全 文 ：［收稿日期］ 20121211(003)
［基金项目］ 广东省自然科学基金项目(S2012010009773)
［第一作者］ 严寒静，博士，副教授，长期从事中药资源与环境相关性研究，E-mail:yanhanjing1211@ 163. com
［通讯作者］ * 章卫民，博士，研究员，E-mail:wmzhang58@ yahoo． com． cn
·资源与鉴定·
鹰爪花茎和叶中内生真菌的组织化学定位与分子鉴定
严寒静1，高晓霞2，何梦玲1，王磊3，李浩华3，章卫民3*
( 1. 广东药学院中药学院，广州 510006; 2. 广东药学院药科学院，广州 510006;
3. 广东省微生物研究所，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，
广东省华南应用微生物重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，广州 510070)
［摘要］ 目的:研究鹰爪花 Artabotrys hexapetalus茎叶的显微结构及其内生真菌在组织内的分布特点及种类鉴定。方法:
采用石蜡永久制片法对鹰爪花的显微结构进行研究，细胞化学法确定内生真菌的分布，平板分离法对内生真菌分离培养，通
过 rDNA中内转录间隔区(ITS)序列进行分类鉴定。结果:鹰爪花茎次生构造由周皮、皮层和维管柱组成，韧皮部纤维成层分
布;叶为异面叶，主脉维管束为外韧型，具纤维组成的维管束鞘;茎和叶多个组织有内生菌分布。共分离鉴定 18 株内生真菌，
其中拟茎点霉 Phomopsis spp． 是鹰爪花内生真菌优势菌群，占分离总数的 61. 1%，其次为胶孢刺盘孢 Colletotrichum
gloeosporioides。结论:鹰爪花茎和叶显微特征明显，其内生真菌的分布无明显组织特异性，拟茎点霉为鹰爪花内生真菌的优势
种群。
［关键词］ 鹰爪花;内生真菌;组织化学;内转录间隔区;鉴定
［中图分类号］ Ｒ282 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)13-0157-05
［doi］ 10． 11653 /syfj2013130157
Histochemical Localization and Molecular Identification
of Endophytic Fungi in Stems and Leaves of Artabotrys hexapetalus
YAN Han-jing1，GAO Xiao-xia2，HE Meng-ling1，WANG Lei3，LI Hao-hua3，ZHANG Wei-min3*
(1. College of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China;
2. College of Pharmacy，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China;
3. State Key Laboratory of Applied Microbiology (Ministry-Guangdong Province Jointly Breeding Base) ，South
China，Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology，Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial
Culture Collection and Application，Guangdong Institute of Microbiology，Guangzhou 510070，China)
［Abstract］ Objective:To study the microstructure of stems and leaves of Artabotrys hexapetalus and
distribution characteristics of endophytic fungi in the tissues，and to isolate and identify these endophytic fungi from
the stem and the leaf of A． hexapetalus． Method:Permanent paraffin-cut section，optical microscope photography
and histochemistry were used to study the location of endophytic fungi． The solidified potato dextrose agar (PDA)
of plates was applied for the isolation of the endophytic fungi，and the identification was completed by the internal
transcribed spacer (ITS)sequence． Ｒesult:The secondary structure of the stems of A． hexapetalus consisted of the
