全 文 ：文章编号:1001-4829(2009)06-1634-04
　　收稿日期:2009-05-13
　　基金项目:云南省发改委 “产业重大关键技术开发专项 ” 2007
(1718);云南省攻关“云南重点产业创新工程项目”(2008IF024)
作者简介:赵振玲(1960-),女 ,河北省保定人 ,副研究员 , 主要
从事植物病理及植物组织培养工作 , E-mail:lqlzhaozl@ 163.
com, ＊为通讯作者 , E-mail:jihang1516@sina.com。
云南栽培滇龙胆炭疽病病原鉴定
赵振玲 ,金　航＊ ,张金渝 ,张智慧 ,杨美权 ,杨维泽
(云南省农业科学院药用植物研究所 ,云南 昆明　650231)
摘　要:对栽培滇龙胆炭疽病的病害症状 、病菌形态 、病菌培养性状 、致病性等进行研究。结果表明 ,不同症状的 2种滇龙胆炭疽
病分别由胶孢炭疽菌 [ Coletotrichumgloeosporioides(Penz.)Sacc.] 的 2个种(分化型)侵染所致 , 2种胶孢炭疽菌的菌落形态 、分生
孢子及附着孢形状等方面有差异 ,且有性阶段的子囊 、子囊孢子也有一定差异。病菌有性阶段为小丛壳菌属(GlomerelaSpaulding
etSchrenk)。
关键词:滇龙胆;炭疽病;胶孢炭疽菌;小丛壳菌
中图分类号:S435.672　　　文献标识码:A
IdentificationforPathogenofAnthracnoseofCultivated
GentianarigescensFranch.inYunnan
ZHAOZhen-ling, JINHang＊ , ZHANGJin-yu, ZHANGZhi-hui, YANGMei-quan, YANGWei-ze
(MedicinalPlantInstitute, YunnanAcademyofAgriculturalSciences, YunnanKunming650231, China)
Abstract:Thesymptoms, morphology, culturecharacteristicsandpathogenicitywerestudied.Theresultsindicatedthattwodiferentsymptoms
ofanthracnoseofGentianarigescensFranch.werecausedseparatelybytwokindofColetotrichumgloeosporioides.Thecolonymorphology,
conidiumandappressorium, theascusandascosporeofsexualstagesof2kindsofthepathogenshowedsomediference.Thesexualgenera-
tionofthepathogenwasGlomerelaSpauldingetSchrenk.
Keywords:GentianarigescensFranch.;Anthracnose;Coletotrichumgloeosporioide;Glomerela
　　滇龙胆 (GentianarigescensFranch.)为龙胆科
(Gentianaceae)龙胆属(Gentiana)多年生宿根性草
本植物 ,别名南龙胆 、蓝花根 、小兰花 、龙胆草 、雪山
苦草等 , 《中华人民共和国药典 》2005年版 [ 1]以坚龙
胆名收录 ,是云南道地药材 。滇龙胆以根 、根茎入
药 ,味苦 ,性寒 ,归肝 、胆经 ,有清热燥湿 ,泻肝胆实火
的作用。主治高血压 、头晕耳鸣 、胆囊炎 、急性传染
性肝炎 、阴部湿痒 、湿热黄疸 、疮疖痈肿 、口苦和惊风
等症 ,为保肝利胆之良药。
滇龙胆为云南彝药主要品种 ,又是众多云药企
业生产苦胆草片 、龙胆泻肝片 、熊胆丸等的重要原
料 ,年需求量很大 ,采挖野生资源不能满足市场需
求 ,近些年 ,人工栽培的滇龙胆已在云南的部分县 、
市形成规模化 ,并成为当地农民增收致富的新型产
业。随着种植面积的增加 ,滇龙胆的病害发生及受
害程度也在增大 ,其中炭疽病即是发生面积广 、危害
大 ,并在国内外文献中无记载的 1种新病害 ,其病
原 、发生规律 、防治方法等尚不清楚。为弄清该病病
原 ,课题组在滇龙胆种植基地采集病害标本 ,进行病
原菌分离鉴定 ,通过病菌形态 、培养性状等的研究 ,
期望能为生产上防病避病提供科学依据 。
1　材料与方法
1.1　病害标本采集及症状观察
田间对自然发病植株的叶 、茎上症状进行观察 、
记载 、拍照 。病害标本采自临沧市云县茶房乡甸头
山村松子树丫口和箐门口村沙坝地及昆明云南省农
