全 文 ：2013 年 7 月 第 15 卷 第 7 期 中国现代中药 Modern Chinese Medicine Jul. 2013 Vol. 15 No. 7
中药农业
△ ［基金项目］ 国家自然科学基金(81130070，81072989) ，国家中医药管理局行业科研专项(201107009) ，国家科技重大专
项(2009ZX09502-026，2009ZX09301-005) ;中国中医科学院课题 ZZ20090302;中国南非合作项目
(2009DFA31660)
* ［通讯作者］ 郭兰萍，Tel: (010)64011944，E-mail:glp01@ 126. com
欧洲花楸细胞悬浮培养生长动力学研究
△
肖文娟，杨光，郭兰萍* ，郝庆秀，林淑芳
(中国中医科学院 中药研究所，北京 100700)
［摘要］ 目的:探讨欧洲花楸悬浮细胞生长规律和动力学参数。方法:测定欧洲花楸悬浮细胞生物量及细胞
悬浮液 pH值变化;利用细胞鲜重和干重值对欧洲花楸悬浮细胞生长曲线进行拟合，用数学建模模拟欧洲花楸悬浮
细胞增殖情况，并对拟合函数求一阶、二阶导数，求算欧洲花楸悬浮细胞生长速率及生长加速度。结果:欧洲花楸
悬浮细胞液的 pH值随培养时间增加而越来越大，培养时间到 16 d，pH ＞ 6，不再适宜细胞生长;Logistic模型能够
描述欧洲花楸悬浮细胞生长曲线变化。培养第 5d时细胞增长加速度达到最大，在 8 d时生长速率达到最大，结论:
欧洲花楸悬浮细胞生长函数符合 logistic曲线，函数为 f(x)= 0. 369 9 /(1 + 10. 77e － 0. 329 2x) ，细胞在 14 d时进入增长
平台期，在细胞生长至第 5 d时可进行诱导子处理。
［关键词］ 欧洲花楸;悬浮细胞;数学建模;Logistic函数模型;细胞悬浮液 pH值
欧洲花楸(Sorbus aucuparia L. )为蔷薇科花楸
属落叶乔木或小乔木，原产欧洲和亚洲西部温带高
山区域［1］。含有多酚、花青素、黄酮类等活性成
分［2］。其果实、枝叶及茎皮皆可入药。果实收敛、
利尿，叶子通便祛瘀［3-5］，是治疗肾病、痛风、风
湿、感冒和净化血液的良药［6］。作为植物药，欧洲
花楸需要生长一定时间后方可入药，且植株中的药
用成分含量低、产量及质量不稳定。用植物细胞培
养技术来生产药用次生代谢产物，是目前生物技术
重要的研究发展领域。本文以欧洲花楸悬浮细胞为
材料，研究其生长特性及次生代谢产物的积累情况，
并对细胞生长动力学做了初步研究，为利用该细胞
进行实验优化控制和规模生产次生代谢产物提供
参考。
1 材料
欧洲花楸悬浮细胞系由中国科学院植物研究所
叶和春研究员赠送。
2 仪器与试剂
仪器:培养箱(Conviron Adaptis CMP6010) ;摇
床(TCYQ超大型摇床) ;电子天平(Sartorius BS
2202S) ;超净工作台(SW-CJ-2FD 型双人单面净化
工作台) ;分析型酸度计(JENWAY 3510) ;旋转蒸
发仪(BUCHI Ｒotavapor Ｒ-200) ;高效液相色谱仪
(Waters 2695_ 2996) ;其它常规设备。
试剂:甲醇(色谱纯，Fisher Chemical 生产) ;
乙酸乙酯、甲醇、甲酸等(均为分析纯，国药集团
化学试剂有限公司生产)。
3 实验方法
3. 1 愈伤组织的培养
诱导出的愈伤组织接种于含 50 mL MS固体培养
基的 400 mL广口瓶中，置于 25 ℃培养箱中避光培
养，每 14 d继代 1 次。
3. 2 细胞悬浮培养体系的建立
愈伤组织经过 3 ～ 5 次继代后，将生长旺盛、结
构疏松、易于分散的组织转入液体培养基中，置于
摇床上进行悬浮培养，摇床转速设定为 120 rmp，培
养温度为 25 ℃，避光培养，得到含单细胞或小细胞
团的培养物继代，继代接种量为 1. 4 g，于 20 mL的
MS液体培养基中培养。
3. 3 细胞悬浮液 pH值测定
采用分析型酸度计直接测定。
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DOI:10.13313/j.issn.1673-4890.2013.07.010
2013 年 7 月 第 15 卷 第 7 期 中国现代中药 Modern Chinese Medicine Jul. 2013 Vol. 15 No. 7
3. 4 细胞增值测定
将培养的悬浮细胞用蒸馏水冲洗 3 遍，真空抽
滤至不滴水，直接称量细胞鲜重，用鲜重(FCW)
表示，每个处理重复 4 次，结果为 4 次的平均值。
将收获后的细胞在 80 ℃烘箱中干燥过夜，至恒重，
称量得到细胞干重，用(DCW)表示。取样时间间
隔为 1 d。
3. 5 细胞生长曲线建模方法
根据欧洲花楸悬浮细胞生长曲线，构建
Logistic、Gompertz和 Gauss模型，利用 Ｒ2 值确定最
