全 文 ：DOI:10． 13463 / j． cnki． jlzyy． 2015． 11． 025
脱氢紫堇碱对高糖培养心肌成纤维
细胞 Wnt信号通路的影响
韩路拓1，2，任钧国1* ，刘建勋1，王伟明2，杨佳妹1，刘馨雨1
(1．中国中医科学院西苑医院基础医学研究所中药药理北京市重点实验室，北京 100091;
2．黑龙江省中医药科学院，哈尔滨 150036)
摘要:目的 采用体外高糖培养心肌成纤维细胞(CFs )的方法，观察脱氢紫堇碱(DHC)对高浓度葡萄糖
培养的心肌成纤维细胞 Wnt信号通路的影响。方法 采用体外高糖诱导心肌成纤维细胞增殖模型，western
blot法检测 β － catenin，GSK-3β以及 P-GSK-3β的蛋白表达水平;ELISA 法观察细胞分泌 TGF-β1 蛋白的能力。
结果 脱氢紫堇碱可以抑制 β-catenin的表达(P ＜ 0． 01)，上调 P-GSK-3β 的表达(P ＜ 0． 05)，减少 TGF-β1 的
合成(P ＜ 0． 01)。结论 脱氢紫堇碱能抑制 Wnt信号通路的异常表达，具有潜在的抗心肌纤维化作用。
关键词:脱氢紫堇碱;高糖;心肌成纤维细胞;Wnt信号通路
中图分类号:Ｒ542． 2 文献标志码:A 文章编号:1003 － 5699(2015)11 － 1162 － 04
基金项目:国家自然科学基金资助项目(H2809)。
作者简介:韩路拓(1986 －) ，女，硕士，主要从事细胞药理学研究。
* 通信作者:任钧国，电子信箱 － reek2003@ 163． com
Dehydrocorydaline on Wnt signal pathway of cardiac fibroblasts cultured by high glucose
HAN Lutuo1，2，ＲEN Junguo1* ，LIU Jianxun1，WANG Weiming2，YANG Jiamei1，LIU Xinyu1
(1． Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital China Academy of Chinese Medical Sciences，
Beijing Key Laboratory of Pharmacology of Chinese Materia，Beijing 100091 ，China;
2． Traditional Chinese Medicine Institute of Heilongjiang Chinese Medicine Academy of Sciences，
Harbin 150036，China)
Abstract:Objective Take the method of cultured cardiac fibroblasts (CFs)in vitro，to observe the effect of De-
hydrocorydaline on high glucose cultured cardiac fibroblasts of Wnt signal pathway． Methods By the cardiac fibro-
blasts model in vitro induced by high glucose，detection of the expression level of β-catenin，GSK-3β，P-GSK-3β by
western blot;to observe the ability of the cell TGF-β1 protein secretion by ELISA method ． Ｒesults Dehydrocoryda-
line can inhibit the expression of β-catenin (P ＜ 0． 01) ，upregulate the expression of P-GSK-3β (P ＜ 0． 05) ，reduc-
tion of the synthesis of TGF-β1 (P ＜ 0． 01)． Conclusion Dehydrocorydaline can inhibit of abnormal expression of
Wnt signaling pathway ，have potential effects of anti myocardial fibrosis．
