
L
g
G
G
G
G
l
L
L
L
L
E
Q
I
A
V
G
S
S
p
P
P
P
P
K
E
E
E
V
S
N
D
K
N
K
N
.
G
G
G
.
F
F
F
.
P
P
P
.
D
N
N
k
K
K
K
K
h
H
H
H
H
v
V
V
V
V
S
K
R
R
N
R
R
R
V
I
I
I
H
H
H
L
K
R
R
K
a
A
A
A
A
l
L
L
L
L
d
D
D
D
D
s
S
S
S
S
d
D
D
D
D
d
D
D
D
D
I
V
V
V
e
E
E
E
E
l
L
L
L
L
V
L
V
V
K
Q
R
R
L
M
M
M
l
L
L
L
L
l
L
L
L
L
K
R
T
K
e
E
E
E
E
D
G
G
G
H
H
Q
Q
t
T
T
T
T
N
T
N
N
l
L
L
L
L
AtNPR1
NtNPR1
OsNPR1
TiNH1
Consensusd
D
D
D
D
d
D
D
D
D
a
A
A
A
A
C
Y
F
F
a
A
A
A
A
l
L
L
L
L
h
H
H
H
H
F
Y
Y
Y
a
A
A
A
A
v
V
V
V
V
A
A
E
E
Y
Y
H
H
c
C
C
C
C
N
D
D
D
V
A
S
S
k
K
K
K
K
T
T
I
I
A
T
T
T
T
A
T
T
D
E
E
E
l
L
L
L
L
l
L
L
L
L
K
D
D
D
L
L
L
I
D
A
A
A
l
L
L
L
L
a
A
A
A
A
d
D
D
D
D
V
I
V
V
n
N
N
N
N
H
H
H
L
R
Q
R
R
n
N
N
N
N
P
S
P
P
r
R
R
R
R
g
G
G
G
G
y
Y
Y
Y
Y
t
T
T
T
T
v
V
V
V
V
l
L
L
L
L
h
H
H
H
H
V
V
I
I
a
A
A
A
A
a
A
A
A
A
M
M
R
R
r
R
R
R
R
K
K
R
R
E
E
E
D
p
P
P
P
P
Q
K
K
K
L
I
I
I
I
V
I
V
L
V
V
V
s
S
S
S
S
l
L
L
L
L
l
L
L
L
L
E
T
T
T
k
K
K
K
K
g
G
G
G
G
a
A
A
A
A
S
R
R
R
A
P
P
P
S
S
A
S
E
D
D
D
A
L
V
F
t
T
T
T
T
L
S
F
F
E
D
D
D
g
G
G
G
G
r
R
R
R
R
T
K
K
K
a
A
A
A
A
L
L
V
V
M
Q
Q
Q
i
I
I
I
I
A
A
S
S
AtNPR1
NtNPR1
OsNPR1
TiNH1
Consensusk
K
K
K
K
Q
R
R
R
A
L
L
L
t
T
T
T
T
M
R
K
K
A
L
Q
H
V
V
G
G
E
D
D
D
C
F
Y
Y
N
S
F
F
N
K
G
G
I
S
V
N
P
P
T
T
e
E
E
E
E
Q
E
E
E
C
G
G
G
k
K
K
K
K
H
S
P
P
S
A
S
S
L
S
P
P
K
N
K
K
G
D
D
D
R
R
R
K
l
L
L
L
L
c
C
C
C
C
V
I
I
I
e
E
E
E
E
i
I
I
I
I
l
L
L
L
L
e
E
E
E
E
q
Q
Q
Q
Q
E
A
A
A
D
E
E
E
K
R
R
G
r
R
R
R
R
E
D
D
D
p
P
P
P
P
I
L
Q
Q
P
L
L
L
R
G
G
G
D
E
E
E
V
A
A
A
P
S
S
S
P
V
V
V
s
S
S
S
S
F
L
L
L
a
A
A
A
A
V
M
M
L
a
A
A
A
A
A
G
G
G
D
D
E
D
E
D
S