佳拟合模型，并利用 matlab2010b 软件，由筛选得
到生长曲线函数中求得细胞最大增长速度及加速度
参数，
3. 6 细胞中次生代谢产物提取和检测方法
将收获的细胞用 15 mL 甲醇在研钵中研碎，过
滤到鸡心瓶中，过滤后的细胞残渣再用 10 mL 甲醇
提取一次，合并滤液，置于旋转蒸发仪上浓缩至干。
培养基用 15 mL乙酸乙酯萃取两次，用分液漏斗将
乙酸乙酯层转移至鸡心瓶中，于旋转蒸发仪上浓缩
至干，后用 500 μL 的甲醇溶解，0. 45 μm 滤膜过
滤，用于 HPLC检测。
HPLC 测定条件为:4. 6 × 150 mmC18(5 μm)
reverse column;流动相为水(0. 1% 甲酸) :甲醇
(50∶50)流速 0. 7 mL·min －1;全波长紫外检测。
4 结果
4. 1 欧洲花楸悬浮细胞液 pH值变化
在正常培养条件下，欧洲花楸细胞悬浮液的 pH
值随着培养时间的延长而增大。细胞培养基初始 pH
值为 4. 14，在细胞继代培养 1 d后，pH值就升高至
4. 35。在 1 ～ 15 d 时，细胞悬浮液的 pH 值缓慢升
高;当生长时间 ＜ 17 d 时，细胞悬浮液的 pH 值
＜ 6;当生长时间 ＞ 17 d 时，细胞悬浮液的 pH 值
＞ 6(见图 1、表 1)。
4. 2 欧洲花楸悬浮细胞生长曲线
欧洲花楸悬浮细胞鲜重和干重的生长曲线均为
S型，1 ～ 5 d 内细胞生物量增加较慢;在 5 ～ 14 d
时，细胞鲜重快速增加;在 14 d 之后，细胞鲜重量
下降;在 17 ～ 20 d时，细胞鲜重渐趋稳定，此时细
图 1 欧洲花楸悬浮细胞液 pH值变化曲线
胞进入生长稳定期。在14 d时，细胞鲜重量达到最大
值，为 5. 29 g /瓶，是初始接种量的 8. 8 倍(见表 1、
图 2 及图 3)。以上实验结果表明，欧洲花楸悬浮细
胞的动力学特性表现:继代后 0 ～ 5 d 是细胞的延滞
生长期，5 ～ 14 d是细胞的指数生长期，14 ～ 20 d细
胞处于稳定生长期。在 14 d 时细胞的鲜重达到最大
值，即细胞在 14 d之前生长所需的营养物质及生长
空间是充足的，细胞增量不受环境因子限制。
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表 1 欧洲花楸悬浮细胞生长 20d的生物量
及细胞悬浮液的 pH值(n = 4)
取样时间 /d FCW/g DCW/g pH值
1 0. 65 0. 07 4. 35
2 0. 7 0. 07 4. 49
3 0. 82 0. 08 4. 75
4 0. 9 0. 09 4. 92
5 1. 21 0. 12 4. 96
6 1. 66 0. 14 5. 13
7 1. 65 0. 16 5. 11
8 2. 56 0. 20 5. 17
9 2. 45 0. 24 5. 11
10 3. 02 0. 28 5. 29
11 4. 13 0. 31 5. 33
12 4. 33 0. 31 5. 41
13 4. 49 0. 30 5. 52
14 5. 29 0. 33 5. 54
15 5. 06 0. 35 5. 45
16 5. 09 0. 40 5. 86
17 4. 46 0. 33 5. 86
18 4. 6 0. 36 6. 18
19 4. 71 0. 36 6. 38
20 4. 83 0. 36 6. 45
4 建模与分析
采用结构模型来描述植物细胞的生长与次生代
谢产物的代谢，通过测定与分析细胞内组分的变化，
能够更深入地研究植物细胞培养的内在规律。根据
模型的描述，针对细胞所处的培养不同阶段，采取
不同的优化培养策略，从而分别满足细胞生长和产
物代谢的需要，实现对整个培养体系的优化操作。
对于 S型细胞的生长曲线，人们通常用 Logistic模型
来描述。但是 Logistic模型只能描述环境条件变化对
生物种群实际增长率的影响。故本实验选择了
Logistic、Gompertz 和 Gaussian 三种模型进行拟合，
通过比较其 Ｒ2 值，确定最适拟合欧洲花楸悬浮细胞
生长曲线的函数模型，探讨其生长规律，为进行实
验优化控制提供依据。
4. 1 生长曲线函数模型
从细胞鲜重及干重的拟合结果中可知，欧洲花
楸悬浮细胞生物量的增长符合 Logistic模型，细胞干
重拟合的函数拟合度最高(见表 2) ，欧洲花楸悬浮
细胞 的 生 长 函 数 为: f (x) = 0. 369 9 /(1 +
10. 77e － 0. 329 2x) ，拟合曲线的 Ｒ2 = 0. 969，对该函数
作图(见图 4)。可知，Logistic 模型能够很好地反映
欧洲花楸悬浮细胞生长的各个阶段:1 ～ 5 d 为细胞
延滞生长期，5 ～ 14 d 为细胞指数生长期，在 17 天
时已基本到达函数的平台期，17 d 之后细胞处于稳