Keywords:Dehydrocorydaline;high glucose;cardiac fibroblasts;Wnt signal pathway
糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病最常见的心血管
并发症之一，心肌物质和能量代谢改变，是糖尿病心
肌病发生的重要环节［1］，心肌纤维化是其病变的关
键［2］。研究表明，Wnt信号通路在心脏发育和血管生
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成中有重要作用，在心脏发育早期，Wnt 信号通路的
激活可以促进心脏祖细胞增殖和迁移，在心脏发育晚
期，抑制其活性则可促进心肌细胞分化［3］。因此，抑
制 Wnt信号的异常激活，可作为防治糖尿病心肌纤
维化的一个手段。延胡索，又名元胡，是一种临床常
用中药，其现代药理作用研究主要集中于心血管系统
和神经系统。延胡索的主要活性成分为生物碱类，脱
氢紫堇碱(DHC)又称去氢延胡索甲素，是其中的一
种季胺类生物碱。笔者前期实验研究已表明，脱氢紫
堇碱干预高糖培养的心肌成纤维细胞后，对细胞的增
殖、细胞 S期分裂都有明显抑制作用，还可以明显降
低 I型、Ⅲ型胶原的分泌能力［4］。为进一步研究其作
用机制，本实验采用体外高糖培养的心肌成纤维细胞
模型，观察脱氢紫堇碱对心肌成纤维细胞 Wnt 信号
通路的影响。
1 实验材料
1． 1 实验动物 SD大鼠乳鼠 20 只，出生 24 h 内，SPF
级，雌雄不限，购于北京维通利华实验动物技术有限公
司，许可证号:11400700012085，11400700019526。
1． 2 主要试剂和仪器 胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶均为
Sigma公司进口分装产品。脱氢紫堇碱对照品(北京
鑫方程生物公司，批号 120930，20 mg) ，卡托普利对
照品(中国食品药品检定研究院，批号 100318-
201103，100 mg)。TGF-β1 ELISA 试剂盒(美国 ＲD
公司) ，小鼠抗波形蛋白单克隆抗体和小鼠抗结蛋白
单克隆抗体(Biogenes 公司) ，PVDF 膜(北京智杰方
远科技有限公司) ，ECL 发光液(美国赛默飞世尔科
技有限公司)。DMEM 高糖培养基，DMEM 低糖培养
基和胎牛血清(FCS)均为 GIBCO 公司产品。兔抗大
鼠-catenin单克隆抗体，兔抗大鼠-GSK-3β 单克隆抗
体，兔抗大鼠-P-GSK-3β单克隆抗体，兔抗大鼠 GAP-
DH多克隆抗体及羊抗兔多克隆抗体均为美国 abcam
公司产品。酶联免疫分析仪(美国 BioTek 公司) ，
Western成像系统(美国伯乐公司)。其他常用生化
试剂均为国产分析纯。
2 实验方法
2． 1 差速贴壁法体外培养心肌成纤维细胞及鉴定
参照 SＲEEJIT P 等［5］的方法加以改进，取出生 24 h
内的 SD大鼠乳鼠，无菌条件下，开胸后快速摘取心
脏，浸泡在预冷的 0． 01% 磷酸盐缓冲液中，以除去血
细胞。75% 的酒精浸泡 30 s 后，将其剪成 1 mm3 大
小的碎块，弃去缓冲液，加入等体积的 0． 1%的Ⅱ型
胶原酶和 0． 125%的胰蛋白酶，于 37 ℃水浴反复振
荡消化，直至组织块消化完全，分别收集每次的消化
悬液。用含 10% FCS的 DMEM低糖培养液来终止消
化，将收集的消化悬液离心(2 000 r /min，10 min) ，上
清弃去，再加入含 10% FCS 的 DMEM 低糖培养基，
吹打成细胞悬液，接种至培养瓶，于 37 ℃、5% CO2 培
养箱内培养。根据心肌成纤维细胞(CFs)和心肌细
胞贴壁时间的不同，采用差速贴壁分离法，贴壁
60 min后弃上清，剩下的则应为 CFs，加入含 10%
FCS的 DMEM低糖培养液继续培养。经免疫组化鉴
别，波形蛋白染色呈阳性和结蛋白染色为阴性，判断
所得细胞为所需的心肌成纤维细胞，纯度达 98%，台
盼兰染色细胞活力大于 90%。待 80% ～ 90%细胞融
合后，用 0． 25%胰酶消化传代(12)，实验采用2 ～ 4代
细胞。
2． 2 实验分组 将心肌成纤维细胞分为正常对照
组:DMEM低糖培养基(内含 5． 5 mmol /L D-葡萄糖) ，