C
l
L
L
L
L
K
R
R
R
M
M
G
G
T
K
R
K
l
L
L
L
L
l
L
L
L
L
D
Y
Y
Y
l
L
L
L
L
e
E
E
E
E
n
N
N
N
N
r
R
R
R
R
v
V
V
V
V
A
G
A
A
l
L
L
L
L
a
A
A
A
A
Q
K
R
R
R
L
I
I
L
L
M
M
f
F
F
F
F
p
P
P
P
P
T
M
M
I
e
E
E
E
E
a
A
A
A
A
Q
K
R
R
AtNPR1
NtNPR1
OsNPR1
TiNH1
Consensus
A
V
V
V
a
A
A
A
A
m
M
M
M
M
E
D
D
D
i
I
I
I
I
a
A
A
A
A
E
Q
Q
Q
M
V
V
V
K
D
D
D
g
G
G
G
G
t
T
T
T
T
C
S
L
L
e
E
E
E
E
f
F
F
F
F
I
P
N
T
V
L
L
L
T
A
G
G
s
S
S
S
S
L
I
G
S
E
G
A
T
P
K
N
T
D
K
P
P
R
M
P
P
L
A
P
P
T
N
E
E
G
A
R
I
T
Q
Q
.
K
.
.
.
R
R
R
.
t
T
T
T
T
S
T
T
T
P
V
V
V
G
D
D
D
V
L
L
L
K
N
N
N
I
E
E
D
A
A
S
A
P
P
P
S
f
F
F
F
F
R
K
I
K
I
I
M
M
L
K
K
K
E
E
E
D
e
E
E
E
E
h
H
H
H
H
Q
L
L
L
S
N
A
A
r
R
R
R
R
L
L
M
M
K
R
T
R
a
A
A
A
A
l
L
L
L
L
s
S
S
S
S
K
R
K
K
t
T
T
T
T
v
V
V
V
V
e
E
E
E
E
l
L
L
L
L
g
G
G
G
G
k
K
K
K
K
r
R
R
R
R
f
F
F
F
F
f
F
F
F
F
p
P
P
P
P
r
R
R
R
R
c
C
C
C
C
s
S
S
S
S
A
E
N
N
v
V
V
V
V
l
L
L
L
L
D
N
D
D
Q
K
K
K
i
I
I
I
I
m
M
M
M
M
N
D
.
.
C
A
.
.
AtNPR1
NtNPR1
OsNPR1
TiNH1
Consensus
E
D
D
D
d
D
D
D
D
L
L
E
E
T
S
T
P
Q
E
D
E
L
I
P
L
A
A
V
A
C
Y
S
S
G
M
L
L
E
G
G
G
D
N
R
R
d
D
D
D
D
T
T
T
A
A
A
S
S
E
E
A
S
K
E
E
E
R
R
.
.
L
Q
.
.
Q
L
.
.
K
K
K
R
K
K
R
K
Q
Q
K
R
r
R
R
R
R
Y
Y
F
F
M
M
H
H
E
E
D
D
I
L
L
L
q
Q
Q
Q
Q
E
E
D
D
T
I
V
T
l
L
L
L
L
K
T
Q
L
k
K
K
K
K
a
A
A
A
A
f
F
F
F
F
S
T
H
S
e
E
E
E
E
d
D
D
D
D
N
K
K
K
L
E
E
E
e
E
E
E
E
L
Y
N
F
G
D
D
N
N
K
R
R
S
T
S
T
S
N
G
T
L
N
.
T
T
I
L
L
D
S
S
S
s
S
S
S
S
T
S
S
S
S
C
S
S
s
S
S
S
S
T
S
S
S
S
T
T
M
K
S
S
S
S
K
I
T
T
G
G
V
G
V
A
A
G
D
I
R
K
K
.
N
R
P
.
L
S
N
.
T
N
K
.
G
R
L
R
R
K
P
P
P
F
F
R
R
S
R
R
R
H
K
.
.
R
.
.
.
R
.
.
.
R
.
.
.