业科学院药用植物研究所资源圃 。采集的标本于室
温下置平皿中保湿培养 2 ～ 3d,直接镜检病组织 ,观
1634
西　南　农　业　学　报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences　　　　　　　　　　　　　　
2009年 22卷 6期
Vol.22　　No.6
DOI :10.16213/j.cnki.scjas.2009.06.013
察分生孢子盘 、分生孢子等的形状 ,初步归类以确定
用于病菌分离的标本类型 。
1.2　病菌分离纯化
按常规组织分离法将病叶病健交界处剪成 0.5
～ 1cm2大小的方片 ,用 75%乙醇浸泡 10s,后泡于
0.1%HgCl2液中 10 min,无菌水冲洗 5次 ,无菌滤
纸吸干 ,接于 PDA培养基平板上 , 26 ℃、黑暗下培
养 。首次分离后会产生许多杂菌菌落 ,根据文献资
料对炭疽病菌菌落的描述 ,取疑似菌落边缘菌丝体
进行多次纯化 ,病菌老熟产孢后 ,先镜检 ,后用解剖
针蘸取炭疽菌孢子团于另一 PDA平皿中培养 ,多次
重复直至获得纯菌种保存待用 。
1.3　病菌培养性状 、形态观察
解剖针挑取纯化的病菌孢子团接种于 PDA培
养基平皿中央 , 20, 22, 24, 26, 28 ℃恒温 、黑暗下培
养 2 d后开始观察病菌菌丝生长 、菌落形态 、大小 ,
颜色等;用 OlympusCX31显微镜观察分生孢子 、分
生孢子梗 、分生孢子盘形态及刚毛有无 ,测量其大
小 ,并拍照鉴定病菌;在灭菌凹玻片中滴入加 1%蔗
糖的孢子悬液 ,盖上盖玻片移入平皿湿室内在上述
温度下培养 , 24 h后镜检观察孢子萌发情况及附着
孢子的大小 、形状。病菌分类地位参照魏景超的
《真菌鉴定手册 》[ 2] 及张中义的 《植物病原真菌
学 》[ 3]对炭疽病属的分类描述 ,属内某些性状参数
参照文献[ 4 ～ 6]来确定病菌属内的归种。
1.4　病菌回接测定致病性
挑取纯化病菌的胶状孢子团 ,用灭菌水稀释成
10倍物镜每视野下约 100个分生孢子的病菌悬浮
液待用 ,对照接种液为灭菌水 。用离体幼苗法接种
病菌孢子悬液 ,取无菌播种的植株上段幼苗 ,用灭菌
注射器针头在叶片上扎几个孔 ,置病菌悬液中浸泡
5 ～ 10 min接种 ,后移入灭菌滤纸 、短玻棒制成的湿
室玻瓶中于室温或 26 ℃恒温 、黑暗下培养 ,发病后
描述症状并再分离病原做柯赫氏验证 。
a:ThesymptomsⅠ ;b:ThesymptomsⅡ
图 1　滇龙胆炭疽病症状
Fig.1　ThesymptomsoftheanthracnoseofGentianarigescensFranch.
2　结果与分析
2.1　滇龙胆炭疽病症状
2.1.1　症状Ⅰ 　植株叶 、茎可受害 ,叶上病斑圆形 、
半圆形 、椭圆形或不规则形。病斑上有轮纹 ,稍凹
陷 ,浅褐色 ,病斑边缘褐色 。多数叶片在病 、健部交
界的健部会形成紫红色带 。后期病斑上正 、反面产
生黑点状子实体 ,叶上多个病斑连接 ,使整叶枯黄死
亡。老熟茎上病斑长梭形 ,中部深褐至紫红色 ,后期
下陷成溃疡状(图 1a)。
2.1.2　症状Ⅱ　叶片感病 ,病斑圆形 、半圆形 、椭圆
形或不规则形 ,病斑凹陷 ,呈暗绿色水渍状 ,有轮纹 ,
病斑边缘墨绿色 ,有的中部灰白色 ,整个病斑发硬。
后期多个病斑连结成片 ,最后整叶呈暗绿色或暗褐
色干枯 。茎上病斑梭形 ,凹陷 ,暗褐色或暗绿色 ,病
斑边缘褐色(图 1b)。
2.2　病原菌形态
从滇龙胆 2种炭疽病病害症状叶片各自分离出
1株炭疽病菌株 ,两菌株鉴定结果符合文献[ 2 ～ 4]对
胶孢炭疽菌的分类标准描述 ,因此认为这 2病菌均
为半知菌类 、黑盘孢目 、炭疽菌属胶孢炭疽菌 [ Cole-
totrichumgloeosporioides(Penz.)Sacc.] 。在症状 Ⅰ
病害标本上直接观察到病菌的有性阶段 , PDA培养
基上菌株 B在 28 ℃下 ,能够培养出病菌的有性阶
段 ,与文献[ 2 ～ 3]相对照 , 2菌株有性阶段应为子囊菌
类球壳目的小丛壳菌属 (GlomerelaSpauldinget
Schrenk)。
a:TheascocarpandascusofApathogen;b:TheascosporeofApatho-
gen;c:TheascocarpandascusofBpathogen;d:TheascosporeofB
pathogen
图 2　滇龙胆炭疽病菌的有性阶段
Fig.2　Thesexualstageofthepathogenforanthracnoseofcultivated
GentianarigescensFranch.