periderm，cortex and vascular cylinder (stele)． Sieve and tubes phloem fibers，scattering in bundles，arranged at
intervals． The leaves of A． hexapetalus were of typically bifacial，consisted of epidermis，mesophyll and veins． The
midrib vascular bundle，collateral vascular bundle，was ring with vascular bundle sheath． Endophytic fungi existed
in the local cells of cortex，phloem，palisade tissue and spongy tissue． A total of 18 strains was isolated and
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identified，among them Phomopsis spp． accounted for 61. 1% in all strains of endophytic fungi． Conclusion:The
microscopic characteristics of A． hexapetaluss stem and leaf can be used as a reference for identification． The
endophytic fungi of A． hexapetalus were distributed with no obvious tissue specifity and P． spp． were determined as
dominant species．
［Key words］ Artabotrys hexapetalus;endophytic fungi;histochemistry;ITS;identification
鹰爪花为番荔枝科鹰爪花属植物［1］，又称鹰
爪，产于我国南方各省，既是药用植物，又是名贵芳
香的观赏植物，多为栽培。其根有杀虫作用，用于治
疗疟疾;果实有清热解毒作用，用于治疗颈部淋巴结
核［2］。1982 年 Jolad等［3］通过生物活性测试为跟踪
手段从美洲植物 Uvaria accuminata (番荔枝科紫玉
盘属)根部提取物中分离出一种抗癌活性很强的内
酯类化合物 Uvaricin，从而引起了科学界对番荔枝
科植物的关注。鹰爪花属植物多具生物活性，化学
成分主要有番荔枝内酯类、黄酮类［4-5］、生物碱［6-7］
等。这些化合物多具有抗肿瘤活性，特别是其中的
番荔枝内酯大多有不同程度的细胞毒、抗肿瘤、抗
疟、抗菌、杀虫、免疫抑制等多种生物活性，是目前报
道中体内外抗癌活性最强的化合物之一。
近年来，国内外已陆续报道了从多种植物中分
离获得了产生药理活性物质的内生真菌。美国科学
家 Strobel 等［8］首次从短叶红豆杉 Taxus brevifolia
Nutt． 的 韧 皮 部 中 分 离 到 了 菌 株 Taxomyces
andreanae，可在半合成培养液中产生紫杉醇和紫杉
烷类化合物，引发了人们对研究植物内生真菌代谢
产物的极大兴趣。有关鹰爪花属植物药用成分的提
取分离、抗氧化活性等方面已有研究报道，但未见到
有鹰爪花茎、叶的解剖构造的报道，尤其是对鹰爪花
属植物中内生真菌的分布尚未见报道。本文研究了
自然生长状态的鹰爪花的显微结构及其内生真菌的
分布，为今后研究鹰爪花植物的生长发育、内生真菌
分布规律以及次生代谢产物与内生真菌的关系提供
科学依据。
1 材料和方法
1. 1 植物来源 自然生长的鹰爪花取材于广东肇
庆市鼎湖山自然保护区，经广东药学院中药学院中
药资源系刘基柱副教授鉴定为番荔枝科植物鹰爪花
Artabotrys hexapetalus(L． f．)Bhandari的茎和叶。
1. 2 石蜡切片制作方法 将鹰爪花的茎和叶在流
水下冲洗干净，选取正常完整的，切成 2 ～ 3 mm 长
的小段迅速固定于 FAA 固定液中，常规石蜡法制
片，切片厚度为 16 ～ 20 μm。苯胺蓝染色，中性树胶
封片，在 Carl Zesis Axio imager． A1 显微镜下观察并
摄影。
1. 3 内生真菌的分离 将采集的样品在 0. 1%的
升汞溶液中浸泡 1 min，用无菌水冲洗，75%乙醇中
浸泡 1 min，无菌水冲洗。叶片剪去边缘，并剪成
0. 5 cm ×0. 5 cm的方块置于分离平板(含 100 mg·
L －1卡那霉素和 100 mg·L －1氨苄青霉素的综合 PDA
培养基)上;茎剪切为 1 cm左右长度，放入分离平板
后轻轻按压。26 ℃恒温培养，待长出菌丝后，挑取
平板中单一菌落的菌丝接种于新的平板，继续 26 ℃
恒温培养，经多次分离纯化获得单一菌株后，转接斜
面保存。
1. 4 总 DNA的提取 从平板或斜面上刮取少量菌
丝体移入已灭菌的 1. 5 mL 微型离心管中，采用植物
基因组小量提取试剂盒提取总 DNA(申能博彩) ，于