黑色表示同源性 100%，深灰色是同源性 75%，浅灰色是 50%。npr1-1（H），npr1-2（C），nim1-4（R）的氨基酸用箭头指示
Black, dark gray and light gray boxes represent 100%, 75% and 50% similarity, respectively. The npr1-1 (H), npr1-2 © and nim1-4 ® was indicated by arrows

图 2 TiNH1 与 AtNPR1（AY088183）、NtNPR1（AF480488）及 OsNPR1（NM_189701.1）蛋白质序列比较
Fig. 2 Alignment of protein sequences among TiNH1, AtNPR1 (AY088183), NtNPR1 (AF480488) and OsNPR1 (NM_189701.1)
npr1-1
npr1-2
min1-4
6期 唐益苗等：中间偃麦草 NPR1同源基因 TiNH1的分离和特性分析 1105


AtNPR1（AY088183）；NtNPR1（AF480488）；OsNPR1（NM_189701.1）；
ZyNPR1（专利号：WO0065037）；TaNPR1（专利号：WO0070069）
AtNPR1 (AY088183); NtNPR1 (AF480488); OsNPR1 (NM_189701.1);
ZyNPR1 (Patent number: WO0065037); TaNPR1 (Patent number:
WO0070069)

图 3 TiNH1 和 NPR1 进化树分析
Fig. 3 Phylogenetic tree of TiNH1 and other NPR1 proteins
based on amino acid residues using DNAMAN
softward

0 2 5 10 24 (h)




A Northern杂交 Northern blot analysis



B 表达量曲线图 The cure of TiNH1 expression

图 4 白粉病菌诱导中间偃麦草 TiNH1 表达分析
Fig. 4 Northern blot analysis of the expression of TiNH1 in
response to infection with powdery mildew pathogen
0 2 5 10 24 (h)



A Northern杂交 Northern blot analysis



B 表达量曲线图 The cure of TiNH1 expression

图 5 纹枯病菌诱导中间偃麦草 TiNH1 表达分析
Fig. 5 Northern blot analysis of the expression of TiNH1 in
response to Rhizoctonia cerealis in Th. Intermedium.
Four-week-old (Th. Intermedium) seedlings were
treated with Rhizoctonia cerealis for the indicated time

DarI BamH I M


箭头所示为杂交带
The arrow indicates the hybridized band

图 6 TiNH1 与中间偃麦草基因组 DNA 的 Southern 杂交分
析
Fig. 6 Southern blot analysis of Th. intermedium genomic
DNA digested by DraI and BamHI with the probe,
iNH1 cDNA sequence. M, λDNA/HindIII+EcoRI
marker

18S rDNA
TiNH1
18S rDNA
TiNH1
1106 中 国 农 业 科 学 40卷
互作用的必要元件，其中位于 NPR1 蛋白中 ANK 保
守域结构的 npr1-1 和位于 N 端 npr1-2 氨基酸位点突
变则会造成不能结合 TGA蛋白，最后导致 SAR诱导
失败，PR基因的沉默和植株感病能力提高[21]。同样，
NPR1蛋白 nim1-4（R）位点的突变也会引起 SAR诱
导失败[20, 23]。拟南芥中 NPR1同源基因 NPR4编码蛋
白的 nim1-4（R）氨基酸位点突变也会引起植株易感
白粉病（Erysiphe cichoracearum）[22]。TiNH1氨基酸
序列和拟南芥、烟草、小麦的 NPR1序列比较结果表
明，TiNH1在 npr1-1（H），npr1-2（C），nim1-4（R）
位点具有高度一致性（图 2）。这些结果说明：TiNH1
在 npr1-1（H），npr1-2（C），nim1-4（R）上的保守
性对其功能具重要意义，但该基因的具体生物学功能
还需进一步证明。TiNH1 5′端高 GC含量与水稻 NPR1
的相关报道具有类似特征[17]，推测可能与单子叶植物
的 NPR1类基因功能有关。
进化树分析表明（图 3），TiNH1与水稻 OsNPR1
关系密切，TiNH1与水稻 OsNPR1基因在进化过程中
可能存在垂直同源关系，而与目前已申请专利的小麦
TaNPR1 序列关系很远（序列一致性仅为 39.8%），
与我们从小麦中分离的 TaNH1 一致性达 98.3%序列
（未发表）。在拟南芥中，已发现 NPR1～6同源序列，
并证明它们都具有与 NPR1同源特征[22]。因此，推测
中间偃麦草和小麦中还可能存在其它 NPR1 同源序
列，需要进一步挖掘。
一般认为，NPR1 基因为组成性表达，可能不在
转录水平上调控植物抗性[8]。然而，最近 Yu 等[24]证
明，一些WRKY转录因子可与 NPR1基因启动子区域
的W-box序列结合，正向调节 NPR1表达，从而激活
下游基因，调控 PR 基因表达。另外，番茄抗病基因
Cf9和Cf4决定的过敏性坏死反应和抗性产生时NPR1
表达显著增强[25, 26]。由此说明，有一些 NPR1也可能
在转录水平调控着植物抗病性。本研究发现在小麦白
粉病菌和纹枯病菌诱导情况下 TiNH1 基因表达增强
（图 4，图 5）。同时从图 4B和图 5B比较结果还可
以看出，白粉病菌诱导下 TiNH1 的表达高峰在 10 h
到 24 h；而纹枯病菌诱导下 TiNH1的表达水平在 5 h
达到最高，而后则下降，推测 TiNH1可能以不同方式
参与了寄主对上述两种病菌的防御反应。TiNH1 的调
控功能有待进一步深入研究。
4 结论
本研究分离克隆了中间偃麦草 NPR1 同源基因
TiNH1的全长 cDNA序列，该序列编码 580个氨基酸，
具有已克隆的 NPR1 的 BTB/POZ 和 ANR 结构域。
TiNH1 基因在正常情况下有微量表达，在小麦白粉病
菌和纹枯病菌诱导下，表达增强。TiNH1 基因可能参
与了寄主对小麦白粉病菌和纹枯病菌的防御反应。

