全 文 :第39卷第5期
2016年9月
河 北 农 业 大 学 学 报
JOURNAL OF AGRICULTURAL UNIVERSITY OF HEBEI
Vol.39No.5
Sep.2 0 1 6
文章编号:1000-1573(2016)05-0026-04 DOI:10.13320/j.cnki.jauh.2016.0103
小叶九里香枝干抑菌活性成分的研究
马浩伟,程晓莉,董存柱,车文轩,杨铁松,韩德建
(海南大学 环境与植物保护学院,海南 海口 570228)
摘要:为了获得小叶九里香枝干中抑制炭疽病菌的活性成分,在活性追踪指导下,利用硅胶柱色谱、Sephadex
LH-20凝胶柱色谱及半制备液相色谱等方法对小叶九里香枝干进行了研究。经追踪分离鉴定到1个活性化合
物XY-01,利用质谱、核磁共振谱鉴定化合物为九里香甲碱(Koenidine),该化合物可有效抑制香蕉炭疽病菌和
芒果炭疽病菌的生长,EC50值分别为34.28和45.88μg/mL,表明九里香甲碱抑菌活性较好、结构简单,具有开
发为新型植物源杀菌剂的潜在价值,九里香甲碱系首次从小叶九里香中分离得到。
关 键 词:小叶九里香;抑菌活性;香蕉炭疽病菌;芒果炭疽病菌;结构分析
中图分类号:R284.1 文献标志码:A
收稿日期:2016-06-20
基金项目:国家自然科学基金项目(31360447);2015年度海南省研究生创新科研课题(Hys2015-14).
作者简介:马浩伟(1990-),男,河南省开封人,在读硕士生,研究方向为天然源农药.
通讯作者:董存柱(1978-),男,博士,副教授,主要从事天然产物研究.E-mail:czd@hainu.edu.cn
The study on fungicidal activity of Murraya microphylla branches
MA Hao-wei,CHENG Xiao-li,DONG Cun-zhu,CHE Wen-xuan,YANG Tie-song,HAN De-jian
(Colege of Environment and Plant Protection,Hainan University,Haikou 570228,China)
Abstract:In order to obtain the active components from Murraya microphylla branches that
inhibit anthracnose pathogen,the methods of silica gel column chromatography,gel filtration
over Sephadex LH-20and semi-preparative liquid chromatography were used to study Mur-
raya microphylla branches under the guidance of activity tracking.One active compound was
isolated named XY-01.It was identified as Koenidine based on MS and NMR data and can ef-
fectively inhibit the growth of Colletotrichum musae(Berk&Curt)Arx and C.gloeosporioides
Penz.EC50values were 34.28and 45.88μg/mL respectively.The results showed that Koeni-
dine had good antifungal activity and simple structure,which demonstrated its potential of de-
veloping as the new botanical fungicide.Koenidine was isolated from Murraya microphyllafor
the first time.
Keywords:Murraya microphylla;antifungal activity;Colletotrichum musae;Colletotrichum
gloeosporioides;structure analysis
植物是生物活性化合物的天然宝库,植物源杀
菌剂由于具有低毒、选择性高、易降解等独特优势引
起了众多学者的重视,成为当今生物杀菌剂研究领
域的一个热点,而植物源杀菌剂研究的主流在于探
索杀菌剂活性的先导化合物[1]。小叶九里香(Mur-
raya microphylla)是芸香科(Rutaceae)九里香属植
物,是一种无刺灌木或小乔木,分布于海南、广东、广
西、云南等省区[2]。九里香属植物化学成分复杂,含
第5期 马浩伟等:小叶九里香枝干抑菌活性成分的研究
有黄酮、生物碱、香豆素、挥发油和甾体等多种化合
物,部分化合物具有良好的生物药理活性[3]。国内
外学者对九里香属中的九里香化学成分及生物活性
研究较多[4-7],邹联新等[8-9]研究了小叶九里香叶的
挥发油成分和咔唑类生物碱成分;冯小飞主要研究
了小叶九里香香豆素类化合物[3]。
目前小叶九里香生物活性方面的研究主要集中
在精油活性方面,有学者研究发现,小叶九里香精油
对烟草甲成虫有较好的触杀活性,对小麦赤霉病菌
等有较好的抑制作用[10-11]。课题组前期研究发现,
