全 文 ：绘制图谱关系图，清晰地表达出品种鉴别结果，更重要的是，该方
法能够实现任意两种或多种植物间的快速鉴别。该方法已经应
用于石榴［13］、葡萄干［14］、番茄［15］、银杏［16］等物种的鉴别。
基于此，本实验采用 ＲAPD 技术与 MCID 相结合的方法，建
立了竹节参及其近缘植物人参、西洋参、三七、狭叶竹节参、羽叶
三七、珠子参的快速鉴别体系。根据实验得到的 MCID，我们可
以选择相应的引物将竹节参与其近缘植物中一种或多种同时鉴
别区分开。该方法快速简单，为人参属近缘品种的初步鉴定提供
了一种有效可行的方法。
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收稿日期:2015-05-22; 修订日期:2015-10-22
基金项目:中国科学院“西部之光”人才项目;
云南省教育厅重点项目(No． 2013Z002);
云南省应用基础研究面上项目(No． 2014FZ077)
作者简介:刘小莉(1977-)，女(汉族)，山东烟台人，云南中医学院中药学
院副教授，博士学位，主要从事药用植物资源品质研究工作．
滇龙胆不同居群 rDNA － ITS序列分析
刘小莉，李国栋，王杏婷，郑梅梅
(云南中医学院中药学院，云南 昆明 650500)
摘要:目的 研究云南代表性产地 8 个滇龙胆居群的 rDNA ITS遗传差异，评价 ITS用于滇龙胆产地鉴别的可行性。方法
运用常规 PCＲ法扩增 rDNA ITS后直接测序。结果 得到 8 个居群 107 个样品 rDNA中的 ITS和 5． 8SrDNA全长序列。其
中，ITS2 在滇龙胆种内居群间和居群内变异最为丰富，但未找到能反映特定居群的稀有单倍型。结论 不同产地滇龙胆
rDNA － ITS变异较大，但 ITS在鉴别滇龙胆的产地上应用价值有限。
关键词:滇龙胆; 居群; rDNA ITS区; 碱基变异
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2016． 01． 039
中图分类号:S567 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2016)01-0104-03
滇龙胆 Gentiana rigescens Franch． ex Hemsl属于龙胆科(Gen-
tianaceae)龙胆属(Gentiana)植物，作为药材龙胆的基原植物之
一，被用于治疗多种肝胆疾病，药用历史悠久，需求很大［1，2］。云
南是滇龙胆的主要产区，但蕴藏量急剧下降，目前对滇龙胆的化
学评价、栽培技术、资源调查是研究重点［3 ～ 6］，未见对滇龙胆遗传
变异的研究。
核糖体内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)近年来
被广泛用于种间或种内居群间差异性、系统发育关系研究
等［7 ～ 9］，本研究拟对云南 8 个居群的滇龙胆进行 ITS 序列分析，
以期检测滇龙胆居群间 ITS的变异，探讨基于 ITS的滇龙胆的遗
传变异规律，并分析用于滇龙胆产地鉴别的可行性。
1 器材与试剂
1． 1 仪器 离心机 eppendorf centrifuge 5415 D(德国)、PCＲ仪 Bi-
ometra TGＲADIENT(德国)、电泳仪 Bio － ＲADPowerPacBasicTM
(美国)、凝胶显像系统 Bio － ＲAD(美国)等。
1． 2 试剂 新型快速植物基因组 DNA 提取试剂盒(百泰克)、
Takara Premix Taq、灭菌 ddH2O 等。引物 P1:5 ＇ CGTAACAAG-
GTTTCCGTAGGTGAA 3 ＇;P2:5 ＇ TTATTGATATGCTTAAACT-
CAGCGGG 3＇。
1． 3 供试材料 用于滇龙胆 Gentiana rigescens ITS 序列分析的 8
个居群 107 个个体来自云南省各地，如图 1、表 1 所示，各样品均
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以新鲜叶片作为材料，采集后立即用硅胶干燥。
2 方法
2． 1 DNA提取 用百泰克新型快速植物基因组 DNA 提取试剂
盒提取滇龙胆总 DNA，取 5μl用 0． 8%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA
质量，－ 20℃保存备用。
2． 2 PCＲ扩增 上游引物 P1 位于 18S上，下游引物 P2 位于 26S
上。P1:5 ＇ CGTAACAAG GTTTCCGTAGGTGAA 3 ＇;P2:5 ＇TTATT-
GATATGCTTAAACTCAGCGGG 3＇。由上海生工生物工程(上海)
有限公司合成。
反应体系(25μl):灭菌 ddH2O 8． 5μl，Mix 12． 5μl，引物 P1 和
P2 浓度为 10μmol /L，DNA模板 2μl(20 ～ 30ng);扩增程序:94℃
预变性 3min，94℃变性 30s，56℃退火 45s，72℃复性 1min，共 30
个循环后，72℃延伸 7min。反应产物于 － 20℃保存，取 5μl 用 1．
2%琼脂糖凝胶电泳检测。