定生长期。
表 2 模拟欧洲花楸悬浮细胞生长函数参数值
类型 模型
参数值
a b c SSE Ｒ-square ＲMSE
FCW
模拟
Gompertz模型
f(x)= ae － e(b － cx)
5. 331 1. 533 0. 233 13. 56 0. 940 9 0. 419 7
Logistic模型
f(x)= b /(1 + ae － kx)
23. 34 5. 044 0. 388 7 9. 612 0. 958 1 0. 353 3
Gaussian模型
f(x)= ae －［(x － b)/ c］2
5. 084 16. 32 9. 604 7. 772 0. 966 1 0. 353 3
DCW
模拟
Gompertz模型
f(x)= ae － e(b － cx)
0. 394 6 1. 119 0. 199 9 7. 772 0. 959 2 0. 023 12
Logistic模型
f(x)= b /(1 + ae － kx)
10. 77 0. 369 9 0. 329 2 0. 031 24 0. 969 0. 020 14
Gaussian模型
f(x)= ae －［(x － b)/ c］2
0. 365 8 16. 9 11. 46 0. 033 24 0. 967 0. 020 78
4. 2 细胞增长模型求解关键点
将拟合方程的参数代入 f(x)= b /(1 + ae － kx)
中，得到下式:
f(x)= 0. 369 9 /(1 + 10. 77e － 0. 329 2x)
因为 Logistic函数表达的是细胞增长的累积量，
为了研究欧洲花楸悬浮细胞增长函数，须对模拟的
Logistic函数进行求导。
利用 matlab2010b软件，调用 diff函数对 f(x)
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图 4 拟合生长曲线的 Logistic函数图像
进行求一阶导数，得到函数 f(x)= 5 720 058 669 /
［125 000 000e0. 388 7x(1 167 /(50e3 887x + 1)2］
对该函数进行作图(见图 5)。从图中可以看到，
欧洲花楸悬浮细胞增长表现出先增加，后降低的趋
势，表明在欧洲花楸悬浮细胞培养前期，细胞增长
不受环境约束，细胞增长达到峰值后，环境抑制开
始大于细胞增长动力。
对上述函数求极值，当 f(x)= 0 时，得到 x =
－［10 000 lg(50 /1 167) ］/3 887 求解后的值极为最
大增长速率，细胞生长速率变化趋势是先增大后减
小，在第 8 天时细胞增长速率最大。
为了研究欧洲花楸悬浮细胞增长加速度和细胞
增长关键点，对模拟 Logistic函数求二阶导数并作图
(见图 6)。可知，细胞增长加速度呈现出先增加后
减小的变化趋势，在第 5 天时细胞增长加速度达到
最大值。
图 5 Logistic函数一阶导数的函数图形(细胞增长速率)
5 细胞中次生代谢产物检测
在正常培养条件下，对培养了 1 d、3 d、10 d，
20 d，30 d，35 d 的欧洲花楸悬浮细胞次生代谢产
物进行 HPLC检测，结果表明在细胞内均未检测到
次生代谢产物。这与其他的药用植物不同，例如黄
芩［7］、人参［8］、丹参［9］、紫草［10］、南方红豆杉［11］
图 6 Logistic函数二阶导数的函数图形(细胞增长加速度)
等药用植物细胞系在正常培养条件下就可合成次生
代谢产物。
6 讨论
细胞材料相比于植株材料，有生长快、容易培
养、影响条件易于控制等优点。在植物细胞培养生
产次生代谢产物过程中，细胞生长规律、次生代谢
产物合成和积累规律，对于植物细胞培养的进一步
放大，提高次生代谢产物产率等方面具有重要意义。
细胞悬浮液 pH 值变化反映了培养基成分改变和细
胞膜透性及酶活性改变。由欧洲花楸悬浮细胞生长
曲线可知，细胞悬浮液的 pH 随着培养时间增加而
逐渐增大，在继代 0 ～ 14 d，细胞悬浮液 pH 值 ＜
6. 0，17 d之后，pH 值 ＞ 6，培养基已不适合细胞
生长。
了解细胞在常规培养条件下的动力学特性，是
研究利用该细胞的首要条件。常规培养条件下欧洲
花楸悬浮细胞的鲜重、干重生长曲线变化，是模拟
欧洲花楸悬浮细胞生长函数的基础。欧洲花楸悬浮
细胞培养的动力学特性表现为，在继代后的 0 ～ 5 d，
是细胞延滞生长期;在 5 ～ 14 d 时，是细胞指数生
长期;在 14 ～ 20 d 时，细胞处于稳定生长期。在
14 d时，细胞鲜重达到最大值，第 5 d 时细胞增长
加速度达到最大，在 8 d 时生长速率达到最大，在
细胞生长至第 5 d可进行诱导子处理。
次生代谢产物的产生是植物在长期进化过程中
与环境相互作用的结果，这些次生代谢物的合成与
植物体状态和环境条件有密切联系。不同类型的次