小叶九里香枝干甲醇提取物具有明显的抑菌活性,
本试验通过生物活性追踪法对其抑菌有效成分进行
分离研究,以期分离纯化得到抑菌的先导化合物,为
开发新型植物源杀菌剂提供理论基础和科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料 小叶九里香(Murraya micro-
phylla)枝干于2015年10月采自海南省儋州市峨
蔓镇,由中国热带农业科学院热带作物品种资源研
究所王清隆鉴定。
1.1.2 供试病原菌 供试病原菌为香蕉炭疽病菌
(Colletotrichum musae(Berk&Curt)Arx)和芒果炭
疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz.),由
海南大学环境与植物保护学院化保实验室提供。
1.1.3 供试仪器与试剂 日本 EYELA 公司 N-
1100旋转蒸发仪,A-1000S水流抽气机CA-1111冷
却水循环装置,Bruker DRX-400型核磁共振波谱
仪,EPCLC AI-580S(日 本 YAMAZEN 公 司),
FED400烘箱(德国BINDER),ME104型电子天平
(瑞士 METTLER TOLEDO公司),柱色谱硅胶及
GF254硅胶薄层板(青岛海洋化工厂),所用试剂石
油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇等均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 小叶九里香枝干粗提物的提取及萃取 将
采回的枝干5kg剪成小段,置于烘箱中烘干(50
℃,24h),粉碎机粉碎成粉末(3.2kg)。以甲醇冷
浸3次,每次3d,浸出液减压浓缩得到浸膏(186
g),所得浸膏用1L蒸馏水稀释,依次用石油醚、氯
仿、乙酸乙酯各500mL萃取,每种试剂萃取3次,
减压浓缩萃取液得到相对应浸膏。
1.2.2 菌丝生长速率法进行活性追踪 用0.1mL
丙酮将待测样品溶解,加无菌水稀释至预定浓度,取
2mL与灭菌的定量PDA培养基混合后,倒入直径
为6cm 培养皿内制成带毒培养基,各浓度重复3
次,以同样量的丙酮为对照。用直径5mm的打孔
器在培养好的供试病原真菌菌落边缘切下菌饼反接
于培养基内,25℃培养3~4d,用十字交叉法测量
菌落扩展直径,求出菌丝生长抑制率[12]。
抑菌率 (%)=
对照菌落直径-处理菌落直径
对照菌落直径-5mm
×100
生物测定浓度:萃取相浓度2.5mg/mL,一级
组分浓度1mg/mL,二级组分浓度0.5mg/mL;活
性化合物浓度为200,100,50,25,12.5μg/mL。
1.2.3 小叶九里香中抑菌成分的分离 石油醚萃
取相(50.68g)经半制备液相色谱分离,以石油醚-
乙酸乙酯(100∶0~0∶100)梯度洗脱,收集并浓缩洗
脱液,经薄层检测指导合并,得到组分 A1~A12。
A5组分经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离(氯仿-
甲醇1∶1洗脱)得到组分A5-1~A5-4,组分A5-3经
硅胶柱色谱分离,以石油醚-乙酸乙酯(100∶0~0∶
100)梯度洗脱,在石油醚-乙酸乙酯(1∶5)的洗脱液
中得活性化合物XY-01(29.6mg)。
1.2.4 数据处理 试验数据采用DPS9.5版统计
分析软件分析[13]。
2 结果与分析
2.1 抑菌活性成分的分离
以香蕉炭疽菌和芒果炭疽菌作为抑菌活性追踪指
示菌,采用菌丝生长速率法,追踪抑菌成分的分离,结
果见表1~3。表1中各萃取相的浓度为2.5mg/mL,
由表1可知,石油醚相对香蕉炭疽和芒果炭疽病菌抑
菌活性与另外三相差异显著,效果较好,抑菌率分别为
75.11%和60.65%,另外三相也有一定抑菌活性。对
石油醚相进一步做抑菌活性成分追踪分离。
表1 不同萃取相的抑菌活性
Table 1 Antifungal activity of different extract phases
萃取相
Extract phase
抑制率/%Inhibition rate
香蕉炭疽菌
C.musae
芒果炭疽菌
C.gloeosporioides
石油醚 75.11±2.99a 60.65±5.79a
氯仿 55.88±1.73b 42.13±4.01b
乙酸乙酯 63.05±2.29b 45.22±3.68b
水 60.41±3.64b 36.73±1.68b
注:同列数据后不同字母表示差异达5%显著水平,下同。
72
河 北 农 业 大 学 学 报 第39卷
石油醚相分离得到的馏分经硅胶板验证合并为
12(A1-A12)个馏分,经进一步抑菌活性测定,测定
组分浓度为1mg/mL。由表2可知A5组分对香蕉
炭疽菌和芒果炭疽菌的抑菌率与其它合并馏分差异
显著,且抑菌活性最高,抑菌率分别为75.58%,
74.83%,对其进一步做抑菌活性成分分离。
表2 一级柱层析分离各组分的抑菌活性
Table 2 Antifungal activity of components of the first separation
组分
Components
抑制率/%Inhibition rate
香蕉炭疽菌
C.musae
芒果炭疽菌
C.gloeosporioides
A1 25.58±2.68de 51.39±2.74bcd
A2 51.17±2.33b 43.87±4.52bcde
A3 35.54±9.31b 32.29±3.01e