2． 3 PCＲ产物测序 测序均交由上海生工生物工程(上海)有限
公司完成。为保证序列的准确性进行了双向测序。
2． 4 序列分析和系统树构建 通过序列拼接软件 Sequencher
4． 14对正反测序序列进行拼接，并手工校对错误碱基;以 Bioedit
5． 0． 6软件完成拼接后 DNA 序列比对、排序和剪切;用 DNAsp
4． 50软件分析单倍型分布、单倍型多样性、核苷酸多样性及变异
位点分布情况;使用分子软件 MEGA 5 分析碱基组成、碱基频率、
DNA序列变异位点和信息位点等。
图 1 滇龙胆样品采集地
表 1 滇龙胆样品采集地信息
编号 地点 按云南区域划分 经度 纬度
海拔
/m
SZ 师宗县彩云镇 滇东 24°5045″ 102°4929″ 1850
SM 嵩明县嵩阳镇 滇中 25°203″ 103°250″ 1910
AZY 昆明阿子营乡 滇中 25°1947″ 102°4651″ 2144
XP 新平磨盘山 滇中 24°0437″ 102°0546″ 1560
DL 大理喜洲 滇西 25°5059″ 100°0742″ 1980
LWS 玉溪澄江县梁王山 滇中 24°4753″ 103°5941″ 2050
MJ 墨江县文武乡 滇南 23°0016″ 101°3832″ 1872
PE 普洱市 滇西南 22°4826″ 100°5820″ 1805
3 结果
3． 1 PCＲ扩增结果 由 ITS1 和 ITS2 对 107 个滇龙胆样品 rDNA
ITS 区(包括部分 18S rDNA、ITS1、5． 8S rDNA、ITS2 和部分 26S
rDNA)进行 PCＲ 扩增出的条带均约 730 bp(图 2)，与预期片段大
小相符合。PCＲ产物回收后测序，获得 107 个样品的 ITS序列。
3． 2 序列测定结果 参照龙胆属 Gentiana 秦艽 Gentiana stra-
minea Maxim资料(来自 NCBI)确定核糖体 DNA 内转录间隔区
ITS1、ITS2 与 5． 8S的界限。
3． 3 ITS长度和碱基频率分析 所测滇龙胆各居群核糖体 ITS1、
5． 8S、ITS2 长度分别为 173 ～ 174、164、231 ～ 234 bp。统计分析表
明 ITS1 和 ITS2 中各碱基频率都存在显著差异，ITS1 中 T含量最
低，C含量最高，(G + C)含量分别为 61． 8% ～ 62． 6%，显著高于
其相应的(A + T)含量;ITS2 中 A含量最低，C含量最高，(G + C)
含量分别为 60． 0% ～ 60． 8%，也显著高于其相应的(A + T)含量。
5． 8S的(G + C)含量为 55． 4%，低于前两者。见表 2。
图 2 部分滇龙胆样品 ITS区扩增条带
3． 4 ITS碱基序列的差异分析 各类群间有 11 个变异位点，其中
信息位点 7 个。ITS1 区内有 1 个变异位点，且为信息位点。ITS2
区内有 10 个变异位点，包括 6 个信息位点。5． 8S 区域内非常保
守，没有变异位点。碱基变异类型有 G － A 转换(ITS1 区第 105
位、ITS2 区第 175 位)，C － T 转换(ITS2 区第 48、139、190、219
位);T － A 颠换(ITS2 区第 33、47 位)，C － G 颠换(ITS2 区第
108、229 位)，T － G颠换(ITS2 区第 64 位);插入(ITS1 区第 149
位、ITS2 区第 16、17、193 位)，无缺失变异。可见滇龙胆 ITS2 序
列能提供较为丰富的信息。见表 3、表 4。
3． 5 ITS2 单倍型分布、单倍型多样性、核苷酸多样性 滇龙胆每
个居群个体数在 8 － 21 个之间，ITS2 共有 14 种单倍型，每个居群
单倍型数在 1 － 5 之间，平均 1． 75 个。这 14 种单倍型分别是 H1
～ H14，单倍型 H2、H3、H4、H6 占绝对优势，单倍型 H3 的频率最
高，主要在 SZ、XP、DL、MJ、PE 五个居群中出现。而单倍型 H1、
H5、H7 ～ H14 的分布频率最低，仅有一个个体分布。H2 在 SZ和
PE居群中出现。H4 主要在 SM、LWS 居群中出现。H6 主要在
SM、AZY居群中分布。由此可见，AZY阿子营附近的滇龙胆以单
倍型 H6 为主，SM嵩明附近的滇龙胆以 H4 和 H6 为主，因阿子营
与嵩明距离较近，可以推测阿子营附近的滇龙胆以 H6 为主，可
与其他产地相区别;LWS 梁王山附近的滇龙胆以单倍型 H4 为
主，但无法同其他产地相区别。XP、、DL、MJ 三地样品均以单倍
型 H3 为主，但无法进行产地鉴别。SZ、PE 两地样品中均以 H2、
H3 为主，可以与其他产地相区分，但不能辨别为这两个产地中哪
一个。按云南的区域(滇中、滇东、滇西、滇南、滇西南)划分后也
未发现明显的差异单倍型。
滇龙胆的 ITS2 单倍型多样性(Hd)在 0． 000 ～ 0． 605 范围内，
核苷酸多样性在 0． 00000 ～ 0． 00305 范围内，SM 居群单倍型多样
性较高(Hd = 0． 605)，其余大多数居群的单倍型多样性也相对较
高，但是很多单倍型只有一个个体，因此不具有代表性。
4 讨论
