全 文 ：北方园艺 2009(12):21 ～ 25 ·试验研究 ·
第一作者简介:梁文杰(1981-),男 ,硕士 ,助教 ,现主要从事经济林
栽培育种及林业生物技术方面的研究工作。 E-mail:lwj6000@
163.com。
通讯作者:谭晓风(1956-),男 ,博士 ,教授 ,现主要从事经济林栽培
育种及林业生物技术的研究工作。 E-mail:tanxiaofencn@yahoo.
com.cn。
基金项目:国家林业局重点科学研究计划新技术开发与储备专项
资助项目(2006-12);湖南省科技计划资助项目(00JZY2115);国家
林业局重点(梨自交不亲和技术的开发与应用)资助项目(2006-
12)。
收稿日期:2009-06-20
秋子梨品种`龙香 S 基因型的鉴定及梨 S42-RNase
新基因的序列分析
梁 文杰1 ,2 , 谭晓 风1 , 王立 新2 , 夏 丽芝2 , 曹 玉芬3 , 张 　琳1
(1.中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室 ,湖南长沙 410004;2.温州科技职业学院 ,
浙江温州 325006;3.中国农业科学院果树研究所,辽宁 兴城 125100)
　　摘　要:利用特异引物对秋子梨品种`龙香的基因组 DNA进行 PCR扩增。通过对扩增片
段的回收 、克隆和测序 ,获得2条大小分别为 469 bp和653 bp的 DNA序列 ,将其推导氨基酸序
列与 GenBank中已登录的梨S基因的序列进行比对。结果表明:469 bp序列与已登录梨的S16-
RNase基因完全一致 ,确定`龙香 的1个等位基因为梨 S16基因;653 bp序列与梨S基因的相似性
在75%～ 90%之间 ,且在高变区存在 6个以上氨基酸的差异 ,近一步分析确定为 1条新的梨S基
因 ,命名为S42-RNase基因 ,该基因在GenBank的登录号为:EF088497。确定秋子梨品种`龙香的
S基因型为S16S42 。
关键词:秋子梨;`龙香 ;自交不亲和性;S因型;鉴定
中图分类号:S 661.203.6　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2009)12-0021-05
　　植物自交不亲和性(Self-incompatibility)是植物生殖
过程中的一种普遍现象 ,约有一半的被子植物为自交不
亲和植物[ 1] 。自交不亲和性对于植物本身预防近亲繁
殖具有重要作用 ,但却给生产上带来了很大的不便。梨
为配子体自交不亲和类型 ,由单个基因位点的多个 S等
位基因所控制[ 2] ,同一品种或S 基因型相同的品种之间
为杂交不亲和 ,否则为杂交亲和。梨品种 S 基因型是梨
生产中授粉树配置和杂交育种亲本选择的依据。日本
最早对其国内梨品种的自交不亲和性进行了分子水平
上的研究 ,并于 1999年建立了快速检验日本梨(P.
pyri folia Nakai)品种S 基因型的 PCR-RFLP 体系[ 3] ,还
用此体系发现了 S8和 S9基因 [ 4-5] 。2002年韩国学者在
砂梨中发现了 S10[ 6] 。中国梨 S基因的分离和梨品种 S
基因型的鉴定工作开展的较晚[ 7-8] ,并且国内已鉴定 S
基因型的梨品种多为白梨和砂梨品种 ,秋子梨品种 S基
因型鉴定的报道很少。秋子梨(Pyrus ussuriensis
Maxm.)是梨属植物中最抗寒的栽培种 ,原产于我国的
东北 、华北和西北地区 ,日本 、朝鲜及俄罗斯亦有分布。
在多数秋子梨品种的果实经后熟后柔软多汁 ,具浓郁的
香气 ,有些品种还适宜加工成果汁等制品。在寒地果树
生产中 ,秋子梨占有很重要的地位。`龙香 是黑龙江省
农业科学院园艺研究所采用`赖子梨自然授粉实生选
育而成的优良品种。1982年2月通过技术鉴定 ,并正式
命名为`龙香 。该品种抗寒 、抗黑星病 、抗虫能力都很
强。该试验报道了秋子梨品种`龙香 S基因型的鉴定及
新基因 S42-RNase的分离和序列分析情况。
1　材料与方法
1.1　试验材料
从中国农业科学院辽宁果树研究所采集秋子梨品
种`龙香的嫩叶 200 mg左右 ,置于液氮中 ,带回实验室
后于-80℃冷冻保存。
1.2　试验试剂
ExTaq 、pMD18-T Vector 购自日本 TAKARA 公
司 , DNA回收试剂盒购自安比奥生物技术公司(Ambio-
gen Life Tech Ltd),其它药品购自上海生工生物工程技