A4 - 46.18±5.40bcde
A5 75.58±3.97a 74.83±6.24a
A6 - 45.23±3.88bcde
A7 17.83±4.10e 36.92±6.67de
A8 32.65±11.63cd 54.86±2.74bc
A9 39.24±5.21e 39.24±5.21cde
A10 - 35.19±9.26e
A11 - 7.55±0.83f
A12 37.21±6.98cd 57.21±3.68b
注:“—”表示组分对菌丝生长有促进作用。
表3中各组分浓度为0.5mg/mL,由3可知,
A5-3组分的抑菌率与另外3个馏分差异显著,显著
高于其他组分,故对其进一步做抑菌活性成分分离,
获得活性化合物XY-01。
表3 二级柱层析分离各组分的抑菌活性
Table 3 Antifungal activity of components of the second separation
抑制率/%Inhibition rate
组分
Components
香蕉炭疽菌
C.musae
芒果炭疽菌
C.gloeosporioides
A5-1 40.92±0.73a 36.13±0.79a
A5-2 34.85±1.36b 31.49±2.12b
A5-3 93.97±1.14c 86.76±0.84b
A5-4 32.22±1.66c 24.75±2.32c
2.2 抑菌活性化合物的毒力测定
进一步测定活性化合物XY-01对菌丝生长的
抑制情况,化合物浓度依次为200,100,50,25,12.5
μg/mL,结果见表4。
表4 XY-01抑制菌丝生长的结果
Table 4 Result of inhibiting mycelial growth of koenidine
菌种
Species
回归方程
Regression
equation
相关系数
r
EC50/
(μg·mL-1)
95%置信限/
(μg·mL-1)
95%FL
香蕉
炭疽菌
Y=2.7461+1.4684x 0.9791 34.28 26.77~43.89
芒果
炭疽菌
Y=2.8884+1.2708x 0.9823 45.88 37.11~56.73
由表4可知化合物XY-01对香蕉炭疽病菌和
芒果炭疽病菌均有较好的抑制作用,对香蕉炭疽病
菌的EC50值为34.28μg/mL,对芒果炭疽病菌的
EC50值为45.88μg/mL,对香蕉炭疽病菌的抑制效
果高于芒果炭疽病菌。
2.3 化学结构分析
化合物XY-01为淡黄色晶体(氯仿);ESI-MS m/
z 324.2 [M+H]+,分子式 C20H21NO3;1 H NMR
(CDCl3,400MHz)δ:7.72(1H,s,H-5),7.55(1H,s,
H-4),7.38(1H,s,N-H),6.90(1H,s,H-8),6.59(1H,
d,J=9.7Hz,H-3′),5.68(1H,d,J=9.7Hz,H-
4′),3.97(3H,d,J=17.3Hz,6-OCH3),3.93(3H,s,
7-OCH3),2.32(3H,s,3-CH3),1.48(6H,s,2′-
CH3);13 C NMR(CDCl3,101 MHz)δ:148.7(C-7),
148.2(C-2),144.5(C-6),134.6(C-9),134.1(C-3),
129.5(C-3′),120.2(C-4′),118.4(C-10),117.3(C-
12),116.1(C-4),104.6(C-1),102.3(C-5),94.8(C-
8),75.7(C-2′),56.6(6-OCH3),56.3(7-OCH3),29.7
(3-CH3),27.6和16.1(2×2′-CH3)。以上数据与文
献[14]报道基本一致,故鉴定化合物XY-01为九里香
甲碱(koenidine),结构式见图1。
图1 九里香甲碱的分子结构
Fig.1 Molecular structure of Koenidine
3 讨论与结论
本试验采用抑菌活性追踪法,研究了小叶九里
香枝干的农用抑菌活性成分,从中分离鉴定出九里
香甲碱是其主要抑菌活性成分,对香蕉炭疽病菌和
芒果炭疽病菌均有较好的抑制效果,EC50值分别为
82
第5期 马浩伟等:小叶九里香枝干抑菌活性成分的研究
34.28和45.88μg/mL。经查阅国内外文献未发现
九里香甲碱从小叶九里香中分离得到的,国内外学
者对九里香甲碱生物活性方面的研究主要集中在医
用活性[14-15],对于农用活性方面的研究报道较少。
本次研究发现,九里香甲碱抑菌活性较好,结构较简
单,具有开发为新型植物源杀菌剂的潜在价值。
在天然产物研究中,提取分离化合物的含量普
遍偏少。本研究中用于抑菌活性测定的九里香甲碱
含有少许的杂质,造成对香蕉炭疽菌和芒果炭疽菌
的EC50值轻微的偏高,实际九里香甲碱的活性要好
于试验所测得的数值。在活性追踪过程中,除石油
醚相具有相对高的活性外,其它相,如氯仿相、乙酸
乙酯相、水相都有一定的抑菌活性,均在一个数量级
的水平,有可能含有同系列的化合物,只是活性稍
差、或含量低,所以有必要对小叶九里香做进一步深
入的研究,发现更多活性较高的化合物、或者对分离
到系列化合物进行构效关系研究,得到更有应用开
发价值的化合物或先导化合物。
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(编辑:李 川)
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