模型对照组:DMEM高糖培养基(内含 25 mmol /L D-
葡萄糖) ，脱氢紫堇碱组(100、50 mg /L) ，卡托普利组
(22 mg /L)。
2． 3 ELISA法检测 TGF-β1 蛋白含量 取 CFs 制成
细胞悬液，按 1 × 105 个 /mL 的细胞密度接种于 6 孔
板，37 ℃、5% CO2 培养箱中培养 24 h 后，换无血清
DMEM同步化 24 h，按实验分组处理后，培养 48 h 分
别吸取细胞上清液，严格按照试剂盒说明检测 TGF-
β1 的含量，450 nm 处检测吸光度(A) ，根据浓度曲
线，计算每孔内蛋白浓度。
2． 4 Western-blot法检测β-catenin，GSK-3β，P-GSK-3β
的蛋白表达 细胞总蛋白的提取:取分组处理培养后的
心肌成纤维细胞，加入蛋白裂解液，置于冰浴上 30 min，
细胞刮刀刮取裂解液，离心(2 000 r /min，30 min)后，
收集上清液，紫外分光光度仪检测蛋白含量，根据标
准曲线计算样本浓度;调整浓度后，加入上样缓冲液，
蛋白煮沸 3 min后，置于 － 80 ℃冰箱保存备用。SDS-
聚丙烯酰胺凝胶电泳:经电泳分离蛋白后，将蛋白转
移至 PVDF膜上，含 5%牛血清白蛋白的 TBST 室温
封闭 30 min 后，一抗孵育 20 min，4 ℃冰箱过夜。复
温后，洗膜 5 × 10 min /次，封闭30 min，加二抗封闭
90 min后，洗膜 5 × 10 min /次，加入 ECL发光液，于成
像系统曝光、采集图像。
2． 5 统计学方法 所有实验数据以均数 ±标准差
(珋x ± s)表示，使用 SPSS 17． 0 统计软件分析，组间比
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较采用 t检验和方差分析，P ＜ 0． 05 表示差异有统计
学意义。
3 实验结果
3． 1 乳鼠心肌成纤维细胞的培养与鉴定 乳鼠心肌
成纤维细胞增殖明显，2 ～ 3 d 即呈融合状态。细胞
多呈长梭形，多角形，排列紧密，胞体较大，细胞质透
明，细胞核呈椭圆形，颜色淡，通常含 2 ～ 3 个核，无
自发性搏动。波形蛋白免疫荧光鉴别显示，心肌成纤
维细胞的波形蛋白呈阳性反应，结蛋白呈阴性反应。
3． 2 脱氢紫堇碱对 TGF-β1 分泌的影响 见表 1。
结果显示，与正常对照组比较，高糖可以明显诱导心
肌成纤维细胞合成分泌 TGF-β1(P ＜ 0． 01)。与模型
对照组比较，卡托普利和 100、50 mg /L脱氢紫堇碱均
可明显抑制 TGF-β1 的合成分泌(P ＜ 0． 01)。
表 1 脱氢紫堇碱对 TGF-β1 合成的影响(珋x ± s，n = 5)
组 别 浓度 /(mg /L) TGF-β1 浓度 /(pg /mL)
正常对照组 — 70． 750 ± 5． 734
模型对照组 — 127． 456 ± 26． 996##
脱氢紫堇碱组 100 68． 173 ± 2． 401△△
50 71． 646 ± 8． 023△△
卡托普利组 22 63． 018 ± 11． 123△△
注:与正常对照组比较，# # P ＜ 0． 01，与模型对照组比较，
△△P ＜ 0． 01
3． 3 脱氢紫堇碱对 β-catenin及 P-GSK-3β蛋白表达
的影响 见表 2。结果显示，与正常对照组比较，高
糖可以诱导心肌成纤维细胞 β-catenin 表达升高
(P ＜ 0． 05) ，下调 P-GSK-3β 蛋白的表达(P ＜ 0． 05)。
与模型对照组比较，100、50 mg /L脱氢紫堇碱可明显
抑制 β-catenin的表达(P ＜ 0． 01) ，100 mg /L 脱氢紫
堇碱可明显增加 P-GSK-3β 的表达上调(P ＜ 0． 05) ，
50 mg /L脱氢紫堇碱对 P-GSK-3β的表达无统计学意
义(P ＞ 0． 05) ;卡托普利可以抑制 β-catenin 的表达
(P ＜ 0． 05) ，对 P-GSK-3β 的作用差异无统计学意义
(P ＞ 0． 05)。
表 2 脱氢紫堇碱对 β-catenin、P-GSK-3β 蛋白表达的影
响(珋x ± s，n = 5)
组 别
浓度 /
(mg /L)
β-catenin 蛋白 /
(ＲOD)
P-GSK-3β蛋白 /
(ＲOD)