术服务有限公司(上海生工)。
1.3　总 DNA提取和纯化
总 DNA提取主要依据改良的 CTAB 方法[ 9] ,纯化
按照《Current Protocols in Molecular Biology》的方法[ 10] 。
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1.4　PCR扩增
1.4.1　引物　梨 S 基因由 5个保守区(Conserved re-
gion)、1个高频可变区(Hyper variable region)及 1个内
含子(Intron)和外显子(Exons)组成。该试验根据已报
道的梨 S1 ～ S9的 HV 区两端的序列 ,分别在信号肽上
游-32bp处 、保守序列 C1区设计了 5′端延伸引物 P3和
正向引物 P1;在 HV 区下游处设计了反向引物 P2。因
S7中下游引物序列 C被 T 替换 ,因此在 P2引物中设计
了1个简并碱基 Y(A/G)。引物由上海生工合成 ,引物
序列如下:P1:正向引物 ,“FTQQYQ”(5′-TTTACGCAG-
CAATATCAG-3′)。P2:反向引物 , “anti-IIWPNV” (5′-
AC(A/G)TTCGGCCAAATAATT-3′)。P3:5′端延伸引
物 ,(5′-TGCCTCGCTCTTGAACAAA-3′)。
1.4.2　PCR反应体系　PCR扩增按照 Takeshi Takasa-
ki 等[ 5] 的 PCR扩增反应体系和循环条件 ,略有改动。
反应体系和条件如下:反应体系是总体积为 20μL ,包含
1.5 μL PCR Buffer;0.012 μmol dNTPs , 0.05 μmol
MgCl2 ,17 pmol P1/P2或P3/P2 , 1 U Taq DNA聚合酶 ,
10 ng模板 DNA。PCR循环条件为:94℃2 min;94℃
15 s ,48℃30 s ,70℃2 min , 10 个循环;94℃15 s ,48℃
30 s ,70℃2 min 30 s ,25个循环;70℃5 min。
1.5　PCR产物回收 、克隆 、测序
PCR产物回收按照 Ambiogen Life Tech Ltd 的
Puprep Gel Extraction Kit 操作 ,将回收产物按照 pMD
18-T Vector(TaKaRa)说明书操作 ,连接到 T 载体上 ,转
化至大肠杆菌 DH5α,挑选阳性克隆送至上海生工测序。
1.6　序列分析
测序结果用生物信息学软件拼接后 ,经BLASTn 同
源性分析 ,确认为梨S基因。梨 S-RNase基因 HV中含
有一段内含子序列 ,该研究根据双子叶植物内含子和外
显子保守的边界序列(5′GT-AG3′)和已分离的梨
S-RNase 基因的一级结构特点[ 5 , 11-12] ,查找 HV区中的
内含子序列 ,并获得外显子序列 ,推导出 HV 区+周边
区的氨基酸序列 ,进一步比较确认该S基因。
2　结果与分析
2.1 　`龙香 自交不亲和基因特异性扩增及 DNA片段
的回收克隆
用特异引物 P1和 P2对秋子梨品种`龙香 基因组
DNA进行 PCR扩增 ,PCR产物出现 2条带 ,分别约为
530 bp和340 bp。500 ～ 600 bp之间的带用此引物扩增
在以前的梨品种中未出现过 ,初步判断 530 bp左右的 S
基因片断为 1条新基因。为了得到较长的序列 ,又用 5′
端延伸引物 P3和反向引物 P2对其进行扩增 ,PCR产物
同样出现 2条带(图1 、2),分别约为650 bp和 460 bp ,比
P1和 P2扩增出的对应条带分别大 120 bp左右 ,这和引
物设计位置相符合。因此选择 P3和 P2扩增的较长片
段进行下一步试验 ,以便获得较长的序列。
图 1　龙香 S 基因特异引物扩增
注:1.`龙香 ;2.`龙香 。
Fig.1 Amplification of S-RNase f ragments f rom Pyrus ussuriensis Longxiang
Note:M.DNA marker 1.`Longxiang , 2.`Longxiang .
图2　PCR回收产物电泳图
注:1.目的条带 1;2.目的条带 2。
Fig.2　The figure of PCR products extraction
Note:1.S-RNase f ragment one;2.S-RNase f ragment tw o.