16356期 　　　　　　赵振玲等:云南栽培滇龙胆炭疽病病原鉴定
2.2.1　菌株 A　病菌有性阶段:2008年 12月下旬
云县采集的第 1类病害症状标本经直接镜检 ,能看
到组织内病菌的有性阶段 。子囊壳生于叶组织表皮
下 ,丛集 ,黑褐色 ,无喙 ,球形至烧瓶形 ,大小(130 ～
290)μm×(30 ～ 250)μm。子囊梭形 ,两端尖 ,内
有 8个子囊孢子 ,子囊壁会消融 ,大小(50 ～ 75)μm
×(6.5 ～ 11.5)μm。子囊孢子无色 ,单细胞 ,长椭
圆形 ,大小(11 ～ 29)μm×(3.7 ～ 6.5)μm(图 2)。
26 ℃下 , PDA培养基平板上培养初期 ,菌落圆
形 ,菌丝向外生长一致 ,不发达 ,绒状 ,白色 ,后变为
灰白色 ,边缘整齐 。培养 4 d,有几条黑色菌丝带从
培养皿中心向外呈放射状生长 ,其它菌丝呈花瓣形
向外生长 ,使菌落出现辐射状扇面 ,扇面灰白镶嵌有
黑褐色至黑色菌落 ,并有轮纹 ,菌落边缘成花瓣状 ,
菌落上有分生孢子产生。培养 5 d,菌落直径 25 ～
30 mm,随着培养天数的增加 ,菌落上黑色菌丝带宽
度不断增加 , 6 d后扇面菌落鼠灰色 。背面黑褐色 。
培养 7 d,扇面边缘至中心的距离为 30 ～ 33 mm,菌
落边缘灰白色 ,培养 20 d后 ,扇面或菌落中部产生
灰褐色孢子团。 30 d后部分孢子团变成粉红或土
红色 ,还有部分孢子团变成灰白色 ,菌落变成褐色或
黑褐色 。病菌培养中偶有少量黑点状大小的小菌核
出现。
PDA基平板上分生孢子盘椭圆形或垫状散生 ,
黑褐色至黑色 ,椭圆形分生孢子盘大小为 100 ～ 280
μm×90 ～ 200μm。无刚毛 ,分生孢子梗少 。分生孢
子单细胞 ,无色 ,圆柱 、椭圆形 ,偶有三角形 ,一端或
两端钝圆 ,内有 1 ～ 2个油滴(球),老熟分生孢子内
油滴变为颗粒状质体 ,分生孢子大小为 3 ～ 12 μm×
2 ～ 3.8μm。分生孢子萌发时孢子一端膨大成圆形
或卵圆形附着胞 ,附着胞褐色 ,壁稍厚 ,大小为 3 ～ 7
μm(图 3)。
2.2.2　菌株 B　病菌有性阶段:28 ℃下 PDA培养
基平板上培养桔黄色孢子团 3 d,菌落白色 ,有同心
轮纹;12 d后菌落变成深灰色 ,其上出现聚集成球
状的病菌子囊壳 ,高出菌落平面 ,黑色 ,平皿背面为
大小不等的圆形黑斑 ,也是病菌子囊壳 。子囊壳喷
出子囊后 24 h子囊壁即消融散出子囊孢子 ,视野下
只能偶见完整的单个子囊 ,其余全是子囊孢子。子
囊壳扁球形 ,深褐色 ,大小 100 ～ 310 μm×100 ～ 200
μm。子囊棍棒形 ,大小 42.5 ～ 65 μm×9.5 ～ 12.5
μm。子囊孢子无色 ,单细胞 ,长圆或椭圆形 , 微弯
曲 ,大小 10 ～ 27.5 μm×7 ～ 7.5 μm(图 2)。
24 ℃下 , PDA培养基平板上菌落圆形 ,边缘整
齐 ,菌丝发达 ,绒状 ,紧密。培养初期 ,菌丝白色 ,培
养 3d即有分生孢子产生。 5d后菌落变成灰白色 ,
形成灰白色与白色相间的同心轮纹 ,菌落上出现少量
桔黄色胶性分生孢子团。 7d后菌落变成灰褐色。
PDA培养基平板上分生孢子盘垫状 , 偶有盘
状 ,黑褐色 ,刚毛偶见 ,分生孢子梗短 、少 ,梗长 30 ～
50 μm。分生孢子单细胞 ,圆柱形 ,两端钝圆 ,无色 ,
孢内有 2 ～ 3个油滴 ,老熟后油滴变成颗粒状质体 ,
大小 15 ～ 22.5 μm×5 ～ 7.5 μm。分生孢子萌发时
产生 1 ～ 4个横隔膜 ,萌发后产生附着胞 ,附着胞褐
色 ,边缘整齐 、壁厚 ,为卵圆 、椭圆 、三角形 、瓣形 ,偶
有方形 ,大小 5 ～ 10μm×5 ～ 8 μm(图 3)。
a、b、c:菌株 A的菌落 、分生孢子 、附着胞;d、e、f:菌株 B的菌落 、分生孢子 、附着胞
a, b, c:ThecolonyandconidiumandappressoriumofApathogen;d, e, f:ThecolonyandconidiumandappressoriumofBpathogen
图 3　滇龙胆上 2种胶孢炭疽菌形态
Fig.3　ThemorphologicalcharacteroftwokindsofColetotrichumgloeosporioidesofGentianarigescensFranch.