由于 rDNA在不同物种间存在丰富变异，因此很多研究证实
适用于种间分类鉴定，尤其 ITS2 由于变异丰富，多用于中药材混
淆品、伪品的鉴别:如对牡丹皮药材及其混淆品的鉴别［10］，升麻
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及其混淆品的鉴别［11］，金沸花、旋覆花及其近缘混淆品的鉴
别［12］等。
表 2 滇龙胆不同居群 ITS1 和 ITS2 碱基含量 %
居群
ITS1
A T C G G + C
ITS2
A T C G G + C
SZ 28． 3 9． 8 31． 2 30． 6 61． 8 18． 0 21． 4 30． 4 30． 2 60． 6
SM 28． 1 9． 8 31． 2 30． 9 62． 1 18． 1 21． 4 30． 4 30． 1 60． 5
AZY 27． 7 9． 8 31． 1 31． 5 62． 6 18． 1 21． 9 29． 8 30． 2 60． 0
XP 28． 3 9． 8 31． 2 30． 6 61． 8 17． 7 21． 6 30． 6 30． 1 60． 8
DL 28． 3 9． 8 31． 2 30． 6 61． 8 17． 7 21． 6 30． 6 30． 2 60． 8
LWS 28． 3 9． 8 31． 2 30． 6 61． 8 18． 2 21． 0 30． 7 30． 2 60． 9
MJ 28． 3 9． 8 31． 2 30． 6 61． 8 17． 7 21． 7 30． 5 30． 1 60． 6
PE 28． 3 9． 8 31． 2 30． 6 61． 8 17． 9 21． 4 30． 5 30． 2 60． 7
表 3 滇龙胆 ITS2 序列差异分析
ITS2 序
列位置
16 17 33 47 48 64 108 139 175 190 193 219 229
全序列
位置
354 355 371 385 386 402 446 477 513 528 601 557 567
H1 － － A T C G G T A C － C G
H2 － － A T C G G T G C － C G
H3 C － T T C G G T G C － C G
H4 C － A T C G G T G C － C G
H5 C － T T T G G T G C － C G
H6 C － A T T G G T G C － T G
H7 C C A T C G G T G C － C G
H8 C － A T T G G T G C － C G
H9 C － A T C G C T G C － C G
H10 C － T T C G G T G C － C C
H11 C － T T C G G T G C T C G
H12 C － A A C G G C G C － C G
H13 C － T T C G G T G T － C G
H14 C － T T C T G T G T － C G
表 4 滇龙胆 8 个居群 ITS2 单倍型的遗传多样性、组成和频率
居
群
样
本
数
单倍型
数目
Number of
haplotype
H1 ～ H14
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
核苷酸多
样性指数
Nucleotide
Diversity
(Dij)
单倍型
多样性
SZ 21 5 1 10 8 1 1 0． 00305 0． 605
SM 19 5 11 5 1 1 1 0． 00418 0． 556
AZY 12 3 1 10 1 0． 00157 0． 182
XP 11 2 10 1 0． 00078 0． 182
DL 10 1 10 0． 00000 0． 000
LWS 16 3 1 14 1 0． 00201 0． 233
MJ 11 3 8 1 1 0． 00219 0． 345
PE 8 2 4 4 0． 00247 0． 571
近年来不少研究尝试将 ITS 区用于植物的种下水平如产地
的鉴别，结果表明 ITS在鉴别种内变异方面，其应用价值因种而
异。对几个产地何首乌的鉴别中发现，rDNA ITS 序列可以用于
不同产地何首乌的分子鉴定［13］。对野生铁皮石 rDNA ITS 序列
分析后发现，DNA 序列无法用于铁皮石斛来源产地的鉴别［14］，
对 F型(枫斗型)、H型(非枫斗型)居群的铁皮石斛 rDNA ITS区
序列差异研究分析，可用 rDNA ITS区序列差异区分 F型、H型石
斛居群间的差异［7］，但这两种居群的石斛可能属于不同种。对
不同地区半夏的鉴定也存在局限性［8］。
本研究采用的大样本共 107 个，对 8 个居群滇龙胆进行产地
鉴别，平均每个产地 13 个样品，对信息位点丰富的 ITS2 区序列
进行分析，以探讨利用 ITS 序列推测滇龙胆样品产地的可行性。
结果表明，ITS尤其是 ITS2 在滇龙胆种内居群间和居群内均存在
丰富的变异，但未找到能反映特定居群的稀有单倍型，在鉴别滇
龙胆的产地上应用价值有限，这可能是由于滇龙胆为广布种且居
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