2.2　`龙香品种 469 bp基因片段的分离鉴定
以 BLASTn 的默认参数对克隆到的核酸序列进行
相似性搜索 ,发现 469 bp的序列(图3)与 GenBank中梨
的 S16 (登录号:AY249431)完全一致 , 确定为梨
S16-RNase 。
2.3　`龙香品种 653 bp基因片段的分离鉴定
653 bp 的序列至少能搜索到 90 个植物种的
S-RNase序列 ,且相似性达 70%～ 90%,充分说明该片
段是 S-RNase基因 ,需对此序列进行进一步分析。`龙
香 S基因型初步确定为S16SX 。
借鉴GenBank已登录梨的S基因的特点 ,找出保守
区边界 ,推导出 HV区+周边区的氨基酸序列。SX推导
氨基酸序见图4。
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图3　469 bp 基因片段的核苷酸序列
Fig.3　Nucleic acid sequence of the 469 bp gene f ragment
　　将 SX推导的氨基酸序列和 GenBank中已有的梨的
氨基酸序列进行比对(图 5)。从图中可以看出 S x推导
的氨基酸完全符合梨S 基因氨基酸序列所具有的特点:
具有S基因的信号肽 、C1 、C2保守区和HV高变区。除
去HV区 ,S x与其它的S 基因相似性高达75%～ 90%。
HV区是S-RNase的识别区 ,S x的 HV区和以上 S
基因 HV区的相似性仅为10%～ 63%(S2为74%),因此
可以初步确定 Sx 是1条新基因。通过有信号肽的 S基
因比对可以看出 ,除 S2外 ,信号肽由 27～ 28个氨基酸组
成 ,除 S2和 S8外 ,其余的相似性都很高。S x的信号肽由
27个氨基酸组成 ,第一个“I”被“F”取代。保守区 C1由
11个氨基酸组成。Sx 的C1区的第1个“Y”由“F”取代 ,
保守区 C2也由11个氨基酸组成 , HV区除 S15和 S37都
由 13 ～ 15个氨基酸组成 ,且为辨别 S 基因型的主要区
域。S x的 HV区由13个氨基酸组成 ,与 S 基因的 HV
区最接近 ,将S x和 S2的 HV区单独比对(见图 6)。
图 4　SX 核酸序列(上列)及推导的氨基酸序列(下列),核酸序列中阴影部分为内含子区
Fig.4　Nucleic acid sequence of the gene(upper)and the deduced amino acid sequence(listed bleow), The int ron in the shaded nucleic acid sequence
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图 5　推导氨基酸序列与已知其它梨S 基因氨基酸序列比对
Fig.5　Putative amino acid sequences aligement among S x and pear S-RNases on Genbank
　　由图 6可知 ,S2的 HV区的第3 、4、6 、8 、10个氨基酸
“K” ,“R” ,“R” ,“I” ,“R”分别被 S x的 HV区的“Q” ,“K” ,
“Q” ,“M” ,“T”所取代 ,据此可以判断 Sx 是新基因。把
此基因命名为 S42-RNase ,提交至 GenBank ,登录号为:
EF088497。
图6　S x HV区与S2 HV 区比对图
Fig.6　Putative amino acid sequences alignment of Hyper
variable regions of S x and S2
3　结论与讨论
该研究从秋子梨品种`龙香中分离鉴定出 1个新
的S-RNase基因 ,所分离的基因序列为 653 bp ,到目前
为止 ,是从梨基因组用“FTQQYQ”和扩增中唯一 600 ～
700 bp之间的序列。并采用 PCR技术结合 DNA测序
技术确定了秋子梨品种`龙香 的S 基因型为 S16S42 。目
前为止 GenBank中登录的东方梨 S基因已达到 42条。
除了 S1 ～ S9是从日本梨 ,S10从韩国梨中分离出来的外 ,
其余均为中国梨中分离出来的。从此也可以证明我国
梨资源丰富 ,研究我国的梨品种的自交不亲和很可能是
亚洲梨自交不亲和研究的突破口。
日本学者为了快速检测分离出来的 S-RNase基因
创立了适合日本梨的PCR-RFLP体系 ,但对于中国梨来
说 ,能够被此系统的酶切也无法证明是 S1 ～ S9之间的基
因 ,在S30-RNase具有 NdeI的酶切位点 ,S33-RNase具有
AccII和 HincII的酶切位点 ,S42-RNase 具有 AccII的酶
切位点等。所以对于中国梨品种来说日本学者所建立
的 PCR-RFLP系统有一定的局限性 ,尤其对于一个新的
基因来说 ,测序是较快捷和准确的办法 ,因此该试验采
取了直接测序的方法。但测序也限制了中国梨S 基因
分离鉴定的快捷性。随着越来越多的S 基因型的鉴定 ,
应该建立一种类似日本学者所创立的快速检测S 基因
型的方法来快速经济地鉴定中国梨品种的S基因型。
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Identification of S-genotypes and Sequence Analyses of
S42-R Nase from L`ongXiang(Pyrus ussuriensis)
LIANG Wen-jie1 , 2 , TAN Xiao-feng2 ,WANG Li-xin2 , XIA Li-zhi2 , CAO Yu-fen3 , ZHANG Lin1
(1.The Key Lab of Non-wood Forest P roduct of State Forestry Administration , Central South University of Fo restry and Technology , Chan-
gsha , Hunan 410004 , China 2.Wenzhou Vocational College of Science and Technology , Wenzhou , Zhejiang 325006 , China 3.Fruit Tree Re-
search Institute of Chinese Academy of Ag ricultural Sciences , Xingcheng , Liaoning 121600 , China)
Abstract:Using two pairs of primers specific to pear S-PCR amplification from genomic DNA of Chinese pear cultivar
Longxiang was carried out.Then the PCR products were extracted , cloned and sequenced.Consequently , 469 bp and
653 bp DNA sequences of S-RNase were determined.Comparison of the two S-RNase alleles and those deposited under
GenBank revealed that the 469 bp S-allele w as identical to S16-allele , and that the 653 bp S-allele represents a new allele
and was 75%～ 90%homologous to other pear S-alleles.The new S-allele was thus named S42-RNase allele that was
submitted to GenBank(Accession number EF088497).The S-genotype of `Long Xiang (P.ussuriensis)was identified as
S16S42 .
Keywords:Pyrus ussuriensis ;`Longxiang ;Self-incompatibility;S-genotype;Identifiation
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