－ 20 ℃保存备用。
1. 5 目的基因片断的 PCＲ 扩增、产物纯化和测
序 利用真菌 rDNA内转录间隔区(rDNA ITS)通用
引物 ITS1 (5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，正
向)和 ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，反
向)［9］扩增分离菌株的 rDNA ITS 区，使用 Ex Taq
(TaKaＲa)按说明书进行 PCＲ反应，反应条件:93 ℃
预变性 3 min，然后 93 ℃变性 1 min，53 ℃复性
1 min，72 ℃延伸 1. 5 min，共 30 个循环，72 ℃延伸
10 min。反应产物利用 PCＲ 产物纯化试剂盒
(QIAGEN)纯化，采用 HaeⅢ及 Hha Ⅰ两种限制性
内切酶(TaKaＲa)对纯化的 PCＲ 产物进行酶切分
型。根据酶切分型结果挑选 PCＲ产物，由上海美吉
生物医药科技有限公司进行直接测序。
1. 6 序列分析 测序结果通过 Blast 程序在
GenBank上进行相似性序列检索，根据 Blast结果确
定分离真菌的种类。
2 结果
2. 1 鹰爪花茎的解剖特征 木栓层为数列扁平细
胞;皮层窄，为数列椭圆形细胞。中柱鞘部位具纤维
束，常横排成不连续的环，木化。维管束外韧型，韧
皮纤维束与韧皮薄壁细胞、筛管群呈切向交互排列;
初生射线喇叭形，有分泌细胞散在分布。形成层明
显。木质部宽广，导管类方形或多角形，多单个或
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2 ～ 3 个径向排列;具伴管纤维，木化;木射线为 1 ～ 2
列细胞。髓部薄壁细胞类圆形，较大。薄壁细胞含
淀粉粒、草酸钙方晶(图 1)。
A． × 50;B． × 400
图 1 鹰爪花茎横切面
2. 2 鹰爪花叶的解剖特征 上表皮细胞类长方形，
下表皮细胞较小;栅栏细胞 1 ～ 2 列，短柱状，不通过
主脉上方;海绵组织为 3 ～ 4 列类圆形细胞，排列疏
松。主脉于下表面明显凸出，主脉维管束 3 个，均
为外韧型，中央有 1 个大型的倒三角形维管束，两侧
各有 2 个近圆形的小型维管束。维管束鞘纤维多个
相聚成群且断续排列(图 2A)。
2. 3 鹰爪花茎、叶中内生真菌的分布和群落构成
依据苯胺蓝可将真菌的原生质体染成蓝色的特
性［10-11］，经过石蜡切片组织观察结果:从鹰爪花茎
的石蜡切片可以看到内生真菌斑点主要分布在木栓
层、皮层、韧皮部薄壁细胞和髓周细胞中(图 1) ，在
叶中主要分布于主脉上方的薄壁细胞、栅栏组织、海
棉组织和韧皮部(图 2)。
A． × 100;B． × 400;C． × 400
图 2 鹰爪花叶横切面
本文共分离获得 18 株内生真菌，经酶切分型共
获得 8 种 ＲFLP型，测序后获得 8 条不同的 rDNA序
列，Blast分析结果见表 1。所有分离菌株除 HB3
外，均具有 99%以上的序列相似率，分别属于 3 个
属(Diaporthe为 Phomopsis 的有性型属) ，其中 11 株
为拟茎点霉 Phomopsis spp．，占分离总数的 61. 1%，
是鹰爪花内生真菌优势菌群，其次为胶孢刺盘孢
(Colletotrichum gloeosporioides ) ，占 分 离 总 数
的 33. 3%。
表 1 鹰爪花内生真菌的分离及测序结果
菌株
ITS区长度
/bp
分离菌株
分离部位 分离数量
GenBank
Accession No．
最相近物种
种名 /菌株 /序列名称
GenBank
Accession No．
分值
相似度
/%
HB1 484 叶，顶芽 6 JQ417280 Colletotrichum gloeosporioides clone h6 HM016795 892 100. 0
HB3 480 叶 1 JQ417281 Diaporthe sp． MA104 HM012815 708 92. 3
HC1 497 茎、顶芽 4 JQ417282 Phomopsis sp． IP-51 DQ780430 893 99. 0
HC2 445 茎 1 JQ417283 Zopfiella latipes strain F-068，392 FJ175158 816 100. 0
HC3 497 茎 1 JQ417284 Phomopsis sp． A57 EF564153 877 99. 4
HC4 487 茎、顶芽 3 JQ417285 Diaporthe phaseolorum isolate ZJ4 EU196746 902 99. 4
HC6 501 茎 1 JQ417286 Phomopsis sp． ＲP257 JF44120 893 99. 8
HC7 498 茎 1 JQ417287 Phomopsis sp． 45GP /T GQ352480 893 100. 0
3 讨论
内生真菌在鹰爪花中的侵染区域主要分布在皮
层、韧皮部及髓部的薄壁细胞，菌丝不是在整个组织
中均匀分布，只是集中在某个区域的细胞中，这与以
往的研究报道相一致［12-13］。这种菌丝局域性侵染
是否存在一定的选择性还有待于进一步研究。
拟茎点霉(Phomopsis)及其有性型间座壳属