References
[1] Ryals J A, Neuenschwander U H, Willits M G, Molina A, Steiner H Y,
Hunt M D. Systemic acquired resistance. Plant Cell, 1996, 8:
1809-1819.
[2] Cao H, Bowling S A, Gordon A S, Dong X. Characterization of an
Arabidopsis mutant that is nonresponsive to inducers of systemic
acquired resistance. Plant Cell, 1994, 6: 1583-1592.
[3] Cao H, Glazebrook J, Clarke J, Volko S, Dong X. The Arabidopsis
npr1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel
protein containing ankyrin repeats. Cell, 1997, 88: 57-63.
[4] Mou Z, Fan W, Dong X. Inducers of plant systemic acquired
resistance regulate NPR1 function through redox changes. Cell, 2003,
113: 1-10.
[5] Kinkema M, Fan W, Dong X. Nuclear localization of NPR1 is
required for activation of PR gene expression. Plant Cell, 2000, 12:
2339-2350.
[6] Pieterse C M J, Van Wees S C M, Van Pelt J A, Knoester M, Laan R,
Gerrits H, Weisbeek P J, d Van Loon L C. A novel signaling pathway
controlling induced systemic resistance in Arabidopsis. Plant Cell,
1998, 10: 1571-1580.
[7] Hammond-Kosack K E, Parker J E. Deciphering plant-pathogen
communication: fresh perspectives for molecular resistance breeding.
Current Opinion in Biotechnology, 2003, 14: 177-193.
[8] Cao H, Li X, Dong X. Generation of broad- spectrum disease
resistance by overexpression of an essential regulatory gene in
systemic acquired resistance. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the USA, 1998, 95: 6531-6536.
[9] Lin W C, Lu C F, Wu J W, Cheng M L, Lin Y M, Yang N S, Black L,
Green S K, Wang J F, Cheng C P. Transgenic tomato plants
expressing the Arabidopsis NPR1 gene display enhanced resistance to
a spectrum of fungal and bacterial diseases. Transgenic Research,
2004, 13: 567-581.
[10] Chern M S, Fitzgerald H A, Yadav R C, Canlas P E, Dong X, Ronald
P C. Evidence for a disease-resistance pathway in rice similar to the
NPR1-mediated signaling pathway in Arabidopsis. The Plant Journal,
2001, 27: 101-113.
[11] Chern M, Fitzgerald H A, Canlas P E, Navarre D A, Ronald P C.
Overexpression of a rice NPR1 homolog leads to constitutive
activation of defense response and hypersensitivity to light. Molecular
6期 唐益苗等：中间偃麦草 NPR1同源基因 TiNH1的分离和特性分析 1107
Plant-Microbe Interactions, 2005, 18: 511-520.
[12] Makandar R, Essig J S, Schapaugh M A, Trick H N, Shah J.
Genetically Engineered Resistance to Fusarium Head Blight in Wheat
by Expression of Arabidopsis NPR1. Molecular Plant-Microbe
Interactions, 2006, 19: 123-129.
[13] 邓晓玲, 孔维文, 冯 震, 郭 明, 李华平. 甘蓝型油菜中 NPR1
基因的克隆、载体构建及其转化的研究. 2004年中国植物病理学会
年会论文集. 2005: 570-571.
Deng X L, Kong W W, Feng Z H, Guo M, Li H P. Cloning of NPR1
from Brassica napus and its construction of plant expression vector
and transformation into tobacco. The 2004 Year Disquisitions of
Chinese Society for Plant Pathology, 2005: 570-571. (in Chinese)