生代谢产物，其生物合成途径也不相同。蔷薇科苹
果亚科的次生代谢产物是联苯类和二苯呋喃类物质，
在植株的边材部分合成，作为化学防御措施以抵御
各种胁迫。有报道，当欧洲花楸的叶子受到真菌感
染时，植物组织合成了抗真菌类病害的植保素［12］。
欧洲花楸为抵抗生物和非生物胁迫在叶子中合成联
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苯欧洲花楸素［13］。也有资料表明，在用酵母提取物
处理后，欧洲花楸悬浮细胞会很快合成并积累
aucuparin［14］。而在本实验培养和检测条件下，对培
养 1 d、3 d、10 d、20 d、30 d、35 d的欧洲花楸悬浮
细胞进行次生代谢产物检测，均未检测到联苯类物
质。在使用其他特定环境因子诱导下，欧洲花楸悬浮
细胞是否合成联苯类次生代谢产物，还需要深入
研究。
致谢:感谢北京市中药学重点学科资助。
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Study on the Gowth Kinetics of Sorbus Sucuparia L. in Suspension Cultured Cells
XIAO Wen-juan，YANG Guang，GUO Lan-ping，HAO Qing-xiu，LIN Shu-fang
(Institute of Chinese Materia Medica，Academy of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100700，China)
［Abstract］ Objective:We want to make a model of the Cell Suspension Culture of Sorbus aucuparia L. and
obtain the Kinetics parameters. Methods:The growth cycle of 20 d and the pH value of cells suspension liquid of
Sorbus aucuparia was measured under normal culture conditions. The growth curve of suspension cultured cells of
Sorbus aucuparia was fit by using the fresh weight and dry weight of cells. The growth cycle of suspension cultured cells
of Sorbus aucuparia was determined by Logistic function model. Ｒesults:The pH of cell suspension increased
overtimeobviously during 0 ～ 14 d. When the pH of suspension cultured cells is over 6，this is not suitable for the
growth of cells. The Logistic function model can fit the change of the growth curve of suspension cultured cells of
Sorbus aucuparia. The best growth rate and growth acceleration of suspension cultured cells of Sorbus aucuparia is 5 d
and 8 d respectively. Conclusion:The function of growth characteristics of suspension cultured cells of Sorbus
aucuparia is f(x)= 0. 369 9 /(1 + 10. 77e － 0. 329 2x). Sorbus aucuparia L. cells growth plateau occurson the 14 th day，
and reach the fastest speed on the 8th day. Elicitors could be used on the fifth day.
［Key words］ Suspension cultured cells of Sorbus aucuparia L. ;Mathematical model;Logistic function model;
pH of cell suspension liquid
( 收稿日期 2012-12-18)
·375·