正常对照组 — 0． 312 ± 0． 063 0． 428 ± 0． 048
模型对照组 — 0． 482 ± 0． 052# 0． 265 ± 0． 074#
脱氢紫堇碱组 100 0． 140 ± 0． 015△△ 0． 467 ± 0． 043△
50 0． 224 ± 0． 025△△ 0． 243 ± 0． 121
卡托普利组 22 0． 253 ± 0． 014△△ 0． 473 ± 0． 151
注:与正常对照组比较# P ＜ 0． 05，与模型对照组比较△P ＜
0． 05，△△P ＜ 0． 01
4 讨论
糖尿病心肌病在持续高糖的始动因素［6］作用
下，导致外周血中血管紧张素Ⅱ增多［7］，心脏间质
Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解异常［8］，降低单核细胞趋化因子
的活化及表达［9］，在此过程中出现心肌细胞外基质
的大量沉积，这些可能与心肌纤维化有着非常密切的
关系。近些年，中医和中西医结合治疗该病的研究比
较深入，取得了很多有价值的成果［10-12］。
延胡索是活血化瘀药的代表药，味辛、苦，性温，
归心、肝、脾经，功效为活血、行气、止痛，临床多用于
气血瘀滞痛证，跌打损伤;且还有镇痛，镇静，催眠作
用。现代药理研究表明其主要作用于心血管系统，药
效物质为生物碱类成分，DHC 为主要有效成分。研
究［13］表明 DHC 具有减轻心肌缺血再灌注损伤，扩张
冠状动脉，降低耗氧量，抑制血小板聚集，改善微循环
等药理作用［14］。在前期实验的基础上，本实验采用
体外高糖诱导的心肌成纤维细胞模型，观察脱氢紫堇
碱对于心肌成纤维细胞 TGF-β1 蛋白表达及 Wnt 通
路的影响，来探讨脱氢紫堇碱防治糖尿病心肌纤维化
的作用机制。TGF-β1 是最重要的促进纤维化生长的
因子，具有多功能的细胞间信号转导功能，在细胞外
基质合成、识别、增殖、凋亡及特殊分化中发挥了重要
作用［15］。TGF-β1 能够促进心肌成纤维细胞合成纤
维蛋白及Ⅰ、Ⅲ型胶原等，增加了心肌组织细胞外基
质的合成，抑制了胶原降解，同时也是各种因素致心
肌纤维化的共同通路［16］。
Wnt /β-catenin信号通路是调控细胞生长和增殖
的重要途径，Wnt信号通路的异常激活可以导致纤维
增生等疾病的发生，在 Wnt 信号经典通路 Wnt /β-
catenin中，β-catenin处于中心位置，是一种多功能的
胞浆蛋白，参与细胞的黏附、迁移及上皮间质的转化、
生长、分化、凋亡等过程，从而在胚胎发育、内环境稳
定和器官形成等诸多方面起到重要作用［17］。而
GSK-3β等是负向调节因素，通过 GSK-3β 的磷酸化
及泛素蛋白酶体系统进而降解，使之游离在胞浆保持
较低浓度，无法转运到细胞核内产生生物学效应［18］，
GSK-3β通过抑制 Wnt 通路，调节细胞的增殖、分化
和凋亡［19］。β-catenin在细胞内的数量和状态对该途
径有决定性影响，因此被认为是该信号途径激活的标
志［20］。
本实验研究发现，该成分作用于高糖培养的心肌
成纤维细胞后，能够降低 TGF-β1 的分泌，表明脱氢
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紫堇碱不仅能够抑制心肌成纤维细胞的增殖，还可以
降低其合成与分泌蛋白的能力，进而能够抑制糖尿病
心肌纤维化。实验研究也表明，在分子水平上，高糖
可以上调 β-catenin 的表达，抑制 P-GSK-3β 的高表
达。说明高糖环境下，两条通路之间可能存在一定的
相互作用。实验结果显示脱氢紫堇碱可以抑制 β-
catenin的表达，上调 P-GSK-3β 的异常表达，说明该
成分能够阻断 Wnt /β-catenin 信号通路;同时该成分
可以抑制 TGF-β1 蛋白的表达水平，说明脱氢紫堇碱
可能同时能够抑制 TGF-β1 通路的转导。
综上所述，脱氢紫堇碱是一种具有潜在治疗糖尿
病心肌纤维化的有效成分，有关其深入的作用机制值
得进一步研究，为糖尿病心肌纤维化的防治提供指
导。
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(责任编辑:张瑞彬 收稿日期:2014 － 12 － 21)
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