[14] Larkin P J, Banks P M, Lagudah E S, Appels R, Chen X, Xin Z Y,
Ohm H W, McIntosh R A. Disomic Thinopyrum intermedium addition
lines in wheat with barley yellow dwarf virus resistance and with rust
resistances. Genome, 1995, 38: 385-394.
[15] Franke R, Nestrowicz R, Senula A, Staat B. Intergeneric hybrids
between Triticum aestivum L. and wild Triciceae. Hereditas, 1992,
116: 225-231.
[16] Xin Z Y, Xu H J, Chen X, Lin Z S, Zhou G H, Qian Y T, Chen Z M,
Larkin P J, Banks P M, Clark B, Appels R, Brettell R I S.
Development of common wheat germplasm resistant to barley yellow
dwarf virus by biotechnology. Sciences in China (Ser B), 1991, 34:
1055-1062.
[17] Wong, G K, Wang J, Tao L, Tan J, Zhang J, Passey D A. Yu J.
Compositional gradients in Gramineae genes. Genome Research, 2002,
12: 851-856.
[18] Iavicoli A, Boutet E, Buchala A, Metraux J P. Induced systemic
resistance in Arabidopsis thaliana in response to root inoculation with
Pseudomonas fluorescens CHA01. Molecular Plant-Microbe
Interactions, 2003, 16: 851-858.
[19] Ekengren S K, Liu Y L, Michael Schiff S P. Dinesh-Kumar Gregory B.
Martin. Two MAPK cascades, NPR1, and TGA transcription factors
play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato. The Plant
Journal, 2003, 36: 905-917.
[20] Zhang Y, Goritschnig S, Dong X, Li X. A gain-of-function mutation in
a plant disease resistance gene leads to constitutive activation of
downstream signal transduction pathways in suppressor of npr1-1,
constitutive 1. Plant Cell, 2003, 15: 2636-2646.
[21] Liu G, Holub E B, Alonso J M, Ecker J R, Fobert P R. An
Arabidopsis NPR1-like gene, NPR4, is required for disease resistance.
The Plant Journal, 2005, 41: 304-318.
[22] Chern M S, Fitzgerald H A, Yadav R C, Canlas P E, Dong X, Ronald
P C. Evidence for a disease resistance pathway in rice similar to the
NPR1-mediated signaling pathway in Arabidopsis. The Plant Journal,
2001, 27: 101-113.
[23] Depres D, DeLong C, Glaze S, Liu E, Fobert P R. The Arabidopsis
NPR1/NIM1 protein enhances the DNA binding activity of a subgroup
of the TGA family of bZIP transcription factors. Plant Cell, 2000, 12:
279-290.
[24] Yu D, Chen C, Chen Z. Evidence for an important role of WRKY
DNA binding proteins in the regulation of NPR1 gene expression.
Plant Cell, 2001, 3: 1527-1539.
[25] Cai X Z, Takken F L W, Joosten M H A J, De Wit P J G M. Specific
recognition of AVR4 and AVR9 results in distinct patterns of
hypersensitive cell death in tomato, but similar patterns of
defence-related gene expression. Molecular Plant Pathology, 2001, 2:
77-86.
[26] De Jong C F, Takken F L W, Cai X Z, De Wit P J G M, Joosten M H
A J. Attenuation of Cf-mediated defense responses at elevated
temperatures correlates with a decrease in elicitor-binding sites.
Molecular Plant-Microbe Interactions, 2002, 15: 1040-1049.

（责任编辑 孙雷心）