1636 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　22卷
a:ThesymptomsafterinoculationbyApathogen
b:ThesymptomsafterinoculationbyBpathogen
图 4　滇龙胆离体幼苗接种滇龙胆炭疽病菌后发病症状
Fig.4　Thesymptomsafterinoculationbythepathogenoftheanthrac-
noseofGentianarigescensFranch.
2.3　致病性
用胶孢炭疽菌的 2种分化型菌种接种滇龙胆离
体幼苗均能让其发病 ,出现与田间采回样本相同的
典型症状(图 4)。菌株 A接种 3 d后 ,叶中部或叶
缘上开始出现失绿 、发黄区域;7 d出现圆形或不规
则形水渍状失绿斑 ,后逐渐变黄 ,成淡褐色斑;15 d
后具明显的第 1类症状 ,病斑有轮纹 ,病部稍凹陷 ,
后期病斑上出现小黑点。菌株 B接种 7 d后 ,叶上
出现水渍状区域 ,不失绿;10 d后暗绿色病斑基本
成形;15d后第 2类症状明显。取发病组织再分离 ,
得到与原接种物相同的致病菌 ,就此完成柯赫氏验
证 。
3　讨　论
本文首次报道了栽培滇龙胆 2种症状的炭疽
病 ,其病害分别由胶孢炭疽菌的 2种分化型菌种引
起 ,滇龙胆是中国 Coletotrichumgloeosporioides的新
记录寄主。 2种胶孢炭疽菌菌株引起滇龙胆炭疽病
的症状各不相同 ,且 2菌株间菌落形态 、有性和无性
阶段病菌形状 、大小都有差别 ,但都在胶孢炭疽菌种
的范围内 ,说明胶孢炭疽菌种内确实存在专化型或
类群 ,符合前人研究 [ 7 ～ 9]的结果 。胶孢炭疽菌种内
分化型过去主要以寄主种类作为化分依据 ,后来也
有用病菌形态来化分的 ,但一直没有统一的类群划
分依据 。徐红梅等 [ 4, 9]的研究结果表明 ,胶孢炭疽
菌菌株分化与菌株的寄主种类和地理来源没有明显
相关性 ,因此菌株的形态学特征不适合对胶孢炭疽
菌进行种以下的类群划分 ,胶孢炭疽菌的分生孢子 、
附着胞形态 、培养特性等不能作为种以下专化型划
分的依据 ,用分子生物学方法更准确 ,而用寄主种类
作为化分依据也有待进一步研究 。
胶孢炭疽菌是炭疽菌属内最大的 1个集合种 ,
其种类繁多 ,分布广 。这类病菌能在很广泛的温度 、
pH范围内生长并危害多种植物 ,病菌主要以分生孢
子盘 、子囊壳 、菌丝 、分生孢子在土壤 、病残枝上越
冬 ,以分生孢子完成初侵染和再侵染 ,针对病菌的防
治很困难 。滇龙胆与其它中药材一样 ,是多年生植
物 ,留地时间长 ,连作与重茬不可避免 ,即使轮作 1
次至少也需 3年时间 ,较为有效的轮作等农业措施
难以实施 ,容易造成病原累积 ,病原基数年年上升 ,
初侵染源增加 ,势必增大植株受侵染的几率。本文
仅进行了病原鉴定 ,初步弄清了该病病原菌种类 ,要
有效进行防治 ,还需从病原基本生物学及生态学特
性入手 ,结合气候 、耕作等因子进行研究 ,明确病害
侵染 、发生及流行规律;来制定包括农事 、化学等生
态调控的技术措施 。
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(责任编辑　谢晓慧)
16376期 　　　　　　赵振玲等:云南栽培滇龙胆炭疽病病原鉴定