(Diaporthe)真菌的许多种是重要的植物病原菌，又
是很常见的热带地区植物内生真菌，但很少在温带
地区植物中分离到［14］。本试验从茎、叶、顶芽均能
分离到拟茎点霉，分离菌株占分离总株数的
61. 1%，是优势种群，但从整体来看无明显的组织特
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严寒静，等:鹰爪花茎和叶中内生真菌的组织化学定位与分子鉴定
异性。刺盘孢是普遍存在于植物中的植物病原菌，
为引起树木炭疽病的主要致病菌，其中胶孢刺盘孢
是刺盘孢属内最大的一个种，分布广泛，寄主种类繁
多，可引起多种树种的炭疽病，以木本植物为主［15］，
虽然是致病菌但胶孢刺盘孢也常以内生菌的形式寄
生于多种植物中，如泰国野生姜(Amomum siamense
Criab)、棕 榈 (Trachycarpus fortunei)、蒙 古 蒿
(Artemisia mongolica)和红豆杉(Taxus mairei)等植
物［16-19］。内生真菌的定殖会随着季节的变化在宿
主植物生长的同时，植物内生真菌群落构成以及在
植物宿主内的丰度和分布都可能发生改变，如拟茎
点霉和小丛壳(Glomerella)均为在生长季节寄生在
活体植物上的真菌物种［20］。
植物内生真菌是筛选新的生物活性物质的重要
来源。Dicerandrols 在濒危薄荷类植物 Dicerandra
frutescens内生真菌 Phomopsis longicolla 中分离到的
具有临床应用前景的新抗生素［21］。来自柚木
Tectonag randis L．内生真菌的 P． sp． gC1323，其提
取物中分离到具有抗疟、抗结核和细胞毒活性的
phomoxanthones A 和 B［22］。Silva 等从美丽决明
Cassia spectabilis 1 株内生真菌 Phomopsis cassiae 中
分离获得了 5 个杜松烷倍半萜次生代谢产物，其中
3，11，12-t6hydroxycadMene 对 球 孢 枝 孢 菌
(Cladosporium sphaerospermum)和枝状枝孢霉(C．
cladosporioides)抑菌活性最强［23］。周凤等从黄芪
Astragalus membranaceus 的内生真菌 Aspergillus sp．
中分 离 得 到 具 有 抗 菌 活 性 的 代 谢 产 物
cyclotryprostatins B［24］。Lu 等从黄花蒿 Artemisia
annua内生真菌 Colletotrichum sp． 中分离得到了一
种具有抗菌活性的新的吲哚类生物碱6-iso-prenylin-
dole-3-carboxylic acid［25］。
内生真菌长期生活在植物体内的特殊环境中，
与宿主协同进化，在演化过程中二者形成了互惠共
生关系［26-27］。因此，内生真菌能产生很多种类结构
复杂的次级代谢产物，这些代谢产物有些与宿主的
某些代谢产物相同或相似。鹰爪花属内生真菌资源
迄今尚未被研究和开发，因此今后有必要对其内生
真菌的活性代谢产物作进一步研究。
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［责任编辑 邹晓翠］
［收稿日期］ 20121213(023)
［基金项目］ 宁夏自然科学基金项目(NZ10225)
［通讯作者］ * 安瑜，Tel:0954-2039052，E-mail:ay9363@126. com
宁夏六盘山栽培黄芩适宜采收期研究
安瑜1* ，王旭鹏1，赵建军2
( 1. 固原市药品检验所，宁夏 固原 756000; 2. 宁夏师范学院，宁夏 固原 756000)
［摘要］ 目的:确定宁夏六盘山栽培黄芩的适宜采收期。方法:通过 HPLC比较测定不同生长期采集的不同株龄的栽培
黄芩中黄芩苷的含量，同时比较醇溶性浸出物的含量。结果:栽培黄芩中黄芩苷的含量 10 月份最高，醇溶性浸出物的含量在
7 ～ 9 月份增长较快、在 10 月份达最高，3 年生黄芩根重(10 月份)较 2 年生重。结论:综合分析栽培黄芩中黄芩苷的含量、醇
溶性浸出物的含量及其生物量，栽培黄芩适宜的采收期为第 3 年的 10 月份。
［关键词］ 宁夏六盘山栽培黄芩;适宜采收期;黄芩苷;高效液相色谱
［中图分类号］ Ｒ282． 2 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)13-0161-04
［doi］ 10． 11653 /syfj2013130161
Suitable Harvest Time of Cultivating
Scutellerir baicalensis in Ningxia Liupan Mountain
AN Yu1* ，WANG Xu-peng2，ZHAO Jian-jun1
(1. Guyuan Institute of Drug Control，Guyuan 756000，China;
2. Ningxia Teachers University，Guyuan 756000，China)
·161·
第 19 卷第 13 期
2013 年 7 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 13
Jul．，2013